CN108611387B - 一种利用植物蛋白胨生产医药级透明质酸钠的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用植物蛋白胨生产医药级透明质酸钠的方法，涉及生物发酵技术领域，其特征在于，包括a）采用植物蛋白为原料制备发酵培养基，b）利用制得的发酵培养基采用微生物发酵法制备透明质酸钠，所述发酵培养基的制备包括溶解、酶解、灭酶、过滤、碳吸、脱碳、发酵灭菌等步骤；首创性地采用植物蛋白自制蛋白胨，用于医药级透明质酸的发酵生产，解决了现有采用牛骨胨发酵制备透明质酸钠所存在携带疯牛病毒的风险，安全性高，且原料来源易得，极大幅度的降低了原料成本，提高了发酵产率。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种利用植物蛋白胨生产医药级透明质酸钠的方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid,Hyaluronan,简称HA)，又名玻璃酸，它是由乙酰氨基脱氧葡萄糖与葡萄糖醛酸双糖重复单位所组成的直链粘多糖，在食品、化妆品及药品领域均有广泛的应用。在食品领域，作为保健食品原料，用于增加骨密度或者改善皮肤水份；在化妆品领域，作为保湿因子用于护肤品中，如面膜、精华液、膏霜、乳液；在整形美容领域，作为填充剂用于祛除面部皱纹、隆鼻、丰唇等；在医药领域，用于眼科手术粘弹剂、抗粘连剂、滴眼液及药物载体等。
微生物发酵法是目前生产HA的主要方法之一，其主要利用酵母粉、蛋白胨为氮源，葡萄糖为碳源进行微生物发酵生产。目前大部分透明质酸钠生产厂家均是以动物蛋白胨作为氮源物质与酵母粉配合发酵，而动物蛋白胨一般采用动物骨头为原料进行生产，其中主要是牛骨，它是将动物骨加酶在一定温度下酶解再经浓缩、过滤制得蛋白胨粉。截止到目前并未出台蛋白胨相关的国家标准、行业标准及地方性标准等，大部分蛋白胨生产厂家都是小型作坊，对原料的控制及产品质量检测等方面并不完善，原料中存在疯牛病的风险，并且内毒素含量较高，不符合西方国家洁食要求。另外动物蛋白胨的成分较复杂，不同批次的产品对发酵质量有较大影响，这要求我们实际发酵生产中要先对蛋白胨进行筛选，以减小蛋白胨对发酵生产工艺的不利影响。而且动物蛋白胨来源受限，存在较大的地域差异性，作为一种发酵原料，不确定性较大且价格昂贵。
透明质酸钠在医药领域叫作玻璃酸钠，国家药品标准中要求控制产品内毒素含量，在生产过程中要控制引入内毒素的各种因素，比如原辅料、水及设备等。在发酵原料中，蛋白胨、酵母粉等氮源营养丰富，易滋生细菌，内毒素含量较高，生产过程中，在去除内毒素时，会增加后续工序的压力，成为成品内毒素超标的隐患。
发明内容
针对目前动物蛋白胨存在携带各种病毒、原料来源较少、价格较高、质量不稳定、内毒素含量超标等问题，本发明提供一种利用植物蛋白胨生产医药级透明质酸钠的方法，首创性地采用植物蛋白自制蛋白胨，用于医药级透明质酸的发酵生产，采用碱性蛋白酶将植物蛋白降解，成为利于菌体吸收利用的蛋白质，然后连同其它发酵培养基成份一起去除内毒素，达到医药级透明质酸的生产要求。本发明原料来源易得，极大的降低了原料成本，避免了动物蛋白携带各种病毒的风险；原料经处理，内毒素含量较低；该植物蛋白胨富含各种氨基酸、维生素和微量元素，发酵产率较高。
本发明解决上述技术问题的方案如下：一种利用植物蛋白胨生产医药级透明质酸钠的方法，其特征在于，包括a)采用植物蛋白为原料制备发酵培养基，b)利用制得的发酵培养基采用微生物发酵法制备透明质酸钠，所述发酵培养基的制备包括如下步骤：
（1）溶解：取植物蛋白在高温下溶解于水中；
在溶解罐中加入水，在70℃-90℃下将植物蛋白开始向水中投料，投料温度优选70℃-80℃；投料后将温度升至90℃-100℃进行溶解，溶解时间0h-1h，溶解时间优选0min-20min；
所述植物蛋白采用大豆蛋白、玉米蛋白或小麦面筋粉中的一种或两种以上的组合物，这类蛋白富含各种氨基酸、维生素，能够促进透明质酸生产菌的生长及透明质酸钠的合成；
（2）酶解：物料溶解后，降温至酶解温度，调节物料pH，加入蛋白酶进行酶解；
所述蛋白酶选用碱性蛋白酶，蛋白酶可以为动物源、植物源或微生物源，优选植物源或微生物源；蛋白酶的质量占总体系的0.1‰-5‰，优选0.5‰-2‰；
所述酶解温度40℃-60℃，优选45℃-50℃；酶解pH7.0-10.0，优选8.0-9.0；酶解时间1h-10h，优选4h-6h；
（3）灭酶：调节pH终止酶解，物料升温后灭酶；
灭酶操作前调节物料pH至5.0-6.0，灭酶温度为90℃-100℃，灭酶时间1min-10min；
（4）过滤：采用第一过滤机过滤除去杂质；
第一过滤机采用为板框过滤机或密闭过滤器，助滤剂为珍珠岩或硅藻土，助滤剂添加重占总体系的量为0.5%-5%；
（5）碳吸：在过滤后的植物蛋白胨液体中，分别投入物料酵母粉、磷酸氢二钾、硫酸镁、氨基酸进行溶解，溶解完全后加入活性炭，调节物料pH控制恒定温度进行吸附，去除物料中的内毒素；
所用活性炭的重量占总体系的0.5‰-5‰，优选1‰-3‰，物料pH5.0-6.0，吸附温度40℃-80℃，优选50℃-70℃，吸附时间为0.5h-2h；
（6）脱碳：采用第二过滤机进行脱碳处理；
所述第二过滤机采用精密过滤机，首先采用孔径为2微米-10微米的滤板进行第一次过滤，助滤剂采用硅藻土；然后采用孔径为0.2微米-1微米滤板进行第二次过滤，第二次过滤无需添加助滤剂；
（7）发酵灭菌：将脱碳后的物料转入发酵罐进行灭菌，制得透明质酸钠发酵生产用培养基；
灭菌温度119℃-125℃，灭菌时间20min-30min。
然后，利用制得的发酵培养基，依次经过发酵培养、发酵液分离纯化、滤液精制提纯、干燥制备得到医药级透明质酸钠。
发酵培养操作如下：
（1）种子培养基制备：每1L种子培养基包含成分如下：葡萄糖10g，酵母粉12g，K2HPO42g，MgSO41g；灭菌温度为121℃-123℃，灭菌时间为20min-30min；种子培养条件为温度35℃-38℃，用30%的NaOH控制pH6.0-8.0，通风发酵8h-12h；
（2）转糖转种发酵：转种量为10%-15%，优选15%，发酵温度35℃-38℃，通过分批补料的方式进行发酵，采用30%的NaOH溶液控制pH6.0-8.0，通风发酵14h-30h，发酵培养结束将发酵液转至沉淀罐进行粗沉除杂。
发酵液分离纯化操作如下：
（1）发酵液粗沉：粗沉酒精度控制在50%-70%，将沉淀料液转至溶解罐溶解；
（2）粗沉物料溶解：根据生产产品规格控制溶解温度45℃-60℃，溶解完成加入氢氧化钠进行碱降解；
（3）降解：控制降解pH在9.0-11.5，降解结束后进入板框过滤机进行过滤；
（4）过滤：向降解液中加入助滤剂，助滤剂选用珍珠岩或硅藻土，料中加助滤剂占总体积的0.5%-2%；
滤液精制提纯操作如下：
（1）沉淀：向滤液中加入酒精搅拌沉淀，沉淀酒精度为45%-60%；
（2）脱水：将沉淀料液进行3-5次酒精脱水，酒精度逐级提高至85%-93%；
（3）离心：采用离心机将调好pH的脱水料液进行离心，得离心料；
干燥操作如下：
采用真空干燥机，将上述离心料进行真空干燥处理，干燥温度控制在45℃-75℃，待物料水份＜10%时，干燥结束，将干燥的透明质酸钠存放好检测待用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首创性地采用大豆蛋白、玉米蛋白、小麦面筋粉等原料制备植物蛋白胨作为氮源来生产透明质酸钠，安全性高，避免了动物蛋白胨所带来的病菌风险；所用植物蛋白原料富含多种氨基酸及维生素，更能够满足透明质酸生产菌对微量元素的要求，无需另外添加，发酵液粘度及透明质酸钠含量均有显著提高，发酵产率达到12g/L以上，远高于市面上以动物蛋白胨为原料的发酵产率；制得的透明质酸钠所含蛋白质含量大幅降低，核酸含量小，产品纯度大大提高；植物蛋白原料售价较低，生产成本远低于动物蛋白胨，对降低生产成本有很大作用；通过本发明制得的植物蛋白胨，连同其它发酵原料一同采用活性炭吸附去除内毒素，保证了原料中内毒素处于较低的水平，满足医药级产品的要求。
具体实施方式
实施例1
本实施例利用植物蛋白胨生产医药级透明质酸钠的方法，包括a）采用植物蛋白为原料制备发酵培养基，b）利用制得的发酵培养基采用微生物发酵法制备透明质酸钠，
1.发酵培养基的制备包括如下步骤：
（1）物料溶解 在溶解罐中加入800L水，开搅拌，开蒸汽阀门待温度升至75℃关闭蒸汽阀门，将125kg玉米蛋白投入溶解罐，然后开蒸汽阀门物料温度维持在95℃下溶解10min；
（2）酶解 溶解结束，开冷水温度降至50℃，用碱调节物料pH至8.5，然后加入0.8kg蛋白酶进行酶解5h，酶解过程中持续加碱保持pH在8.5左右；
（3）灭酶 酶解结束，加盐酸将物料pH调节至5.5，开蒸汽阀门将温度升至95℃对酶进行灭活，维持时间为5min；
（4）过滤 灭酶后的料液加入10kg硅藻土，经过板框过滤机过滤得到植物蛋白液750L，并送检氮含量检测，经检测植物蛋白液氮含量为2.64%；
其中，含氮量测定是依据GB 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》中第一法 凯氏定氮法的原理测定；
（5）碳吸 根据工艺对每批发酵液需要9.9kg总氮量的要求，取375L植物蛋白液中投入20kg酵母粉，6kg磷酸氢二钾，5kg硫酸镁，12kg氨基酸等发酵原料搅拌均匀，然后加入375g活性炭，在pH5.5温度为60℃条件下进行吸附1h去除物料中内毒素；
其中含氮总量为：375L*2.64%*1kg/L=9.9kg；
（6）脱碳 向吸附好的滤液中加入8kg硅藻土，先用5微米滤板进行精密过滤机脱碳处理，然后用0.3微米过滤板进行二次过滤，二次过滤不再添加助滤剂；
（7）发酵灭菌 上述料液经脱碳过滤后转入发酵罐进行发酵灭菌，119℃下灭菌30min。
2.发酵培养
（1）种子培养基制备 每1L种子培养基包含成分如下：葡萄糖10g，酵母粉12g，K2HPO42g，MgSO41g。灭菌温度为121℃，灭菌时间为25min；种子培养条件为温度35℃，用30%的NaOH控制pH6.0-8.0，通风发酵10h。
（2）发酵过程 转种量为15%，温度37℃，通过分批补料的方式进行发酵，用30%的NaOH控制pH6.0-8.0，经过20.5h发酵培养，最终发酵粘度达到65000mPa·s；
其中，发酵粘度的检测方法依据《药典2015版第四部 通则0633粘度测定法 第三部分 旋转粘度计测定法》检测；
3.发酵液分离纯化
（1）发酵液粗沉 控制酒精度为65%，沉淀时间为3h；
（2）粗沉物料溶解 溶解温度52℃，溶解完后加入氢氧化钠进行降解；
（3）降解 控制降解pH在11，降解时间为8h；
（4）过滤 向降解液中加入150kg珍珠岩进行过滤得滤液。
4.滤液精制提纯
（1）沉淀 滤液沉淀，沉淀酒精度为52.3%；
（2）脱水 沉淀料液经过三次脱水最终酒精度至92.6%；
（3）调PH 加酸或碱调节料液pH至6.0-8.0；
（4）离心 将调好pH的料液经过离心机离心，离心用时2.0h。
5.干燥：采用真空干燥机，干燥温度控制在75℃，干燥时间13.5h，得透明质酸钠。
实施例2
本实施例利用植物蛋白胨生产医药级透明质酸钠的方法，包括a）采用植物蛋白为原料制备发酵培养基，b）利用制得的发酵培养基采用微生物发酵法制备透明质酸钠，所述发酵培养基的制备包括如下步骤：
（1）物料溶解 在溶解罐中加入800L水，开搅拌，开蒸汽阀门待温度升至90℃关闭蒸汽阀门，将125kg大豆蛋白投入溶解罐，然后开蒸汽阀门物料温度维持在100℃下溶解30min；
（2）酶解 溶解结束，开冷水温度降至40℃，用碱调节物料pH至7，然后加入0.8kg蛋白酶进行酶解10h，酶解过程中持续加碱保持pH在7左右；
（3）灭酶 酶解结束，加盐酸将物料pH调节至5.0，开蒸汽阀门将温度升至95℃对酶进行灭活，维持时间为5min；
（4）过滤 灭酶后的料液加入10kg硅藻土，经过板框过滤机过滤得到植物蛋白液760L，并送检氮含量检测，经检测植物蛋白液氮含量为1.56%；
（5）碳吸 取635L植物蛋白液中投入20kg酵母粉，6kg磷酸氢二钾，5kg硫酸镁，12kg氨基酸等发酵原料搅拌均匀，然后加入635g活性炭，在pH5.5温度为40℃条件下进行吸附1h去除物料中内毒素；
（6）脱碳 向吸附好的滤液中加入8kg硅藻土，先用2微米滤板进行精密过滤机脱碳处理，然后用0.2微米过滤板进行二次过滤，此次过滤不再添加助滤剂；
（7）发酵灭菌 上述料液经脱碳过滤后转入发酵罐进行发酵灭菌，122℃下灭菌25min。
发酵培养及后续提纯工艺同实施例1，所得发酵液粘度为68000mPa.s。
实施例3
本实施例利用植物蛋白胨生产医药级透明质酸钠的方法，包括a）采用植物蛋白为原料制备发酵培养基，b）利用制得的发酵培养基采用微生物发酵法制备透明质酸钠，所述发酵培养基的制备包括如下步骤：
（1）物料溶解 在溶解罐中加入800L水，开搅拌，开蒸汽阀门待温度升至85℃关闭蒸汽阀门，将125kg小麦面筋粉投入溶解罐，然后开蒸汽阀门物料温度维持在95℃下溶解1h；
（2）酶解 溶解结束，开冷水温度降至60℃，用碱调节物料pH至10，然后加入0.8kg蛋白酶进行酶解1h，酶解过程中持续加碱保持pH在10左右；
（3）灭酶 酶解结束，加盐酸将物料pH调节至5.5，开蒸汽阀门将温度升至95℃对酶进行灭活，维持时间为5min；
（4）过滤 灭酶后的料液加入10kg硅藻土，经过板框过滤机过滤得到植物蛋白液730L，并送检氮含量检测，经检测植物蛋白液氮含量为1.83%；
（5）碳吸 取541L植物蛋白液中投入20kg酵母粉，6kg磷酸氢二钾，5kg硫酸镁，12kg氨基酸等发酵原料搅拌均匀，然后加入541g活性炭，在pH5.5温度为80℃条件下进行吸附1h去除物料中内毒素；
（6）脱碳 向吸附好的滤液中加入8kg硅藻土，先用10微米滤板进行精密过滤机脱碳处理，然后用1微米过滤板进行二次过滤，此次过滤不再添加助滤剂；
（7）发酵灭菌 上述料液经脱碳过滤后转入发酵罐进行发酵灭菌，125℃下灭菌20min。
发酵培养及后续提纯工艺同实施例1，所得发酵液粘度为66500mPa·s。
实施例4
本实施例利用植物蛋白胨生产医药级透明质酸钠的方法，包括a）采用植物蛋白为原料制备发酵培养基，b）利用制得的发酵培养基采用微生物发酵法制备透明质酸钠，所述发酵培养基的制备包括如下步骤：
（1）物料溶解 在溶解罐中加入800L水，开搅拌，开蒸汽阀门待温度升至70℃关闭蒸汽阀门，将125kg玉米蛋白投入溶解罐，然后开蒸汽阀门物料温度维持在90℃下溶解5min；
（2）酶解 溶解结束，开冷水温度降至45℃，用碱调节物料pH至8.0，然后加入0.4kg蛋白酶进行酶解4h，酶解过程中持续加碱保持pH在8.0左右；
（3）灭酶 酶解结束，加盐酸将物料pH调节至5.0，开蒸汽阀门将温度升至90℃对酶进行灭活，维持时间为1min；
（4）过滤 灭酶后的料液加入4kg硅藻土，经过板框过滤机过滤得到植物蛋白液730L，并送检氮含量检测，经检测植物蛋白液氮含量为2.52%；
（5）碳吸 取393L植物蛋白液中投入20kg酵母粉，6kg磷酸氢二钾，5kg硫酸镁，12kg氨基酸等发酵原料搅拌均匀，然后加入786g活性炭，在pH5.0温度为50℃条件下进行吸附0.5h去除物料中内毒素；
（6）脱碳 向吸附好的滤液中加入4kg硅藻土，先用5微米滤板进行精密过滤机脱碳处理，然后用0.3微米过滤板进行二次过滤，此次过滤不再添加助滤剂；
（7）发酵灭菌 上述料液经脱碳过滤后转入发酵罐进行发酵灭菌，灭菌温度119℃-125℃，灭菌时间20min-30min。
发酵培养及后续提纯工艺同实施例1，所得发酵液粘度为63200mPa.s。
实施例5
本实施例利用植物蛋白胨生产医药级透明质酸钠的方法，包括a）采用植物蛋白为原料制备发酵培养基，b）利用制得的发酵培养基采用微生物发酵法制备透明质酸钠，所述发酵培养基的制备包括如下步骤：
（1）物料溶解 在溶解罐中加入800L水，开搅拌，开蒸汽阀门待温度升至80℃关闭蒸汽阀门，将125kg玉米蛋白投入溶解罐，然后开蒸汽阀门物料温度维持在100℃下溶解20min；
（2）酶解 溶解结束，开冷水温度降至50℃，用碱调节物料pH至9.0，然后加入1.6kg蛋白酶进行酶解6h，酶解过程中持续加碱保持pH在9.0左右；
（3）灭酶 酶解结束，加盐酸将物料pH调节至6.0，开蒸汽阀门将温度升至100℃对酶进行灭活，维持时间为10min；
（4）过滤 灭酶后的料液加入4kg硅藻土，经过板框过滤机过滤得到植物蛋白液750L，并送检氮含量检测，经检测植物蛋白液氮含量为2.28%；
（5）碳吸 取434L植物蛋白液中投入20kg酵母粉，6kg磷酸氢二钾，5kg硫酸镁，12kg氨基酸等发酵原料搅拌均匀，然后加入1.302kg活性炭，在pH6.0温度为70℃条件下进行吸附2h去除物料中内毒素；
（6）脱碳 向吸附好的滤液中加入40kg硅藻土，先用5微米滤板进行精密过滤机脱碳处理，然后用0.3微米过滤板进行二次过滤，此次过滤不再添加助滤剂；
（7）发酵灭菌 上述料液经脱碳过滤后转入发酵罐进行发酵灭菌，灭菌温度119℃-125℃，灭菌时间20min-30min。
发酵培养及后续提纯工艺同实施例1，所得发酵液粘度为62800mPa.s。
对比例1
取含氮量为14.1%的动物蛋白胨70kg（折合含氮总量为70kg*14.1%=9.9kg），20kg酵母粉，6kg磷酸氢二钾，5kg硫酸镁，12kg氨基酸等发酵培养基搅拌均匀，发酵灭菌、培养及后续提纯条件同实施例1，制得发酵液粘度为58600mPa.s；
本对比例所用动物蛋白胨具体为选自山东英朗生物科技有限公司牛骨蛋白胨，生产批号为20180331。
对比例2
取市面购置含氮量为13.1%的植物蛋白胨75.8kg（折合含氮总量为75.8kg*13.1%=9.9kg），20kg酵母粉，6kg磷酸氢二钾，5kg硫酸镁，12kg氨基酸等发酵培养基搅拌均匀，发酵灭菌、培养及后续提纯条件同实施例1，制得发酵液粘度为32400mPa.s；
本对比例所用植物蛋白胨具体为选自山东淄博启迪生物制品有限公司生产的大豆蛋白胨，生产批号为20170506。
分别测试上述实施例和对比例生产透明质酸钠粉末的透光率、吸光度、蛋白质含量、pH、醛酸含量、内毒素含量以及发酵液中透明质酸钠的发酵液含量，测试结果见表1。
其中，发酵液含量测定是依据国家发明专利《一种定量检测透明质酸发酵液中透明质酸含量的方法》所公开的内容以援引的方式引入使用；内毒素检测是依据药典三部（2015版）-通则-1143细菌内毒素检查法；醛酸含量、透光率、吸光度、蛋白质及pH的测定是依据QB/T 4416-2012《化妆品用原料 透明质酸钠》。
表1 实施例和对比例的测试结果
通过表1数据可知，对比实施例和对比例，相对于现有技术采用动物蛋白胨和市面购买的普通植物蛋白胨，采用本发明生产方法制得的植物蛋白胨进行发酵制备的透明质酸钠，发酵液粘度及透明质酸钠含量均有显著提高；制得的透明质酸钠所含蛋白质含量大幅降低，核酸含量小，产品纯度大大提高；通过发酵前用活性炭对培养基进行吸附，使得透明酸钠所含内毒素显著降低，符合医用注射级要求。综上所述，玉米蛋白、大豆蛋白及小麦面筋粉均是制备植物蛋白胨良好的植物蛋白源，发酵前对培养基进行活性炭吸附去除内毒素效果明显，生产产品符合医药级要求。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (1)
1.一种利用植物蛋白胨生产医药级透明质酸钠的方法，其特征在于，包括a）采用植物蛋白为原料制备发酵培养基，所述植物蛋白采用小麦面筋粉，b）利用制得的发酵培养基采用微生物发酵法制备透明质酸钠，所述发酵培养基的制备包括如下步骤：
（1）溶解：加入800L水，升温至85℃，加入125kg小麦面筋粉，物料温度维持在95℃下溶解1h；
（2）酶解：物料溶解后，降温至60℃，调节物料pH至10，加入0.8kg蛋白酶进行酶解1h，酶解过程中持续加碱保持pH为10；
（3）灭酶：加盐酸将物料pH调节至5.5，将温度升至95℃对酶进行灭活，维持时间为5min；
（4）过滤：加入10kg硅藻土，经过板框过滤机过滤；
（5）碳吸：取541L植物蛋白液中投入20kg酵母粉，6kg磷酸氢二钾，5kg硫酸镁，12kg氨基酸进行溶解，加入514g活性炭，调节物料pH为5.5，控制恒定吸附温度80℃进行吸附，吸附时间为1h，去除物料中的内毒素；
（6）脱碳：加入8kg硅藻土，先用10微米滤板进行精密过滤机脱碳处理，然后用1微米过滤板进行二次过滤；
（7）发酵灭菌：将脱碳后的物料转入发酵罐进行灭菌，灭菌温度125℃，灭菌时间20min，制得透明质酸钠发酵生产用培养基；
所述利用制得的发酵培养基采用微生物发酵法制备透明质酸钠，包括发酵培养、发酵液分离纯化、滤液精制提纯、干燥步骤；
所述发酵液分离提纯包括发酵液粗沉、粗沉物料溶解、降解、过滤步骤；
所述发酵液粗沉：酒精度为65%，沉淀时间为3h；所述粗沉物料溶解：溶解温度52℃，溶解完后加入氢氧化钠进行降解；所述降解：pH为11，降解时间为8h；
所述滤液精制提纯包括沉淀、脱水、调pH、离心步骤；
所述沉淀：沉淀酒精度为52.3%；所述脱水：经过三次脱水最终酒精度至92.6%；所述调pH：调节料液pH至6.0-8.0；所述离心：离心时间2.0h；
所述发酵培养包括种子培养基制备、种子培养、发酵过程步骤；
所述种子培养基制备：每1L种子培养基包含成分：葡萄糖10g，酵母粉12g，K2HPO42g，MgSO41g；灭菌温度为121℃，灭菌时间为25min；
所述种子培养：温度35℃，用30%的NaOH控制pH6.0-8.0，通风发酵10h；
所述发酵过程：转种量为15%，温度37℃，用30%的NaOH控制pH6.0-8.0，经过20.5h发酵培养。
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