CN110292628A - 毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子制备方法及应用，其中，制备方法由下述步骤组成：S1、毛囊干细胞因子的制备；S2、脂肪干细胞因子的制备；S3、将脂肪干细胞因子和毛囊干细胞因子混合，得到复合细胞因子浓缩液，将复合细胞因子浓缩液与冻干保护剂混合，混合后冷冻干燥，得到干细胞生发冻干粉，即为毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子。本发明制备的干细胞生发冻干粉安全性高，使用方便，有较长的保质期，对于改善头皮健康、促进毛发再生有良好的效果及市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子制备方法及应用。
背景技术
头皮作为人体第二薄的皮肤，是与脸部肌肤连成一体的，是脸部皮肤的延伸，是人体最高处的皮肤，控制全身皮肤的弹性，受紫外线和自由基腐蚀最强。脸上皮脂分泌最旺盛的区域是额头，和额头相比，头皮的皮脂分泌差不多是它的2倍。所以衰老的速度也是最快的。头皮的代谢周期为14-21天；头皮的面积是脸部肌肤面积的4倍以上，而头皮的老化速度比脸部肌肤6倍，当头皮每松弛1英寸，目测年龄则比实际年龄大5-7岁，头皮比脸部皮肤薄6倍。所以，当头皮的松弛趋势延向额头、眼角、嘴角等面部部位时，额头皱纹、眼角下垂、法令纹等面部老化问题也相继显现。
而目前针对头皮衰老和毛发再生问题的解决方案效果并不令人满意，很难解决头皮的多种问题，例如激光疗法以及用中草药洗头皮，需长期治疗，效果不明显，并且容易出现皮肤过敏等不良反应。
因此，需要一种区别于传统的头皮抗衰与毛发再生技术，能够有效减少头皮皱纹，改善头皮炎症，促进毛发再生，高效解决头皮多种问题并且维持时间较长的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子制备方法及应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子制备方法，由下述步骤组成：
S1、毛囊干细胞因子的制备：在手术室洁净区条件下，剪取志愿者头发毛囊根部，剪成细小的皮条，用氯化钠注射液清洗后，继续用PBS缓冲溶液冲洗，加入中性蛋白酶消化后，接种于含有双抗的无血清培养基中进行培养，待细胞密度为70％～80％时，即得到原代毛囊干细胞，再将原代毛囊干细胞进行工厂化放大培养，收集毛囊干细胞培养液上清液，毛囊干细胞培养液上清液经浓缩、蛋白含量测定、质检，得到毛囊干细胞因子；
S2、脂肪干细胞因子的制备：抽取人体脂肪组织，高速离心后，去除脂肪上层油脂和底层血性液体，获取中层纯脂肪，用含有I型胶原酶、III型胶原酶的溶液对洗涤后的中层纯脂肪进行消化20-30分钟，消化结束后，离心6分钟，获得脂肪干细胞沉淀，加入8-12％胎牛血清、1％青霉素构成的DMEM培养基进行细胞培养；培养30～40h后，更换培养基，继续培养，待细胞密度为70％～80％时，即得到原代脂肪干细胞，再将原代脂肪干细胞进行工厂化放大培养，收集脂肪干细胞培养液上清液，脂肪干细胞培养液上清液经浓缩、蛋白含量测定、质检，得到脂肪干细胞因子；
S3、将脂肪干细胞因子和毛囊干细胞因子混合，得到复合细胞因子浓缩液，将复合细胞因子浓缩液与冻干保护剂混合，混合后冷冻干燥，得到干细胞生发冻干粉，即为毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子。
优选的，所述步骤S1中的中性蛋白酶的浓度为0.3U/ml-0.6U/ml。
优选的，所述步骤S3中的冷冻干燥条件为：温度在-25～-40℃，压强维持在10-30pa，时间为18-28h。
优选的，所述步骤S1中毛囊干细胞培养上清液与步骤S2中脂肪干细胞培养上清液浓缩的方法具体是：先将收集的毛囊干细胞培养上清液和脂肪干细胞培养的上清液分别采用0.22μm滤膜过滤；然后，分别通过30-40KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过100-120D超滤膜，收集截留液，截留液经蛋白含量测定、质检，分别得到毛囊干细胞因子和脂肪干细胞因子。
优选的，所述步骤S3中毛囊干细胞因子和脂肪干细胞因子按照1∶2～3的比例进行混合。
优选的，所述步骤S3中毛囊干细胞因子和脂肪干细胞因子按照1∶2的比例进行混合。
优选的，所述步骤S1中收集的毛囊干细胞培养液上清液为P3-P6代毛囊干细胞培养液上清液。
优选的，所述步骤S2中收集的脂肪干细胞培养液上清液为P3-P6代脂肪干细胞培养液上清液。
毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子的应用，将上述任一所述方法制备的毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子用于脱发患者的毛发再生。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：毛囊干细胞因子有效的解决了头皮毛发再生的问题，脂肪干细胞因子解决了头皮健康的问题，能够淡化头皮细微，改善头皮炎症。两种干细胞因子相互复合，安全性高，使用方便，有较长的保质期，对于改善头皮健康、促进毛发再生有良好的效果及市场前景。
附图说明
图1为本发明中毛囊干细胞的分离培养照片；
图2为本发明中脂肪干细胞的分离培养照片；
图3为本发明应用后第一组头发再生头皮变化对比照片；
图4为本发明应用后第二组头发再生头皮变化对比照片；
图5为本发明应用后第三组头发再生头皮变化对比照片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1～5，本发明提供一种技术方案：毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子制备方法，由下述步骤组成：
S1、毛囊干细胞因子的制备：在手术室洁净区条件下，剪取志愿者头发毛囊根部，剪成细小的皮条，用氯化钠注射液清洗后，继续用PBS缓冲溶液冲洗，加入中性蛋白酶消化后，接种于含有双抗的无血清培养基中进行培养，待细胞密度为70％～80％时，即得到原代毛囊干细胞，再将原代毛囊干细胞进行工厂化放大培养，收集P3-P6代的毛囊干细胞培养液上清液，毛囊干细胞培养液上清液经浓缩、蛋白含量测定、质检，得到毛囊干细胞因子；具体见图1。
其中，所述步骤S1中的中性蛋白酶的浓度为0.3U/ml-0.6U/ml。
所述步骤S1中毛囊干细胞培养上清液浓缩的方法具体是：先将收集的毛囊干细胞培养上清液采用0.22μm滤膜过滤；然后，通过30-40KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过100-120D超滤膜，收集截留液，截留液经蛋白含量测定、质检，得到毛囊干细胞因子（又称毛囊干细胞培养上清浓缩液）。
S2、脂肪干细胞因子的制备：抽取人体脂肪组织，高速离心后，去除脂肪上层油脂和底层血性液体，获取中层纯脂肪，用含有I型胶原酶、III型胶原酶的溶液对洗涤后的中层纯脂肪进行消化20-30分钟，消化结束后，离心6分钟，去除上层消化后的脂肪及溶液，获得底部的脂肪干细胞沉淀，在消化后的脂肪干细胞沉淀中加入8-12％胎牛血清、1％青霉素构成的DMEM培养基进行细胞培养；培养30～40h后，更换培养基，继续培养，待细胞密度为70％～80％时，即得到原代脂肪干细胞，再将原代脂肪干细胞进行工厂化放大培养，收集P3-P6代的脂肪干细胞培养液上清液，脂肪干细胞培养液上清液经浓缩、蛋白含量测定、质检，得到脂肪干细胞因子；具体见图2。
其中，所述步骤S2中脂肪干细胞培养上清液浓缩的方法具体是：先将收集的脂肪干细胞培养的上清液采用0.22μm滤膜过滤；然后，通过30-40KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过100-120D超滤膜，收集截留液，截留液经蛋白含量测定、质检，得到脂肪干细胞因子（又称脂肪干细胞培养上清浓缩液）。
S3、将脂肪干细胞因子和毛囊干细胞因子混合，得到复合细胞因子浓缩液，将复合细胞因子浓缩液与冻干保护剂混合，混合均匀后，用孔径为0.22μm的无菌滤膜进行过滤除菌，接着进行冷冻干燥，得到干细胞生发冻干粉，即为毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子。
其中，所述步骤S3中的冷冻干燥条件为：温度在-25～-40℃，压强维持在10-30pa，时间为18-28h。
最优选地，所述步骤S3中毛囊干细胞因子和脂肪干细胞因子按照1∶2的比例进行混合。
将不同混合比例的毛囊干细胞因子、脂肪干细胞因子与冻干保护剂进行混合，得到干细胞生发冻干粉的外观、溶解时间和溶解澄清度，具体见表1。
表1：不同混合比例的干细胞因子与冻干保护剂混合结果
| 实施例 | 毛囊干细胞因子 | 脂肪干细胞因子 | 冻干保护剂 | 冻干粉外观 | 溶解时间 | 溶解澄清度 |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 紧密白色粉末 | 3s | 澄清透明 |
| 2 | 1 | 1 | 3 | 紧密白色粉末 | 3s | 澄清透明 |
| 3 | 1 | 2 | 3 | 紧密白色粉末 | 3s | 澄清透明 |
| 4 | 2 | 1 | 3 | 紧密白色粉末 | 3s | 澄清透明 |
| 5 | 1 | 2 | 5 | 紧密白色粉末 | 5s | 澄清透明 |
| 6 | 1 | 2 | 10 | 部分结块 | 8s | 部分浑浊 |
| 7 | 1 | 2 | 15 | 部分结块 | 9s | 部分浑浊 |
| 8 | 1 | 1 | 0 | 紧密白色粉末 | 2s | 澄清透明 |
| 9 | 0 | 0 | 1 | 结块 | 12s | 浑浊 |
毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子的应用，将上述所述方法制备的毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子用于脱发患者的毛发再生。
对头皮进行治疗的具体操作实施方法：
1）操作前头皮清洁及消毒：取生理盐水浸泡后的纱布，对头皮脱发部位进行清洁，生理盐水对导入部位清洁2-3次。
2）医用棉签蘸取碘伏对头皮导入部位消毒，碘伏对操作部位消毒2-3次。
3）把干细胞生发冻干粉与液体溶媒混合。
4）利用微针笔导入的方式，调整针长在0.2-0.6mm，以患者可耐受为准，在需要生发的区域，以打圈方式操作导入干细胞生发液。
统计治疗效果发现，本发明获得的干细胞复合生发因子对1-4级脱发人群，生发效果显著，对脱发、头皮炎症也有非常明显的效果，具体见图3、图4以及图5。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (9)
1.毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子制备方法，其特征在于：由下述步骤组成：
S1、毛囊干细胞因子的制备：在手术室洁净区条件下，剪取志愿者头发毛囊根部，剪成细小的皮条，用氯化钠注射液清洗后，继续用PBS缓冲溶液冲洗，加入中性蛋白酶消化后，接种于含有双抗的无血清培养基中进行培养，待细胞密度为70％～80％时，即得到原代毛囊干细胞，再将原代毛囊干细胞进行工厂化放大培养，收集毛囊干细胞培养液上清液，毛囊干细胞培养液上清液经浓缩、蛋白含量测定、质检，得到毛囊干细胞因子；
S2、脂肪干细胞因子的制备：抽取人体脂肪组织，高速离心后，去除脂肪上层油脂和底层血性液体，获取中层纯脂肪，用含有I型胶原酶、III型胶原酶的溶液对洗涤后的中层纯脂肪进行消化20-30分钟，消化结束后，离心6分钟，获得脂肪干细胞沉淀，加入8-12％胎牛血清、1％青霉素构成的DMEM培养基进行细胞培养；培养30～40h后，更换培养基，继续培养，待细胞密度为70％～80％时，即得到原代脂肪干细胞，再将原代脂肪干细胞进行工厂化放大培养，收集脂肪干细胞培养液上清液，脂肪干细胞培养液上清液经浓缩、蛋白含量测定、质检，得到脂肪干细胞因子；
S3、将脂肪干细胞因子和毛囊干细胞因子混合，得到复合细胞因子浓缩液，将复合细胞因子浓缩液与冻干保护剂混合，混合后冷冻干燥，得到干细胞生发冻干粉，即为毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子。
2.根据权利要求1所述的毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子制备方法，其特征在于：所述步骤S1中的中性蛋白酶的浓度为0.3U/ml-0.6U/ml。
3.根据权利要求1所述的毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子制备方法，其特征在于：所述步骤S3中的冷冻干燥条件为：温度在-25～-40℃，压强维持在10-30pa，时间为18-28h。
4.根据权利要求1所述的毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子制备方法，其特征在于：所述步骤S1中毛囊干细胞培养上清液与步骤S2中脂肪干细胞培养上清液浓缩的方法具体是：先将收集的毛囊干细胞培养上清液和脂肪干细胞培养的上清液分别采用0.22μm滤膜过滤；然后，分别通过30-40KD超滤膜，收集透析液，再将透析液通过100-120D超滤膜，收集截留液，截留液经蛋白含量测定、质检，分别得到毛囊干细胞因子和脂肪干细胞因子。
5.根据权利要求1所述的毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子制备方法，其特征在于：所述步骤S3中毛囊干细胞因子和脂肪干细胞因子按照1∶2～3的比例进行混合。
6.根据权利要求5所述的毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子制备方法，其特征在于：所述步骤S3中毛囊干细胞因子和脂肪干细胞因子按照1∶2的比例进行混合。
7.根据权利要求1所述的毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子制备方法，其特征在于：所述步骤S1中收集的毛囊干细胞培养液上清液为P3-P6代毛囊干细胞培养液上清液。
8.根据权利要求1所述的毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子制备方法，其特征在于：所述步骤S2中收集的脂肪干细胞培养液上清液为P3-P6代脂肪干细胞培养液上清液。
9.毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子的应用，其特征在于：将权利要求1-8任一所述方法制备的毛囊干细胞与脂肪干细胞复合生长因子用于脱发患者的毛发再生。
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