CN104644522A - 透皮美容的组合制剂和试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种透皮美容的组合制剂，该制剂包括基质细胞悬液和半凝胶活性生物面膜。组合制剂的制备方法是采集人体外周血为原料，从中分离得到PBMC和PRP，通过体外增殖将PBMC制备成为基质细胞悬液，并在PRP中加入部分基质细胞悬液、EGF、bFGF、制备成半凝胶面膜。这种组合制剂还可以与胶原面膜、微针组成试剂盒。本发明的组合制剂和试剂盒，采用生物技术联合物理疗法美容，具有改善皮肤的亚健康状态，能减轻或消除皮肤皱纹、延缓或逆转皮肤衰老等作用。

Description

透皮美容的组合制剂和试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及透皮美容的组合制剂和试剂盒，采用生物技术联合物理疗法美容，具有改善皮肤的亚健康状态，能减轻或消除皮肤皱纹、淡化疤痕、延缓或逆转皮肤衰老等作用，属于医学美容技术领域。

背景技术

皮肤是维护人体生命和健康的重要组成部分，直接与外界接触，是机体的第一道屏障，极易受到环境的影响而导致损伤。除了年龄带来的老化因素外，应激反应，污染，紫外线都是引起皮肤衰老的重要原因。随着社会人口老龄化和环境的劣化，人们越来越需要长效，高效的调节性和预防性护肤品。皮肤衰老主要表现在两个方面，一是胶原蛋白在各种蛋白酶的作用下降解流失，皮肤失去弹性形成皱纹；二是皮肤表面黑色素细胞活化产生色素沉着，逐渐产生黄褐斑，老年斑等各种色斑。为了解决上述问题，人们开发了无数美容产品和方法。

PBMC为peripheral blood mononuclear cells的缩写，中文为“外周血单个核细胞”，指血循环中的单个核细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。CN103385890A中公开了一种提取分离健康人血中的PBMC，将分离所得的PBMC经细胞分裂原植物血凝素(PHA)体外刺激后，体外培养，转化增殖，制成活细胞制剂用于女性亚健康状态、延缓功能减退和抗衰老，从而使女性皮肤亮丽光泽、驻颜焕采。使用时，将所述制剂以注射用生理盐水重悬，调整细胞浓度，以皮下多点注射的接种方式进行治疗，每次间隔3-4周，3次为一疗程，疗效可维持0.5-1年左右。该细胞制剂皮下注射后，可使机体T淋巴细胞的数量、活化信号转导水平、活化增殖能力显著提高，促进正向免疫效应性及负向调节性T淋巴细胞平衡、正负向协同刺激因子表达平衡、Th1/Th2细胞因子表达平衡，从而刺激机体的免疫细胞、调节整体免疫功能。然而PBMC在体外培养的过程中，存在需要保持其中干细胞的体外扩增数量和分化状态，并且需要保证一定的扩增速度，在CN103385890A中是采用添加PHA来进行刺激，但是PHA很昂贵，大大提高了PBMC制剂的成本，影响了该技术的商业化推广，并且在制剂中所增殖的活细胞中仍然可能残留着少许PHA，在体内注射时，机体仍会对此产生不必要的免疫应答，带来副作用。而且其所使用的细胞不一定是自体细胞，在使用过程中如果异体给药，仍然存在排异反应的风险。并且PBMC即使加入细胞生长因子等诱导，生长和增殖仍然十分缓慢，要得到足够的可注射细胞制剂，一般需要7-10天以上，而较长时间的培养和传代，有可能导致细胞的退化和过度分化，以致影响美容的效果。

PRP为Platelet rich plasma的缩写，中文为“高浓度血小板血浆”，PRP具有迅速止血、止痛、加速伤口愈合的作用。PRP美容用自身血液制作出富含高浓度血小板和自身生长因子的血浆，其中含有纤维连接蛋白和纤粘蛋白，通过重新注射到真皮组织中，可以提高皮肤内胶原蛋白和弹力纤维的含量，能促进细胞的黏连生长。而细胞的黏连是机体结构得以维持、细胞生长完成的必要条件。还可以利于上皮细胞的迁移和增殖来修复伤口。PRP能够促进细胞的更替，从而从根本上解决了因细胞衰弱，老化，缺水等原因造成的皱纹和疤痕，也解决了皮肤的毛孔粗大以及肌肤组织缺失的问题。并且该方法利用自身血液提炼富含高浓度生长因子的血清进行治疗，不会引起排异反应；提取液中还富含大量白细胞，极大程度降低感染机率。樊明山(富血小板血浆在皮肤抗衰老中作用机制的研究进展，中国美容医学，2012年，21(10)上，1874-1876)对该技术作了详细的综述。

但是上述两种生物技术美容方法在治疗过程中，为了达到较好的效果，由于需要采用面部多部位局部注射，给药过程疼痛感较强，并且对于注射的操作者的技术要求较高，注射过程中还容易引起局部红肿、出血、瘀血、过敏、水泡等应激性反应，使得术后恢复期较长，处理不好还有可能会引起纤维组织过度增生，影响美容效果。

通常情况下，由于皮肤角质层的阻碍作用，蛋白质药物、多肽类药物或基因药物不易透过皮肤进入体内。现有技术中采用微针给药技术，在皮肤的角质层上形成微小的药物传输通路，令细胞生长因子及多种营养元素经细小管道直接渗入皮肤深层，吸收率大大提高，可使蛋白质药物、多肽类药物或基因药物的透皮传输更为容易，因此结合微针和大分子药物组合制剂组合以提高大分子药物组合制剂的透皮率，从而使药物有效进入体内而实现更为优异的药效。例如，洪霞等(微针结合表皮生长因子在面部皮肤年轻化治疗中的应用，中国美容医学，2012年，21(8)上，1351-1352)对面部皮肤老化患者在皮肤表面使用微针(长0.25～0.5mm)后，涂抹谷胱甘肽和氨甲环酸用于治疗黄褐斑，再结合表皮生长因子(EGF)面膜敷面20～30min，24h内面部不沾水、不涂抹护肤品，每次治疗后采用EGF原液，5次为一疗程，治疗后90％以上患者皮肤改善显著。

在美容实践中，虽然有PRP结合微针使用的疗法，但是由于单纯靠微针的刺激和导入作用，PRP所能起到的修复作用有限，实际应用中还是必须采用结合PRP面部多部位局部注射，才能达到较为理想的效果，并且为加强效果所使用微针也较长，因此患者在治疗过程中仍然不能避免疼痛、出血、感染的风险。而PBMC在用于皮肤的修复和美容时，所培养的细胞为活细胞，直径大约为14-20μM，远小于一般微针的直径大小，也小于纳米微针的直径大小，但是由于培养增殖后的单个核细胞的迁移性较差，仅依靠微针对皮肤表面造成的创口，PBMC直接在皮肤表面使用，活细胞透过角质层的数量十分有限，很难起到理想的修复和美容效果。因此，如何能提高皮肤修复和美容效果的前提下，尽可能地采用让患者在美容过程中减少痛苦，仍是有待解决的问题。

技术内容

本发明的目的在于提供一种透皮美容的组合制剂和试剂盒，及该组合制剂的制备方法和使用方法。该透皮美容的组合制剂具有改善皮肤的亚健康状态，能减轻或消除皮肤皱纹、淡化疤痕、延缓或逆转皮肤衰老等作用。

本发明提供的透皮美容的组合制剂，包括基质细胞悬液和半凝胶活性生物面膜，基质细胞悬液和半凝胶活性生物面膜中均含有从外周血中分离得到PBMC和PRP。

本发明还提供了该制剂的制备方法，包括下述步骤：

1)采集人体外周血，

2)从外周血中分离得到PBMC和PRP，

3)通过体外增殖将PBMC制备得到活细胞，加入部分PRP，制备得到基质细胞悬液，

4)取剩余的PRR，与凝胶基质、部分基质细胞悬液、细胞因子混合制备得到半凝胶活性生物面膜。

其中，步骤1中的外周血可以用自体血液，步骤4中的细胞因子包括EGF、bFGF、VEGF、NGF、SCF中的一种或几种，并且所述细胞因子可以是市售的产品或为自制：凝胶基质包括琼脂、葡聚糖、卡波姆、聚丙烯酸树脂、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、黄原胶中的一种或几种。步骤3的PBMC增殖所用的培养液和步骤4的半凝胶活性生物面膜中加入一种中药提取物，添加比例为培养液或半凝胶活性生物面膜∶中药组合物＝4∶1(v/v)；该组合物是用重量配比为黄芪∶桃仁∶麦冬＝5∶2∶3，第一次加入6倍量(w/w)的水煎煮，第一次加入3倍量的水煎煮，合并两次提取液，过滤，杀菌，浓缩成2倍量(w/w)，即得。

本发明还提供了一种透皮美容的试剂盒，包括

a)本发明的基质细胞悬液，

b)本发明的半凝胶活性生物面膜，

c)胶原面膜，

d)微针。

其中实施本发明的微针可以是滚轮微针、纳米微针或MEMS微针阵列，试剂盒中的胶原面膜中含有大量胶原蛋白或水解胶原蛋白。

本发明还提供了一种透皮美容的方法，包括下述步骤：

1)清洁皮肤，

2)用微针处理面部皮肤，

3)向脸部慢慢滴加基质细胞悬液，不断单指画圈慢慢涂抹，防止悬液流掉，

4)向脸部涂抹半凝胶活性生物面膜，不断单指画圈慢慢涂抹，包括眼皮和上嘴唇等部位，最后涂抹完在脸部形成薄膜，

5)向脸部覆盖胶原面膜，

6)冰敷按摩40分钟。

其中步骤2之前可以采用激光射频处理皮肤。

有益效果

本发明透皮美容的组合制剂和试剂盒，能够减轻或消除皮肤皱纹、淡化疤痕、延缓或逆转皮肤衰老。该组合制剂与现有技术相比，主要优势体现在以下几点：

1)采用微针在皮肤上制造的暂时通道结合胶原面膜覆盖后所形成的局部半凝胶的微环境，联合导入PBMC和PRP、细胞因子，避免了现有技术中必须依靠面部多部位局部注射才能较好导入PBMC和PRP的方式，操作简单，患者痛苦小，疗效确切。本发明组合物在使用过程中无局部红肿、出血、瘀血、过敏、水泡等应激性反应，无明显疼痛，术后恢复快，第2天就可正常洗脸，效果持续时间长，可维持1-2年。

2)本发明生物面膜的特别的半凝胶形式，在皮肤和胶原面膜之间形成了一种类似三维细胞培养的立体基质结构，与细胞生长的体内环境及其类似，使得活细胞能在其中较为容易迁移，结合手法按摩，促使活细胞经过微针所造成的暂时孔道穿过角质层，使其在皮肤表皮或更深起到修复效果。并且为上述细胞提供了一个优越的生长环境，并且PRP的存在也提高了活细胞的增殖和存活率，详情见图1和图2。

3)本发明可以采用自体的PBMC和PRP制备，最大程度降低了排异反应。

4)本发明还可以通过在PBMC增殖所用的培养液和半凝胶活性生物面膜中加入特制的中药提取物，进一步提高培养细胞的活力，增值速度快、移行性提高，美容效果更好。与现有技术相比，原料成本、时间成本大大降低。

5)本发明由于创伤小，恢复快，可以在比较短的时间里做完一个疗程，也可以结合激光射频等其他美容方式一起使用。

下面结合附图及具体实施例和实验例对本发明做进一步的说明。下述实施例仅是本发明技术方案的示范，本领域技术人员可以在此基础上，结合本领域的常规技术手段在此基础上得到的方案，均包含在本发明的保护范围之内。

附图说明

图1是在1％PRP和PRP中活细胞生长1天、3天的图对比。

图2是在半凝胶活性生物面膜中活细胞生长1天、2天、3天、4天的状况对比图。

图3是PRP中培养的活细胞的显微成像图。

图4是使用者左脸在使用本发明活性面膜3个月前后的效果对比图，左图为使用前的照片，右图为使用后的照片。

图5是使用者右脸在使用本发明活性面膜3个月前后的效果对比图，左图为使用前的照片，右图为使用后的照片。

图6是使用者前额、眼袋在使用本发明活性面膜3个月前后的效果对比图，左图为使用前的照片，右图为使用后的照片。

具体实施方式

实验材料：

耗材：10ml EDTA抗凝采血管；50ml离心管；75cm²培养瓶；移液管；BD动脉血气针。

试剂：Ficoll；RPMI 1640；DMEM/F12(1∶1)；EGF；bFGF；低熔点琼脂糖；葡聚糖；生理盐水等。

实施例1自体PBMC和PRP的制备

1)面部美容客户采集外周血，每人采集70ml，满足客户3次面部美容使用；

2)运输箱4℃运输，在4h内送到实验室，进行分离纯化：

3)采集的50ml外周血离心，收集PRP血浆，于4℃冰箱无菌保存，分装3份待3次制备面膜使用；

4)离心后的血细胞稀释(外周血∶生理盐水＝1∶2)，在离心管中加入Ficoll(淋巴细胞分离液)，缓缓加入血细胞稀释液，2000rpm离心20min，吸出PBMC白膜层，PBS洗两次，得到单个核细胞，最后计数，得到PBMC。

实施例2基质细胞悬液的制备

1)将实施例1分离纯化的单个核细胞用RPMI 1640重悬，并用RMPI1640稀释到3*10⁶，加入到75cm²培养瓶中10ml，于5％CO₂，37℃培养箱中孵育1h；

2)细胞贴壁后弃培养液，用1*PBS洗涤一次，加入DMEM/F12(1∶1)培养液(含10％胎牛血清，10ng/ml EGF)；

3)细胞培养到第2天换液，加入DMEM/F12(1∶1)新鲜培养液继续培养到第3～5天；

4)出厂日用胰酶消化培养细胞，用生理盐水洗涤3次；用1ml客户自体PRP重悬。

实施例3半凝胶活性生物面膜的制备

1)制备0.5％软琼脂：于微波炉中溶解，立即送到细胞实验室中，取1ml溶解好的0.5％低熔点软琼脂加入到4ml客户自体PRP中，并混匀，

2)加入实施例2中制备好的胰酶消化培养细胞，并加入200ngEGF和200ngbFGF，混匀，即得。

实施例4中药提取物制备

取黄芪∶桃仁∶麦冬＝5∶2∶3，第一次加入6倍量(w/w)的水煎煮，第一次加入3倍量的水煎煮，合并两次提取液，过滤，杀菌，浓缩成2倍量(w/w)，即得。

实施例5基质细胞悬液的制备

1)将实施例1分离纯化的单个核细胞用RPMI 1640重悬，并用RMPI1640稀释到3*10⁶，加入到75cm²培养瓶中10ml，于5％CO₂，37℃培养箱中孵育1h：

2)细胞贴壁后弃培养液，用1*PBS洗涤一次，加入DMEM/F12(1∶1)培养液(含10％胎牛血清，10ng/ml EGF)，再加入培养液1/4体积的实施例4的中药提取物；

3)细胞培养到第2天换液，加入DMEM/F12(1∶1)新鲜培养液，再加入培养液1/4体积的实施例4的中药提取物，续培养到第3～5天：

4)出厂日用胰酶消化培养细胞，用生理盐水洗涤3次；用1ml客户自体PRP重悬。

实施例6半凝胶活性生物面膜的制备

1)制备0.6％葡聚糖：取1ml溶解好的0.6％葡聚糖加入到4ml客户自体PRP和1ml实施例4的中药提取物，并混匀：

2)加入实施例2中制备好的胰酶消化培养细胞，并加入250ngEGF和250ngbFGF，混匀，即得。

实施例7半凝胶活性生物面膜的制备

1)制备0.45％羧甲基纤维素钠和1％明胶：取1ml溶解好的0.45％羧甲基纤维素钠和1％明胶加入到4ml客户自体PRP，并混匀；

2)加入实施例2中制备好的胰酶消化培养细胞，并加入200ngEGF和200ngbFGF，混匀，即得。

实施例8活性生物胶原面膜的制备

将实施例3、6或7制备的半凝胶活性生物面膜基质均匀覆盖在市售胶原面膜上，即得活性生物胶原面膜。

实验例1观察活细胞在不同浓度PRP培养基中的生长状况和活力变化

将活细胞分别采用实施例2的1％PRP和PRP培养3天，实验结果见图1。从图1中可见，随着PRP浓度的提高，细胞生长更旺盛、活力更强。

实验例2观察活细胞在不同半凝胶活性生物面膜中的生长状况和活力变化

将活细胞分别置于实施例3、6、7制备的半凝胶活性生物面膜中培养4天，实验结果显示，在3种半凝胶活性生物面膜中培养4天后，细胞都有一定程度的增殖和生长，表现为细胞密度、数量、活力的提高。实施例7的半凝胶活性生物面膜中第1-4天的细胞增殖过程见图2。

在该实验中，其中实施例6的半凝胶活性生物面膜中的细胞增殖最快、密度最高，增值效果优于实施例3、7的半凝胶活性生物面膜中培养的细胞。

实验例3本发明美容制剂和试剂盒的使用

实验对象：随机分组选取女性20名，年龄28-65岁，无凝血障碍性疾病、无急性和慢性感染、慢性肝病、肿瘤等疾病，治疗过程中未接受抗凝治疗。实验对象中，存在下述皮肤问题：

1.皱纹：额头纹、川字纹、鱼尾纹、眼周细纹、鼻背纹、法令纹、嘴角皱纹、颈纹；

2.面部皮肤松弛、粗糙、暗淡；

3.创伤、痤疮等引起的凹陷性疤痕；

4.改善炎症后色素沉着、色素改变(色斑)、晒斑、红斑、黄褐斑；

5.毛孔粗大、毛细血管扩张；

6.眼袋、黑眼圈。

实验方法：

采集外周血(第1天)：入组为采集外周血70ml；

第一次治疗(采血后第5天)：根据患者皮肤情况酌情先行射频术，射频温度不能太高，并不断监测面部皮肤温度，防止对皮肤产生创伤；然后进行第一次治疗。活细胞洁净无菌车间制备完之后，入组者按照入组情况进行美容流程：美容操作前、后进行美容评价(照像)；

第二次治疗(第一次治疗一个月之后)：第2次活细胞洁净无菌车间制备完之后，入组者按照入组情况进行美容流程；医学美容前对上次进行评价，并在美容前、后同样进行美容评价(照像)；

第三次治疗(第二次治疗一个月之后)：第3次活细胞洁净无菌车间制备完之后，入组者按照入组情况进行美容流程；医学美容前对上次进行评价，并在美容完之后同样进行美容评价。

使用高分辨率相机对入组者拍照，应在美容院固定的拍照室进行拍摄。时间点：每次医学美容前、后进行拍照评价。

美容流程：

a)入组者躺卧在手术台上，使用洁面乳进行面部清洁，清水擦洗干净；

b)对面部进行处理，包括眼皮和上嘴唇等部位，可对面部进行2-3次处理，滚轮微针(0.25mm)处理面部(依据情况考虑是否有表麻，最好不用)；

c)理完之后，向脸部慢慢滴加活细胞悬液，不断单指画圈慢慢涂抹，防止悬液流掉：

d)滴加完活细胞悬液，将4ml的PRP+细胞因子半凝胶面膜涂抹在脸部，不断单指画圈慢慢涂抹，包括眼皮和上嘴唇等部位；(该步骤采用是实施例3的方法制备的半凝胶面膜)

e)涂抹完半凝胶面膜后，附上一片胶原面膜，冰覆按摸40分钟。

注意事项

●对面部微针处理，应保持90度垂直扎下，并到达一定深度，防止对皮肤产生拉伤，对于肤色深的地方可用微针扎2-3次；

●涂抹半凝胶面膜应单指画圈，最后涂抹完在脸部形成薄膜；

●入组者医学美容当天晚上不需要洗脸，从第2天开始连续用清水轻轻洗脸。

实验结果：

在进行三次治疗后，所有受试者的皮肤都得到了不同程度的改善，具体表现在面部深皱纹变浅、浅皱纹消失、凹陷的疤痕得到填充；面部皮肤松弛、粗糙、暗淡得到改善：毛孔缩小：眼袋、黑眼圈得到显著改善：皮肤的色素沉淀变浅：红血丝得到改善。

选择了1名受试者进行实验前后的面部局部对比照片，参见附图4、5、6，从图中可见：受试者的额头和眼周围的深皱纹显著变浅、面部皮肤光滑度提高、肤色变亮、面部色斑面积变小并且颜色变浅，眼袋明显缩小，达到了的明显的美容效果。

Claims (10)

1.一种透皮美容的组合制剂，其特征在于该制剂包括基质细胞悬液和半凝胶活性生物面膜，基质细胞悬液和半凝胶活性生物面膜中均含有从外周血中分离得到PBMC和PRP。

2.根据权利要求1所述的透皮美容的组合制剂，其特征在于该制剂的制备方法如下：

1)采集人体外周血，

2)从外周血中分离得到PBMC和PRP，

3)通过体外增殖将PBMC制备得到活细胞，加入部分PRP，制备得到基质细胞悬液，

4)取剩余的PRR，与凝胶基质、部分基质细胞悬液、细胞因子混合制备得到半凝胶活性生物面膜。

3.根据权利要求2所述的透皮美容的组合制剂，其中的细胞因子包括EGF、bFGF、VEGF、NGF、SCF中的一种或几种，凝胶基质包括琼脂、葡聚糖、卡波姆、聚丙烯酸树脂、聚乙烯醇、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、黄原胶中的一种或几种。

4.根据权利要求2所述的透皮美容的组合制剂，其中步骤3的PBMC增殖所用的培养液和步骤4的半凝胶活性生物面膜中加入一种中药提取物，添加比例为培养液或半凝胶活性生物面膜∶中药组合物＝4∶1(v/v)；该组合物是用重量配比为黄芪∶桃仁∶麦冬＝5∶2∶3，第一次加入6倍量(w/w)的水煎煮，第一次加入3倍量的水煎煮，合并两次提取液，过滤，杀菌，浓缩成2倍量(w/w)，即得。

5.一种透皮美容的试剂盒，包括

a)权利要求1-4中任一项所述的基质细胞悬液，

b)权利要求1-4中任一项所述的半凝胶活性生物面膜，

c)胶原面膜，

d)微针。

6.根据权利要求5所述的透皮美容的试剂盒，其中的微针是滚轮微针、纳米微针或MEMS微针阵列。

7.根据权利要求5所述的透皮美容的试剂盒，其中的胶原面膜中含有大量胶原蛋白或水解胶原蛋白。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的透皮美容的组合制剂的制备方法，包括

1)采集人体外周血，

2)从外周血中分离得到PBMC和PRP，

3)通过体外增殖将PBMC制备得到活细胞，加入部分PRP，制备得到基质细胞悬液，

4)取剩余的PRR，与凝胶基质、部分基质细胞悬液、细胞因子混合制备得到半凝胶活性生物面膜。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的透皮美容的组合制剂和权利要求5-7所述的透皮美容的试剂盒的使用方法，包括

1)清洁皮肤，

2)用微针处理面部皮肤，

3)向脸部慢慢滴加基质细胞悬液，不断单指画圈慢慢涂抹，防止悬液流掉，

4)向脸部涂抹半凝胶活性生物面膜，不断单指画圈慢慢涂抹，包括眼皮和上嘴唇等部位，最后涂抹完在脸部形成薄膜，

5)向脸部覆盖胶原面膜，

6)冰敷按摩40分钟。

10.根据权利要求10的使用方法，在步骤2之前可以采用激光射频处理皮肤。