CN107320492A - 一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液及其制备方法，解决了现有技术中存在组织修复情况还不尽人意，瘢痕形成明显，视功能恢复不理想的问题。本发明包括细胞培养液，所述细胞培养液为：由脂肪干细胞首先通过间充质干细胞无血清培养基进行培养，使间充质干细胞无血清培养基中的细胞密度达到90％以上后，再分离得到培养上清液，最后将培养上清液经过浓缩后获得的浓缩液。本发明具有显著提高角膜修复效果等优点。

Description

一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种滴眼液，具体涉及一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液及其制备方法。

背景技术

眼睛的健康问题与视力的好坏紧密联系的，如果眼睛出现损伤的话，视力会大大的受到影响。角膜损伤约占严重眼外伤中51％。角膜是重要的屈光介质，角膜损伤后可能形成不同程度的瘢痕，或角膜曲率的改变，严重影响视力。因此，角膜外伤的及时修复能最大限度地减少瘢痕和散光形成，以保留和恢复视功能。角膜损伤的常见因素包括：烧伤、外伤与感染等因素，常见的症状有眼睛流泪、疼痛等。如果是被紫外线损伤的话，会出现角膜上皮的损害，出现眼睑红肿、结膜充血、眼镜异物感很重，畏光、流泪等，还伴有视物模糊。

现在临床常用的修复类眼药水有主要由重组牛碱性成纤维细胞生长因子构成的贝复舒滴眼液，和主要由重组人表皮生长因子构成的易贝滴眼液等。它们都是基因工程表达的细胞因子药物，已经证实一定的临床安全性及有效性，但对一些较严重的角膜损伤病例，组织修复情况还不尽人意，瘢痕形成明显，视功能恢复不理想。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：现有技术中存在组织修复情况还不尽人意，瘢痕形成明显，视功能恢复不理想的问题，目的在于提供了临床修复效果更明显的一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液及其制备方法。

本发明通过下述技术方案实现：

一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液，包括细胞培养液，所述细胞培养液为：由脂肪干细胞首先通过间充质干细胞无血清培养基进行培养，使间充质干细胞无血清培养基中的细胞密度达到90％以上后，再分离得到培养上清液，最后将培养上清液经过浓缩后获得的浓缩液。

本发明通过培育脂肪细胞获得的细胞培养液，能达到更好地组织修复效果，并且，通过表1中实施例1-5的效果对比可知：本发明中细胞培养液能更好地促进角膜组织的修复，修复效果极佳。

进一步，所述间充质干细胞无血清培养基中还添加有GMP标准的hrEGF、bFGF和hLif；hrEGF添加后的终浓度为0.1～0.2μg/mL，bFGF添加后的终浓度为0.02～0.06μg/mL，hLif添加后的终浓度为0.01～0.06μg/mL。

通过上述hLif的作用，能有效达到抑制干细胞分化，保存干细胞干性的作用。并且，通过表1中实施例1～3的效果对比可知：本发明中的细胞培养液与hrEGF、bFGF和hLif之间存在相互促进的作用，效果极佳。即，通过上述条件的设置，能使本发明的修复效果达到最佳，效果更加显著。

更进一步地，所述浓缩的倍数为2～8倍。所述浓缩的方式采用冷冻真空干燥方法。

一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液的制备方法，包括：

取脂肪细胞，进行脂肪细胞的清洗，然后加入等体积的胶原酶进行消化；进行消化后细胞的清洗，离心去上清液，重悬后转入间充质干细胞无血清培养基中进行培育，细胞传代至3～6代时，进行细胞鉴定，当细胞密度达到90％以上后获得培养上清液；将培养上清液浓缩后制成细胞培养液。

所述间充质干细胞无血清培养基中还添加有GMP标准的hrEGF、bFGF和hLif；hrEGF添加后的终浓度为0.1～0.2μg/mL，bFGF添加后的终浓度为0.02～0.06μg/mL，hLif添加后的终浓度为0.01～0.06μg/mL。

通过上述各组成成分和配比的结合，能极大地提高修复效果，恢复效果极其显著。

进一步，所述胶原酶采用I型胶原酶，消化时间为50～70分钟，所述I型胶原酶的浓度为0.2％～0.3％。

更进一步，所述清洗采用生理盐水进行处理；消化后细胞清洗完成后再在2000rpm的条件下离心5min，去除上清液。所述重悬时采用间充质干细胞无血清培养基进行处理，间充质干细胞无血清培养基重悬后转入T75培养瓶中进行培养。

优选地，所述上清液采用冷冻真空干燥方法进行浓缩，浓缩的倍数为2～8倍；浓缩后经过0.22μm的除菌滤器，过滤除菌制成成品。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

1、本发明通过培育脂肪细胞获得的细胞培养液合，能达到更好地角膜组织修复效果，并且本发明中的脂肪细胞通过包含有hrEGF、bFGF和hLif的间充质干细胞无血清培养基培育后，能够使脂肪细胞培养液与添加的生长因子之间存在相互促进的效果，效果极佳。

2、本发明不存在免疫排斥等问题，具有强大的细胞再生与修复的作用，效果十分显著。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为实施例1的成品处理后角膜组织在100倍下的染色结果切片图。

图2为实施例2的成品处理后角膜组织在100倍下的染色结果切片图。

图3为实施例3的成品处理后角膜组织在100倍下的染色结果切片图。

图4为实施例4的成品处理后角膜组织在100倍下的染色结果切片图。

图5为实施例5的成品处理后角膜组织在100倍下的染色结果切片图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液，包括细胞培养液，所述细胞培养液为：由脂肪干细胞首先通过间充质干细胞无血清培养基进行培养，使间充质干细胞无血清培养基中的细胞密度达到90％以上后，再分离得到培养上清液，最后将培养上清液经过浓缩后获得的浓缩液。

上述细胞培养液的制备方法，具体如下：

取脂肪20ml，用生理盐水清洗两次，然后加入等体积的浓度为0.25％的I型胶原酶进行消化，消化过程中反复震荡，消化60min后，再加入等体积的原代培养基终止消化，反复吹打混匀后，采用生理盐水进行细胞的清洗，2000rpm离心5min后去上清液，再次加入生理盐水进行细胞的清洗，2000rpm离心5min后去上清液，沉淀采用间充质干细胞无血清培养基重悬，重悬后转入盛装有间充质干细胞无血清培养基的T75培养瓶中进行培育，细胞进行传代，4代时进行细胞鉴定，当鉴定出细胞密度达到90％以上后，获取培养上清液；采用冷冻真空干燥方法对培养上清液进行浓缩，浓缩6倍后制成细胞培养液。

本实施例中该间充质干细胞无血清培养基采用CellGenix开发的间充质干细胞无血清培养基。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于，间充质干细胞无血清培养基的组成成份不同，具体设置如下：

一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液，包括细胞培养液，上述细胞培养液的制备方法为：取脂肪20ml，用生理盐水清洗两次，然后加入等体积的浓度为0.25％的I型胶原酶进行消化，消化过程中反复震荡，消化60min后，再加入等体积的原代培养基终止消化，反复吹打混匀后，采用生理盐水进行细胞的清洗，2000rpm离心5min后去上清液，再次加入生理盐水进行细胞的清洗，2000rpm离心5min后去上清液，沉淀采用间充质干细胞无血清培养基重悬，重悬后转入盛装有间充质干细胞无血清培养基的T75培养瓶中进行培育，细胞进行传代，4代时进行细胞鉴定，当鉴定出细胞密度达到90％以上后，获取培养上清液；采用冷冻真空干燥方法对培养上清液进行浓缩，浓缩6倍后制成细胞培养液。

本实施例中该间充质干细胞无血清培养基包括CellGenix开发的间充质干细胞无血清培养基，并且在CellGenix开发的间充质干细胞无血清培养基中添加GMP标准的hrEGF、bFGF和hLif；hrEGF添加后的终浓度为0.15μg/mL，bFGF添加后的终浓度为0.04μg/mL，hLif添加后的终浓度为0.04μg/mL。

实施例3

本实施例为实施例2的对照实施例，本实施例中的滴眼液由终浓度为1.5μg/mL的hrEGF，终浓度为0.4μg/mL的bFGF，终浓度为0.4μg/mL的hLif组成。

实施例4

本实施例为本发明的对照实施例，本实施例中滴眼液为贝复舒滴眼液。

实施例5

本实施例与实施例2的区别在于，本实施例中间充质干细胞无血清培养基中添加的hrEGF、bFGF和hLif的浓度不同，具体如下：

其中，hrEGF按照0.4μg/mL的添加量添加到细胞培养液中，bFGF按照0.1μg/mL的添加量添加到细胞培养液中，hLif按照0.1μg/mL的添加量添加到细胞培养液中。

采用上述实施例1～实施例5的成品对家兔进行试验，试验方式如下：

一、建立家兔模型

采用外科手术造损的方式，使创伤深达角膜基质层，进而建立家兔模型。

二、治疗方法

治疗时间为5天，每组重复三次。每天早晚滴眼治疗两次，每次30微升，治疗过程观察角膜感染与修复情况，以及家兔饮食行动等其它反应。

三、治疗效果检测

治疗时间结束后处死家兔，取角膜全层送病理切片，每一份标本进行双染色处理，即H&E染和Masson染色；同时提供生理盐水组。检测结果如下：

1、生理盐水组与贝复舒滴眼液治疗组均有轻微脓性分泌物，实验组别未见明显感染，治疗全程家兔饮食行动正常。

2、根据H&E染和Masson染色的结果整理出修复情况表，修复情况如表1所示，表1中的+代表修复程度，+越多，修复效果越好，-代表未有修复。

表1

	表皮细胞	弹力层	基质层
				生理盐水	++	-	-
实施例1	+++	++	+
				实施例2	+++++	++++	++++
实施例3	++++	+	++
				实施例4	++	++	-
实施例5	+++	++++	+++

3、提供实施例1～5的滴眼液处理后在100倍下的染色结果切片图；通过该图片可以看出：

图1中表皮连续完整，上皮细胞层数平均为3，细胞形态不分明，提示上皮过度增殖产生疤痕。基底层仍有深刻划痕。基质层未见明显增殖，且胶原排列不整齐。

图2的表皮已经生长完全并且细胞层数平均为5层。基底层平整。基质层完整且弹力纤维排列完整。

图3中表皮连续完整，上皮细胞层数平均4层，且细胞形态清晰分明。基底膜不平整。前弹力层丢失，基质层直接与表皮层相续，见少量炎细胞浸润。

图4中表皮连续完整，细胞平均2层。基底层见明显的深刻划痕。前弹力层部分修复，胶原排列不完整。未见基质层增生。有炎症细胞浸润。

图5中表皮连续完整，上皮细胞层数平均3层，且细胞形态清晰分明。基底层有少量深刻划痕。基质层完整，但弹力纤维过多，提示过度增殖。

进而可以确认，通过本发明的成品可以有效使角膜划伤愈合至正常，并且已有正常生理功能。

通过上述图片以及表1中的数据以及图1～图5的切片结果可知：实施例1～3的结果可以证明：本发明通过在间充质干细胞无血清培养基中还添加GMP标准的hrEGF、bFGF和hLif，能够使脂肪细胞培养液与添加的生长因子之间存在相互促进的效果；实施例2和实施例3与5的数据结果对比证明：只有在培养基中添加本发明浓度下的生长因子，才能有效达到细胞培养液与生长因子之间相互促进的效果；通过实施例1和3-5与实施例2的试验结果对比可知：本发明浓度下获得的滴眼液的修复效果最佳，优于浓缩无添加细胞因子对照组与贝复舒对照组。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液，包括细胞培养液，其特征在于，

所述细胞培养液为：由脂肪干细胞首先通过间充质干细胞无血清培养基进行培养，使间充质干细胞无血清培养基中的细胞密度达到90％以上后，再分离得到培养上清液，最后将培养上清液经过浓缩后获得的浓缩液。

2.根据权利要求1所述的一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液，其特征在于，所述间充质干细胞无血清培养基中还添加有GMP标准的hrEGF、bFGF和hLif；hrEGF添加后的终浓度为0.1～0.2μg/mL，bFGF添加后的终浓度为0.02～0.06μg/mL，hLif添加后的终浓度为0.01～0.06μg/mL。

3.根据权利要求1所述的一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液，其特征在于，所述浓缩的倍数为2～8倍。

4.根据权利要求1所述的一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液，其特征在于，所述浓缩的方式采用冷冻真空干燥方法。

5.一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液的制备方法，其特征在于，包括：

取脂肪细胞，进行脂肪细胞的清洗，然后加入等体积的胶原酶进行消化；进行消化后细胞的清洗，去上清液，重悬后转入间充质干细胞无血清培养基中进行培育，细胞传代至3～6代时进行细胞鉴定，当细胞密度达到90％以上后获得培养上清液；将培养上清液浓缩后制成细胞培养液。

6.根据权利要求5所述的一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液的制备方法，其特征在于，所述胶原酶采用I型胶原酶，消化时间为50～70分钟，所述I型胶原酶的浓度为0.2％～0.3％。

7.根据权利要求5所述的一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液的制备方法，其特征在于，所述清洗采用生理盐水进行处理；消化后细胞清洗完成后再在2000rpm的条件下离心5min，去除上清液。

8.根据权利要求5所述的一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液的制备方法，其特征在于，所述重悬时采用间充质干细胞无血清培养基进行处理，采用间充质干细胞无血清培养基重悬后转入T75培养瓶中进行培养。

9.根据权利要求5所述的一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液的制备方法，其特征在于，所述间充质干细胞无血清培养基中还添加有GMP标准的hrEGF、bFGF和hLif；hrEGF添加后的终浓度为0.1～0.2μg/mL，bFGF添加后的终浓度为0.02～0.06μg/mL，hLif添加后的终浓度为0.01～0.06μg/mL。

10.根据权利要求5所述的一种治疗角膜损伤的脂肪干细胞制剂滴眼液的制备方法，其特征在于，所述上清液采用冷冻真空干燥方法进行浓缩，浓缩的倍数为2～8倍；浓缩后经过过滤除菌制成成品。