CN105985994B - 一种无盐无有机溶剂纯化技术制备透明质酸钠的方法 - Google Patents
一种无盐无有机溶剂纯化技术制备透明质酸钠的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105985994B CN105985994B CN201510105074.6A CN201510105074A CN105985994B CN 105985994 B CN105985994 B CN 105985994B CN 201510105074 A CN201510105074 A CN 201510105074A CN 105985994 B CN105985994 B CN 105985994B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sodium hyaluronate
- hyaluronic acid
- salt
- free
- organic solvent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及到一种无盐无有机溶剂纯化技术制备透明质酸钠的方法。微生物发酵制备透明质酸钠发酵液，通过发酵液的快速升温处理和过滤、快速降温后加入活性炭吸附和过滤、超滤、无盐状态下低浓度除菌过滤、动态冷冻干燥工艺制备无菌透明质酸钠原料。本发明的优点是：通过纯化和动态冷冻干燥技术制备的透明质酸钠原料干粉的细菌内毒素可以达到0.05EU/mg，分子量可以达到200万道尔顿以上；同时采用快速升降温处理、无盐状态下低浓度除菌过滤和动态冷冻干燥技术可以减去传统工艺中大量的无机盐和有机溶剂的使用，一方面降低生产成本，减少高浓度无机盐对大规模生产的不锈钢设备的腐蚀；同时减少透明质酸钠植入人体后因有机溶剂带来的刺激性和过敏，提高透明质酸的生物安全性。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及一种无菌生物发酵法的透明质酸及其盐的制备、纯化、静态冷冻和动态真空干燥技术。
背景技术
透明质酸，又名玻璃酸是由葡萄糖醛酸和N－乙酰氨基葡萄糖以糖苷链交替连接而成的一种双糖重复单元组成的线性多糖。透明质酸多以透明质酸盐(如透明质酸钠)的形式存在于细菌和高等动物中的具有生物功能的天然生物聚合物，如革兰氏阳性的链球菌、动物组织包括皮肤、玻璃体、脐带、透明软骨和关节滑液等多种组织中，并在其中起到保湿、增强皮肤组织弹性、修复和预防损伤等生理作用。
透明质酸是细胞外基质的主要组分之一，广泛存在身体的许多组织中，因此，非常适用于靶向这些组织的生物医学应用，并且已经广泛研究并将透明质酸及其衍生物应用于生物医学领域，如二十世纪七八十年代已经批准用于眼科手术包括白内障眼科手术、青光眼手术、角膜移植术等，作为粘弹剂补充资料关节炎，作为组织隔离剂预防组织粘连，用于填充软组织缺陷如面部皱纹等。
目前国内外的透明质酸及其盐的纯化制备工艺，基本上采用过滤除去菌体等杂质后，再以高浓度盐条件下用大量的有机溶剂如乙醇、异丙醇、丙酮等进行多糖沉淀来提取透明质酸及其盐。有机溶剂的大量使用，一方面增加了设备的投入成本和有机溶剂本身的生产成本，高浓度无机盐对大规模生产的不锈钢设备的腐蚀给规模化生产带来一定的影响；同时透明质酸钠残留在有机溶剂中的无法全部回收，收率低；另一方面，有机溶剂在透明质酸钠中残留也会造成透明质酸钠植入人体后因有机溶剂产生一定的刺激性和过敏。
本发明的目的是提供一种采用低盐和无有机溶剂提纯制备透明质酸及其盐的生产方法，该方法具有生产成本低，质量高的特点。
发明内容：
本发明的目的是，提供一种制备透明质酸及其盐的方法，所述的透明质酸符合作为体内植入材料的标准要求。
同样，本发明的目的是，提供一种商业上可行的生产透明质酸及其盐的方法。
本发明提供的方法，是在合时的培养基中培养微生物进行发酵，随后将含有透明质酸的发酵液进行快速升温、过滤，再加入冷的注射用水进行快速冷却降温，然后再以活性炭吸附和过滤、超滤、无盐浓度下除菌过滤、浓缩、结晶和动态冷冻干燥制备透明质酸及其盐。
本发明提供的方法具有节约盐和有机溶剂的大量使用、提高收率的特点，同时可以减少高浓度无机盐对大规模生产的不锈钢设备的腐蚀，避免有机溶剂残留带来透明质酸及其盐植入体内后的刺激过敏反应等优点，具有很大的优越性。
本发明提供的方法中适用的微生物细菌可以是马疫链球菌、18型化脓性链球菌、兽疫链球菌；通常在32℃～38℃和pH6.5～7.5进行发酵6h～60h。在发酵过程中，对于不同的菌种的培养时间因不同的链球菌菌株而有相对较大的差异。
本发明提供了一种透明质酸及其盐的纯化方法，将含有透明质酸钠发酵液快速升温至50℃～90℃，维持5min～10min，使细菌荚膜和菌体分离、同时使培养基蛋白质变性，用烧结钛棒过滤器过滤；而避免传统的用有机溶剂沉淀发酵液中透明质酸的方法。在滤液中加入冷的注射用水将发酵液快速冷却至室温，加入活性炭吸附，聚醚砜滤芯进行精滤，有效的去除蛋白质、多肽、核酸等杂质以及细菌内毒素。然后对精滤液进行超滤，以达到进一步对滤液去除蛋白、无机盐、内毒素的目的，并且稀释滤液用于后续的除菌过滤。
本发明提供了一种有效的从透明质酸中去除蛋白质、多肽、核酸等杂质，本发明采用活性炭进行处理。为了提高效果，活性炭要通过高温干烤进行活化，活性炭要足量达到滤液体积的2％～3％，吸附次数2～3次，吸附时间在4h～8h。
本发明提供了一种通过超滤进一步纯化而去除蛋白、无机盐和细菌内毒素后得到的无盐的透明质酸超滤稀溶液。该方法中，是在透明质酸滤液中不断加入无热原的注射用水稀释透明质酸滤液，用截留分子量在5万～10万Da的超滤膜进行超滤，加入的注射用水的体积以使超滤后透明质酸超滤液的浓度在0.2g/L～0.5g/L，超滤液中的电导率达到100μs/cm以下。
本发明提供了一种无盐的透明质酸除菌过滤的方法。在该方法中，透明质酸或其盐浓度在0.2g/L～0.5g/L，滤芯材质采用聚醚砜，除菌过滤压力为0.12mPa～0.18mPa。
本发明提供了一种动态真空干燥技术进行透明质酸无菌原料的制备。
该方法中，首先将无菌过滤的透明质酸或其盐的稀溶液过滤到常温减压设备中进行常温、减压至真空度为-30kPa浓缩至透明质酸或其盐浓度为2g/L～5g/L。
在该方法中，通过加压将透明质酸或其盐浓缩液输入动态低温冷冻设备中，采用动态冷冻技术将设备夹套温度降至-5℃～5℃，边搅拌边抽真空制备无菌透明质酸或其盐浓缩液的冰晶。
在该方法中，对冰晶进行通过边搅拌边真空干燥的动态真空干燥技术制备透明质酸钠无菌原料干粉，搅拌速度为50rpm～200rpm、真空度为-30kPa、干燥时间36～72h、夹套升温至25℃～45℃。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
第一步：微生物发酵
马疫链球菌(CCTCC 94034)在植物源性培养基中在32℃～38℃和pH6.5～7.5培养条件下进行微生物发酵40～60h。
第二步：分离
将含有透明质酸钠发酵液快速升温至50℃～90℃，维持5～10min，使细菌荚膜和菌体分离、同时使培养基蛋白质变性，用烧结钛棒过滤器过滤；
过滤完毕，立即在滤液中加入冷的注射用水将发酵液快速冷却至室温。
第三步：提纯
在滤液中按照滤液体积的3％加入经高温干烤活化过的活性炭，活性炭吸附次数2次，第一次吸附时间8h,第二次吸附时间4h，每次吸附完成后用0.45μm聚醚砜滤芯的过滤器进行精滤。
对精滤液进行超滤，在透明质酸钠精滤液中通过边不断加入无热原的注射用水稀释透明质酸钠滤液，同时用截留分子量在5万Da的超滤膜进行超滤，加入的注射用水超滤，最终加入注射用水体积为滤液体积的5倍，透明质酸钠超滤液的浓度在0.5g/L，超滤液中的电导率达到90μs/cm。
第四步：除菌过滤
用0.22μm聚醚砜滤芯的过滤器对上述超滤液进行除菌过滤压入常温减压设备中，除菌过滤压力为0.18mPa。
第五步：动态冷冻干燥
过滤完毕，关闭阀门，在常温减压设备中，将透明质酸钠的无菌滤液常温减压浓缩至透明质钠浓度为5g/L。
通过加压将透明质酸钠浓缩液输入动态低温冷冻设备中，将动态低温冷冻设备夹套温度降至-5℃～5℃，边搅拌边抽真空制备无菌透明质酸钠浓缩液的冰晶，搅拌速度150rpm。
采用动态真空干燥技术通过边搅拌边真空干燥透明质酸钠冰晶制备透明质酸钠无菌原料干粉，搅拌速度为150rpm、真空度为-30kPa、干燥时间36h、夹套升温至45℃。
该方法制备透明质酸钠的在重均分子量为2.323×106，分散系数Mw/Mn为1.155，细菌内毒素小于0.05Eu/mg，蛋白含量0.03％。
实施例2
第一步：同实施例1。
第二步：同实施例2。
第三步：提纯
在滤液中按照滤液体积的2.5％加入经高温干烤活化过的活性炭，活性炭吸附次数3次，第一次吸附时间8h，第二次吸附时间4和，第三次吸附时间4h，每次吸附完成后用0.45μm聚醚砜滤芯的过滤器进行精滤。
对精滤液进行超滤，在透明质酸精滤液中通过边不断加入无热原的注射用水稀释透明质酸滤液，同时用截留分子量为5万Da的超滤膜进行超滤，加入的注射用水的体积为滤液体积的8倍，超滤后透明质酸超滤液的浓度在0.35g/L左右，超滤液中的电导率达到70μs/cm以下。
第四步：同实施例1，除菌过滤压力为0.15mPa。
第五步：动态冷冻干燥
在常温减压设备中，将透明质酸钠无菌滤液常温减压浓缩至透明质酸钠浓度为3.5g/L左右。
通过加压将透明质酸钠浓缩液压入动态低温冷冻设备中，将动态低温冷冻设备夹套温度降至-5℃～5℃，边搅拌边抽真空制备无菌透明质酸钠浓缩液的冰晶，搅拌速度100rpm。
采用动态真空干燥技术通过边搅拌边真空干燥透明质酸钠冰晶制备透明质酸钠无菌原料干粉，搅拌速度为100rpm、真空度为-30kPa、干燥时间54h、夹套升温至35℃。
该方法制备透明质酸钠的在重均分子量为2.496×106，分散系数Mw/Mn为1.114，细菌内毒素小于0.05Eu/mg，蛋白含量0.01％。
实施例3
第一步：同实施例1。
第二步：同实施例2。
第三步：提纯
在滤液中按照滤液体积的2％加入经高温干烤活化过的活性炭，活性炭吸附次数3次，第一次和第二次吸附时间8h，第三次吸附时间4h，每次吸附完成后用0.45μm聚醚砜滤芯的过滤器进行精滤。
对精滤液进行超滤，在透明质酸精滤液中通过边不断加入无热原的注射用水稀释透明质酸滤液，同时用截留分子量10万Da的超滤膜进行超滤，加入的注射用水的体积为滤液的10倍，透明质酸超滤液的浓度在0.2g/L，超滤液中的电导率达到40μs/cm以下。
第四步：同实施例1，除菌过滤压力为0.12mPa。
第五步：动态冷冻干燥
过滤完毕，关闭阀门，在常温减压设备中，将透明质酸钠的无菌滤液常温、低压浓缩至透明质酸或其盐浓度为2g/L。
通过加压将透明质酸钠的浓缩液压入动态低温冷冻设备中，将动态低温冷冻设备夹套温度降至-5℃～5℃，边搅拌边抽真空制备无菌透明质酸或其盐浓缩液的冰晶，搅拌速度50rpm。
通过边搅拌边真空干燥透明质酸或其盐冰晶的动态真空干燥技术制备透明质酸钠无菌原料干粉，搅拌速度为50rpm、真空度为-30kPa、干燥时间72h、夹套升温至25℃。
该方法制备透明质酸钠的在重均分子量为2.535×106，分散系数Mw/Mn为1.063，细菌内毒素小于0.05Eu/mg，蛋白含量0.01％。
Claims (3)
1.一种无盐无有机溶剂纯化技术制备透明质酸钠的方法，其特征在于：将能分泌透明质酸的细菌在培养基中和适宜的培养条件下进行培养发酵产生透明质酸，将得到的透明质酸钠发酵液经纯化处理、除菌过滤、浓缩、动态冷冻干燥制备透明质酸钠无菌原料粉；
其中，所述纯化处理为将透明质酸钠发酵液快速升温至50-90℃，维持5-10分钟，使细菌荚膜和菌体分离、使培养基蛋白质变性，烧结钛棒过滤器过滤；在滤液中加入冷的注射用水将发酵液快速冷却至室温；
将滤液用活性炭吸附，0.45μm聚醚砜滤芯进行精滤，去除多种杂质；
对精滤液进行超滤，对透明质酸滤液进行进一步去除蛋白质、无机盐、细菌内毒素并且稀释制品；其中，所述超滤用截留分子量在5万Da的滤膜进行超滤；
所述除菌过滤为用0.22μm聚醚砜滤芯的过滤器对上述超滤液进行除菌过滤压入常温减压设备中，除菌过滤压力为0.18mPa；
所述浓缩为采用常温、减压浓缩技术在常温、减压至真空度为-30kPa将透明质酸钠浓缩至浓度为2g/L～5g/L；
透明质酸钠浓缩液在动态低温冷冻设备中，通过动态冷冻技术在设备夹套温度-5℃～5℃，边搅拌边抽真空制备无菌透明质酸钠浓缩液的冰晶；
对冰晶进行通过边搅拌边真空干燥制备透明质酸钠无菌原料干粉，搅拌速度为50～200rpm、真空度为-30kPa、干燥时间36～72h、夹套升温至25℃～45℃；
所选细菌为马疫链球菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性炭经高温干烤活化、按照滤液体积的2～3％加入，活性炭吸附次数为2～3次，每次吸附时间为4h～8h，以提高去除可溶性蛋白质、多肽、核酸的效果。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在无盐状态下进行低浓度透明质酸溶液的除菌过滤，浓度在0.2g/L～0.5g/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510105074.6A CN105985994B (zh) | 2015-03-11 | 2015-03-11 | 一种无盐无有机溶剂纯化技术制备透明质酸钠的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510105074.6A CN105985994B (zh) | 2015-03-11 | 2015-03-11 | 一种无盐无有机溶剂纯化技术制备透明质酸钠的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105985994A CN105985994A (zh) | 2016-10-05 |
| CN105985994B true CN105985994B (zh) | 2019-07-09 |
Family
ID=57039506
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510105074.6A Active CN105985994B (zh) | 2015-03-11 | 2015-03-11 | 一种无盐无有机溶剂纯化技术制备透明质酸钠的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105985994B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109913518A (zh) * | 2018-08-17 | 2019-06-21 | 上海昊海生物科技股份有限公司 | 一种透明质酸钠的管道化制备方法 |
| CN110063446A (zh) * | 2019-04-24 | 2019-07-30 | 江苏新美星包装机械股份有限公司 | 一种含盐分饮料的无菌化处理装置 |
| CN110981992B (zh) * | 2019-12-27 | 2021-08-13 | 华熙生物科技股份有限公司 | 一种注射剂用透明质酸的制备方法 |
| CN116874637A (zh) * | 2020-11-20 | 2023-10-13 | 广东双骏生物科技有限公司 | 一种从微生物发酵液中分离纯化透明质酸的方法 |
| CN117402270A (zh) * | 2023-12-13 | 2024-01-16 | 山东众山生物科技有限公司 | 一种无菌透明质酸钠的制备方法和应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1944469A (zh) * | 2006-10-31 | 2007-04-11 | 山东福瑞达生物化工有限公司 | 将浓缩用于透明质酸或其盐的生产的方法 |
| CN101550199A (zh) * | 2009-05-09 | 2009-10-07 | 山东众山生物科技有限公司 | 一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法 |
| CN101935362A (zh) * | 2009-06-30 | 2011-01-05 | 上海佰加壹医药有限公司 | 预铺助滤剂纯化透明质酸的方法 |
| CN103936882A (zh) * | 2013-01-21 | 2014-07-23 | 上海昊海生物科技股份有限公司 | 一种从透明质酸钠发酵液中快速制备透明质酸钠的方法 |
-
2015
- 2015-03-11 CN CN201510105074.6A patent/CN105985994B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1944469A (zh) * | 2006-10-31 | 2007-04-11 | 山东福瑞达生物化工有限公司 | 将浓缩用于透明质酸或其盐的生产的方法 |
| CN101550199A (zh) * | 2009-05-09 | 2009-10-07 | 山东众山生物科技有限公司 | 一种从透明质酸发酵液中制备透明质酸钠的方法 |
| CN101935362A (zh) * | 2009-06-30 | 2011-01-05 | 上海佰加壹医药有限公司 | 预铺助滤剂纯化透明质酸的方法 |
| CN103936882A (zh) * | 2013-01-21 | 2014-07-23 | 上海昊海生物科技股份有限公司 | 一种从透明质酸钠发酵液中快速制备透明质酸钠的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 超滤技术应用于透明质酸发酵液初提工艺的研究;张延良;《医学信息》;20100625(第6期);第1529-1530页 |
| 透明质酸的制备及其应用;鲁念慈;《功能高分子学报》;20010930;第3卷(第14期);第370-376页 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105985994A (zh) | 2016-10-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105985994B (zh) | 一种无盐无有机溶剂纯化技术制备透明质酸钠的方法 | |
| CN109897876B (zh) | 一种制备小分子透明质酸或其盐的方法 | |
| CN104351901B (zh) | 一种益生菌发酵小球藻饮料及其制作方法 | |
| CN106617096B (zh) | 一种增强胰岛功能的双歧杆菌及其应用 | |
| CN102242165A (zh) | 一种发酵生产高分子量透明质酸钠的方法及其所用的培养基 | |
| CN109593124B (zh) | 脐带间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法 | |
| CN103432047A (zh) | 一种天然防腐剂组合物及其在化妆品中的应用 | |
| CN109627315B (zh) | 脂肪间充质干细胞因子冻干粉及其制备方法 | |
| CN102732586B (zh) | 一种间充质干细胞分泌素的制备方法 | |
| CN102690847A (zh) | 酶切法制备寡聚透明质酸盐的方法及所得寡聚透明质酸盐和其应用 | |
| CN106913583A (zh) | 人间充质干细胞源外泌体生物活性制剂的制备方法及应用 | |
| CN108486047A (zh) | 一种干细胞提取物的医用敷料及其制备方法 | |
| CN114146223A (zh) | 一种重组胶原蛋白复合注射剂及其制备方法 | |
| CN105687036B (zh) | 白及护肤产品及其制备方法 | |
| CN105324486A (zh) | 透明质酸的制造方法和含有通过上述制造方法制造的透明质酸的防粘连用组合物 | |
| CN107320492A (zh) | 一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液及其制备方法 | |
| CN101451114A (zh) | 发酵高稳定性透明质酸钠菌种的培育方法 | |
| KR101858733B1 (ko) | 초저분자량 히알루론산의 제조방법 | |
| Srivastav et al. | Biotechnological production and purification of hyaluronic acid from Streptococcus zooepidemicus | |
| CN110863024A (zh) | 一种利用鱿鱼眼制备小分子透明质酸的方法 | |
| CN112251483A (zh) | 一种小分子透明质酸钠的生产方法 | |
| TWI481718B (zh) | Preparation and Application of Seaweed Mannose Complex Polysaccharide Polymers | |
| CN108611387B (zh) | 一种利用植物蛋白胨生产医药级透明质酸钠的方法 | |
| KR20130078829A (ko) | 저분자 히알루론산의 제조방법 | |
| KR101627014B1 (ko) | 히알루론산의 정제 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20221014 Address after: 201106 No. 1008, Wu Wu Road, Shanghai, Minhang District Patentee after: SHANGHAI QISHENG BIOLOGICAL PREPARATION Co.,Ltd. Patentee after: SHANGHAI HAOHAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 201106 No. 1008, Wu Wu Road, Shanghai, Minhang District Patentee before: SHANGHAI QISHENG BIOLOGICAL PREPARATION Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |