CN110433137A - 一种间充质干细胞旁分泌因子在滴眼液中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种间充质干细胞旁分泌因子在滴眼液中的应用，涉及生物干细胞技术领域在眼科的应用。间充质干细胞旁分泌因子在制备视网膜黄斑变性滴眼液中的应用。所述获取旁分泌因子的间充质干细胞来源包括脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞等一切哺乳动物尤其人的各组织来源的间充质干细胞。滴眼液成份全部为间充质干细胞旁分泌因子组合，同时为了最大程度的保持蛋白活性，将蛋白冷冻保存。

Description

一种间充质干细胞旁分泌因子在滴眼液中的应用
技术领域
本发明涉及生物干细胞技术领域在眼科的应用，具体涉及一种用于治疗视网膜黄斑变性的滴眼液的制备方法及其应用。
背景技术
视网膜黄斑变性是视网膜色素上皮细胞对视细胞外节盘膜吞噬消化能力下降，结果使未被完全消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排出，沉积于Bruch膜，形成玻璃膜疣。由于黄斑部结构与功能上的特殊性，此种改变更为明显。玻璃膜疣也见于正常视力的老年人，但由此继发的种种病理改变后，则导致黄斑部变性发生。本病大多发生于45岁以上，其患病率随年龄增长而增高，是当前老年人致盲的重要疾病。如果不及时治疗黄斑变性，会导致永久性失明。目前在现代医学中，尚无确定的药物治疗，也未找到阻止本病病程进展的好方法，治疗上目前为止，仍然是十分困难的。总的治疗目的是控制延缓病情发展，消散眼底瘀滞，改善或提高视力。
间充质干细胞是一类存在于多种组织(如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等)，具有多向分化潜力，非造血干细胞的成体干细胞。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨及成脂肪细胞等)或非间充质系列细胞分化的潜能，并具有独特的细胞因子分泌功能。目前，间充质干细胞移植已经成功应用于包括神经系统、消化系统、免疫系统等多个系统的疾病治疗。
间充质干细胞在培养过程中可分泌多种细胞因子，如表皮生长因子(EGF)，血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)，神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等。但正常培养的间充质干细胞分泌含量和能力均有限，只有在应激的条件下间充质干细胞才能分泌更多的辅助细胞修复的因子，比如在高温、低温、缺氧或者无营养的条件下间充质干细胞将分泌更多的有益的生长因子，包括表皮生长因子，血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，首先提供了一种更多获取脐带间充质干细胞旁分泌因子的方法，其次提供了一种用于治疗视网膜黄斑变性的滴眼液及制备方法，该滴眼液能够缓解视疲劳，减少局部炎症，促进局部细胞修复，有效改善视网膜黄斑变性导致的多种症状，如视物不清，视野缺损，视力下降等。
一种间充质干细胞旁分泌因子在制备视网膜黄斑变性滴眼液中的应用。
进一步优选的，所述获取旁分泌因子的间充质干细胞来源包括脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞等一切哺乳动物尤其人的各组织来源的间充质干细胞。
本发明为了最大限度的促进视网膜黄斑变性的改善和修复，滴眼液成份全部为间充质干细胞旁分泌因子组合，同时为了最大程度的保持蛋白活性，将蛋白冷冻保存。
一种用于治疗视网膜黄斑变性的脐带间充质干细胞旁分泌因子滴眼液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
一种脐带间充质干细胞培养旁分泌因子收集方法步骤如下：
(1)取足月健康胎儿脐带，检测脐带血清HbsAg、抗-HCV、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV-1/2、HCV-RNA、HIV-1-RNA、CMV-DNA，检测结果均为阴性，可用；
(2)将生理盐水瓶用喷有酒精的纱布擦拭一遍后，去除瓶口处的封口塑料放入处于运行状态的洁净台中；
(3)脐带华通氏胶的剥离并洗涤
优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；
(4)组织块制备
剪切脐带华通氏胶：将步骤(3)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-3mm的组织碎块，进行离心；
(5)接种
将步骤(4)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；
(6)脐带华通氏胶的培养
平置步骤(5)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有5wt％-10wt％血清替代物的基础培养基高糖(DMEM培养基)，然后缓慢让培养基浸润组织块继续培养；细胞培养箱内的培养条件为：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；
(7)换液
第一次换液：步骤(6)脐带华通氏胶培养到第6-7天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等体积的含有10％wt血清替代物的高糖DMEM培养基，平置培养瓶，放置到从CO2培养箱中继续培养；
第二次换液：脐带华通氏胶培养到9-10天后，重复第一次换液的操作；
第三次换液：在镜像下观察细胞的生长状况，如果细胞融合度没有达到70-80％，在脐带华通氏胶培养到12-13天后，增加一次全量换液的操作(同第一次换液)；
(8)收获原代细胞细胞观察：将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；
原代细胞收获：
配置细胞消化液：按照胰酶与生理盐水1:4的体积比将两者混合，混合液即为细胞消化液；
去除旧的培养液：轻轻摇晃培养瓶，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；
洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；
消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；
终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入含有血清替代物的高糖DMEM培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到离心管中离心；
(9)原代细胞传代(P0传P1)
将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有血清替代物的高糖DMEM培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；
将重悬后得到的细胞悬液接种到培养瓶并加入含有血清替代物的干细胞培养基；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％。
种瓶：按照50000cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入含有血清替代物的高糖DMEM培养基15-20ml。
(10)间充质干细胞旁分泌因子
按照步骤(8)-(9)的相同操作，将细胞做消化传代处理，当细胞传代到P4代时即为所用细胞，养至细胞融合度达到80-90％。
除去培养瓶中的培养基，并用生理盐水缓冲液清洗2-3次，然后吸尽培养瓶中生理盐水，加入含有5wt％血清替代物的高糖DMEM培养基，将含有细胞的培养瓶放置入2％氧浓度(优先培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％)的低氧的培养箱中，继续培养48h，后收集间充质干细胞旁分泌因子悬液；
将上述间充质干细胞旁分泌因子悬液放入离心管，以1000rpm离心5分钟后收取上清液，然后0.22无菌滤器除菌过滤，即得所述间充质干细胞旁分泌因子滴眼液。
本发明上述间充质干细胞旁分泌因子的获取方法并不是常规培养的培养液中提取，本方法是对间充质干细胞进行低氧联合低营养双重刺激促进间充质干细胞释放出大量的旁分泌因子，包含了数百种蛋白的组合成分。
间充质干细胞旁分泌因子获取的方法是采用低氧加上低营养双重处理方式，其中低氧采用低氧培养箱培养，氧气的浓度范围从1％-15％不等，低营养的方式是添加入血清或者生长因子组合的比例从1％-5％不等，经过摸索对比发现，当氧气浓度在2％，营养成分占无血清培养基的5％的时候可以最大限度的促进间充质干细胞的旁分泌作用，同时又保证了间充质干细胞的活性。包括人体胎盘、脐带、脐带血、脂肪以及骨髓等所有人体各组织来源的间充质干细胞。
滴于眼表，根据病情不同决定了滴眼的频率不同，从平均每天滴眼3次(早、中、晚)到每天滴眼12次(每隔2小时一次)，每次滴眼150～200μL，滴眼后闭目20分钟病，期间进行眼球转动，连续进行7～30d。
本发明的有益效果是：
本发明间充质干细胞旁分泌因子的获取方法，在使的细胞存活时间尽可能长的情况下，同时又通过低氧和低营养的方式给于间充质干细胞应激，使得间充质干细胞细胞分泌更多的有效细胞因子。
本发明利用针对现存的尚无有效治疗视网膜黄斑变性的药物，针对性研发出了一款滴眼液，其能通过眼部表面点滴的方式对眼部进行间充质干细胞旁分泌因子给药，具有制备简便，无任何毒副作用及使用便捷等优点。此款滴眼液既可以缓解视疲劳，降低局部炎症反应和变性，又能消除眼部充血，提高视力，改善视野缺损和视物不清。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的脐带间充质干细胞的镜下形态特点(40倍)。
图2为本发明实施例1制得的脐带间充质干细胞的流式细胞仪鉴定照片。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1脐带间充质干细胞旁分泌因子滴眼液的制备
本发明所述的脐带间充质干细胞滴眼液主要来源于人脐带间充质干细胞，但干细胞来源不仅限于脐带，可来源于人体胎盘、骨髓、牙髓、脂肪等多个人体组织来源。
其中，脐带间充质干细胞旁分泌因子滴眼液的制备过程如下：
(1)脐带间充质干细胞的培养：剪取新鲜脐带，用无菌生理盐水清洗干净后，进一步去除可见血管，将脐带剪至大小约2-3cm小组织块儿，后放入细胞培养皿中，剪切脐带华通氏胶：将洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-3mm的组织碎块，进行离心；将步离心后的组织去除上清后，接种到接种培养瓶T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面，平置接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有5wt％-10wt％血清替代物(商品名称：Ultroser G serum substitute；货号：15950-017；购自美国pall公司)的基础培养基(高糖DMEM培养基)，然后缓慢让培养基浸润组织块继续培养(培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％)。约10-14天后可见梭型细胞从组织块中爬出，此即为脐带间充质干细胞，经过几次传代，当到3-5代的时候即可使用来制备旁分泌因子滴眼液，具体见发明内容对应的步骤。如图1和图2所示，图1和图2分别是脐带间充质干细胞的培养图片和流式细胞仪鉴定图片。
(2)脐带间充质干细胞旁分泌因子滴眼液的配置：除去培养瓶中的培养基，并用生理盐水缓冲液清洗2-3次，然后吸尽培养瓶中生理盐水缓冲液，加入含有5％营养成分的干细胞培养基，将含有细胞的培养瓶放置入2％氧浓度的低氧的培养箱中，继续培养48h，后收集旁分泌因子悬液。
将上述间充质干细胞旁分泌因子悬液放入15ml离心管，以1000rpm离心5分钟后收取上清液，然后0.22无菌滤器除菌过滤，即得所述间充质干细胞旁分泌因子滴眼液。
实施例2间充质干细胞旁分泌因子滴眼液的眼部安全性评价试验：
随机选取24只任意性别的健康SD大鼠分为两组：一组作为空白对照，左眼不处理，右眼点医用生理盐水；另一组作为实验组，左眼不处理，右眼点本发明脐带间充质间充质干细胞旁分泌因子滴眼液。一日3次，一次1-2滴(约200μl/滴)，连续滴眼进行14天。期间，选取7天和14天两个时间点观察大鼠生理变化。根据Draize评分标准，对大鼠眼的表现进行刺激性评分。无刺激性为0-3分；轻度刺激为4-8分；中度刺激为9-12分；重度刺激为13-16分。最后结果显示：点滴生理盐水和点滴间充质干细胞外泌体滴眼液在7天和14天两个时间节点对大鼠眼睛均无刺激性，不会导致眼部不适和损害，未见眼睛红肿，未见眼睛分泌物增加，同时对大鼠视网膜及各主要器官无经过检测没发现任何病理损害。同时，实验过程中大鼠也没发现有其它异常生理变化，这表明间充质干细胞旁分泌因子滴眼液具有安全性和可行性。
实施例3间充质干细胞旁分泌因子滴眼液的人眼部安全性评价试验：
随机选取30个自愿者(性别不限)单眼点间脐带间充质间充质干细胞旁分泌因子滴眼液。一日3次，一次1-2滴(约300μl/滴)，连续滴眼进行14天。期间，选取7天和14天两个时间点进行视力检测、眼底检测和血常规及生化检测。最后结果显示：点滴间充质干细胞外泌体滴眼液在7天和14天两个时间节点自愿者均未见眼睛红肿，未见眼睛分泌物增加以及其他任何不适，同时眼底检测未见异常，血常规及生化检测均正常。在三个月和半年后均对30位自愿者进行复检，各项症状及血指标均无异常。以上充分表明间充质干细胞旁分泌因子滴眼液具有安全性和可行性。
随机选取25名(32只眼睛)视网膜黄斑变性者，年龄50-70岁，平均年龄(59.32±4.99)岁，男15例(20只眼睛)，女10例(12只眼睛)。眼点间充质干细胞旁分泌因子滴眼液。一日3次，一次1-2滴(约300μl/滴)，连续滴眼进行28天。期间，选取1个月后的时间点进行眼压和视力检测，同时赋予眼底荧光血管造影、眼底镜检查以及OCT检查。最后结果显示：患者的视力、黄斑中厚度以及视网膜的动脉直径明显发生变化，通过滴眼治疗后，25例患者的视网膜动脉直径明显减小，同时其黄斑中心厚度也明显减小，P＜0.05，差异具有统计学意义。在3个月后均对25位患者进行复检，各项症状均未再进展。以上充分表明间充质干细胞旁分泌因子滴眼液具有安全性和有效性(详细数据见表1)。
表1：比较25例患者治疗前后各种研究数据(x±s)
研究参数 治疗前 治疗后 t p
静脉充盈时间(s) 10.7±2.14 10.9±2.63 120.021 0.001
臂-视网膜循环时间(s) 15.5±3.63 16.21±4.76 10.789 0.001
动脉循环时间(s) 2.20±1.01 2.19±0.96 698.236 0.001
平均最佳纠正视力 0.81±0.55 0.76±0.42 0.778 0.001
平均黄斑中心厚度(um) 302.80±88.67 211.32±66.54 3.234 0.001
视网膜动脉直径(mm) 0.12±0.04 0.1±0.03 1.437 0.001
视网膜静脉直接(mm) 0.20±0.03 0.10±0.02 1 0.001
本发明的间充质干细胞旁分泌因子滴眼液是通过一种特有的方法刺激了间充质干细胞的旁分泌作用，极大的促进了其分泌了大量的生长营养因子，这些有效成分缓解视疲劳，减少局部炎症，促进局部细胞修复，有效改善视网膜黄斑变性导致的多种症状，如视物不清，视野缺损，视力下降等，既改善了视网膜黄斑变性导致的各种眼部症状，又能够有效减缓疾病的进展。
以上所述干细胞旁分泌因子滴眼液的应用仅为本发明的较佳实施例，故不能依此限定本发明实施的范围，即根据本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种间充质干细胞旁分泌因子在制备视网膜黄斑变性滴眼液中的应用。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于，所述获取旁分泌因子的间充质干细胞来源哺乳动物尤其人的各组织的间充质干细胞。
3.按照权利要求1所述的应用，其特征在于，所述获取旁分泌因子的间充质干细胞来源选自脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞。
4.按照权利要求1-3的任一项所述的应用，其特征在于，脐带间充质干细胞旁分泌因子的制备方法，包括以下步骤：
(1)取足月健康胎儿脐带，检测脐带血清HbsAg、抗-HCV、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV-1/2、HCV-RNA、HIV-1-RNA、CMV-DNA，检测结果均为阴性，可用；
(2)将生理盐水瓶用喷有酒精的纱布擦拭一遍后，去除瓶口处的封口塑料放入处于运行状态的洁净台中；
(3)脐带华通氏胶的剥离并洗涤
优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；
(4)组织块制备
剪切脐带华通氏胶：将步骤(3)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-3mm的组织碎块，进行离心；
(5)接种
将步骤(4)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；
(6)脐带华通氏胶的培养
平置步骤(5)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有5wt％-10wt％血清替代物的基础培养基高糖(DMEM培养基)，然后缓慢让培养基浸润组织块继续培养；细胞培养箱内的培养条件为：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；
(7)换液
第一次换液：步骤(6)脐带华通氏胶培养到第6-7天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等体积的含有10％wt血清替代物的高糖DMEM培养基，平置培养瓶，放置到从CO2培养箱中继续培养；
第二次换液：脐带华通氏胶培养到9-10天后，重复第一次换液的操作；
第三次换液：在镜像下观察细胞的生长状况，如果细胞融合度没有达到70-80％，在脐带华通氏胶培养到12-13天后，增加一次全量换液的操作(同第一次换液)；
(8)收获原代细胞
细胞观察：将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；
原代细胞收获：
配置细胞消化液：按照胰酶与生理盐水1:4的体积比将两者混合，混合液即为细胞消化液；
去除旧的培养液：轻轻摇晃培养瓶，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；
洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；
消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；
终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入含有血清替代物的高糖DMEM培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到离心管中离心；
(9)原代细胞传代，P0传P1；
将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有血清替代物的高糖DMEM培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；
将重悬后得到的细胞悬液接种到培养瓶并加入含有血清替代物的干细胞培养基；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％。
种瓶：按照50000cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入含有血清替代物的高糖DMEM培养基15-20ml。
(10)间充质干细胞旁分泌因子
按照步骤(8)-(9)的相同操作，将细胞做消化传代处理，当细胞传代到P4代时即为所用细胞，养至细胞融合度达到80-90％。
除去培养瓶中的培养基，并用生理盐水缓冲液清洗2-3次，然后吸尽培养瓶中生理盐水，加入含有5wt％血清替代物的高糖DMEM培养基，将含有细胞的培养瓶放置入2％氧浓度(优先培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％)的低氧的培养箱中，继续培养48h，后收集间充质干细胞旁分泌因子悬液；
将上述间充质干细胞旁分泌因子悬液放入离心管，以1000rpm离心5分钟后收取上清液，然后0.22无菌滤器除菌过滤，即得所述间充质干细胞旁分泌因子滴眼液。
5.一种滴眼液，其特征在于，包括间充质干细胞旁分泌因子。
6.按照权利要求5所述的一种滴眼液，其特征在于，所述获取旁分泌因子的间充质干细胞来源哺乳动物尤其人的各组织的间充质干细胞。
7.按照权利要求5所述的一种滴眼液，其特征在于，所述获取旁分泌因子的间充质干细胞来源选自脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊膜间充质干细胞。
8.按照权利要求5-7任一项所述的滴眼液，其特征在于，滴眼液成份全部为间充质干细胞旁分泌因子组合。
9.按照权利要求5-7任一项所述的滴眼液，其特征在于，所述的滴眼液用于治疗视网膜黄斑变性。
10.权利要求5-7任一项所述的滴眼液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取足月健康胎儿脐带，检测脐带血清HbsAg、抗-HCV、抗-HDV、抗-HEV、抗-HIV-1/2、HCV-RNA、HIV-1-RNA、CMV-DNA，检测结果均为阴性，可用；
(2)将生理盐水瓶用喷有酒精的纱布擦拭一遍后，去除瓶口处的封口塑料放入处于运行状态的洁净台中；
(3)脐带华通氏胶的剥离并洗涤
优选:在生理盐水中洗涤去除脐带血渍，然后浸泡酒精消毒，再次用生理盐水洗涤，在装有生理盐水的培养皿中将将脐带剪成2-3cm小段，并用生理盐水洗涤清除脐带小段血管中的淤血和凝块；然后剥离华通氏胶，用生理盐水进行洗涤；
(4)组织块制备
剪切脐带华通氏胶：将步骤(3)洗涤后的脐带华通氏胶剪切成1-3mm的组织碎块，进行离心；
(5)接种
将步骤(4)离心后的组织匀浆去除上清后，接种到接种培养瓶如T150中，并平铺到整个接种培养瓶底面；
(6)脐带华通氏胶的培养
平置步骤(5)接种培养瓶，放置于CO2培养箱中，6-12个小时后将培养瓶缓慢直立起来，往培养瓶中底部加入含有5wt％-10wt％血清替代物的基础培养基高糖(DMEM培养基)，然后缓慢让培养基浸润组织块继续培养；细胞培养箱内的培养条件为：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％；
(7)换液
第一次换液：步骤(6)脐带华通氏胶培养到第6-7天进行全量换液；将旧的培养基和未贴壁的组织块倒掉，加入等体积的含有10％wt血清替代物的高糖DMEM培养基，平置培养瓶，放置到从CO2培养箱中继续培养；
第二次换液：脐带华通氏胶培养到9-10天后，重复第一次换液的操作；
第三次换液：在镜像下观察细胞的生长状况，如果细胞融合度没有达到70-80％，在脐带华通氏胶培养到12-13天后，增加一次全量换液的操作(同第一次换液)；
(8)收获原代细胞
细胞观察：将所有培养瓶在显微镜下观察，如观察到细胞融合度达到70％-80％时，即可进行消化收获；
原代细胞收获：
配置细胞消化液：按照胰酶与生理盐水1:4的体积比将两者混合，混合液即为细胞消化液；
去除旧的培养液：轻轻摇晃培养瓶，使未贴壁组织块脱落，再将组织块和旧的培养液一起倒入废液瓶中；
洗涤：往每个去掉旧培养液的瓶中倒入生理盐水，轻轻摇晃培养瓶，使生理盐水液体浸润培养瓶底面和组织块，再将生理盐水倒掉，重复洗涤一次；
消化：往洗涤后的每个培养瓶中加入消化液，使每个培养瓶的消化液浸润整个培养瓶底面，静置1min，上下摇晃培养瓶，使消化液充分接触细胞，镜下观察90％的细胞脱落变圆后可停止消化；
终止消化：往可终止消化的培养瓶中每瓶加入含有血清替代物的高糖DMEM培养基，进行终止消化，前后摇晃培养瓶，进行充分接触稀释，然后转移到离心管中离心；
(9)原代细胞传代，P0传P1；
将上一步离心完后的细胞，去掉上清后加入含有血清替代物的高糖DMEM培养基，将细胞沉淀重悬均匀并合并到一个离心管里面，细胞计数板计数；
将重悬后得到的细胞悬液接种到培养瓶并加入含有血清替代物的干细胞培养基；摇匀放入CO2培养箱培养，培养条件：37±0.5℃、5.0±0.2％的CO2浓度，培养至细胞融合度达到80-90％；
种瓶：按照50000cells/cm2接种于T150的培养瓶中，每瓶中加入含有血清替代物的高糖DMEM培养基15-20ml。
(10)间充质干细胞旁分泌因子
按照步骤(8)-(9)的相同操作，将细胞做消化传代处理，当细胞传代到P4代时即为所用细胞，养至细胞融合度达到80-90％。
除去培养瓶中的培养基，并用生理盐水缓冲液清洗2-3次，然后吸尽培养瓶中生理盐水，加入含有5wt％血清替代物的高糖DMEM培养基，将含有细胞的培养瓶放置入2％氧浓度(优选培养条件：37.0±0.5℃，CO2浓度为5.0±0.2％)的低氧的培养箱中，继续培养48h，后收集间充质干细胞旁分泌因子悬液；
将上述间充质干细胞旁分泌因子悬液放入离心管，离心收取上清液，然后0.22无菌滤器除菌过滤，即得所述间充质干细胞旁分泌因子滴眼液。
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