CN108815114B - 一种美容针剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医疗美容技术领域，具体为一种美容针剂及其制备方法。本发明通过对同一次采集的外周血分别分离收集浓缩血小板和自体活性细胞，使美容针剂同时包含来自同一份外周血样本的浓缩血小板和自体活性细胞，不仅在修复皮肤等方面或有更好的效果，产品效用更加全面，还可以最大限度地提高血液利用率。本发明的美容针剂同时包括自体活性细胞和浓缩血小板，二者混合使用，自体生长因子及其他细胞因子的合成及分解用于稳定因组织损伤引起的内环境的紊乱，且制备方法简易，成本相对较低，来源丰富，并且不用考虑伦理问题。

Description

一种美容针剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗美容技术领域，尤其涉及一种美容针剂及其制备方法。
背景技术
自体活性细胞是通过采集自身外周血，通过分离和收集得到大量外周血单个核细胞，用添加了多个自体活性细胞因子的培养基培养扩增。这群异质性的混合细胞群体，具有一定的参与免疫应答或与免疫应答相关的能力，分泌因子调节内环境稳态；在损伤、炎症等应激状态下，有一定的调节和维持血液系统各个细胞组分的生理平衡的能力。
浓缩血小板是通过自体静脉血的离心等操作而得到的富含大量生长因子的血小板浓缩物，每个血小板含有近50-80个α-颗粒，α-颗粒直径虽只有200-500纳米，却包含着近300种生物活性蛋白，这些成分在稳定内环境及组织损伤修复中起重要作用。但只有通过脱颗粒才能使这些生长因子(如血小板源性生长因子(PDGF)，转化生长因子β1、β2(TGF-β1、β2)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，类胰岛素生长因子(IGF)以及表皮生长因子(EGF)等)大量释放。富血小板血浆的作用的基本原理是使组织损伤局部的生长因子增高，通过生长因子对组织的修复来达到治疗的目的。其中血小板源性生长因子(PDGF)可以刺激成纤维细胞的生成、趋化、刺激转化生长因子β1合成胶原等；转化生长因子β1(TGF-β1)调节成纤维细胞的增殖、促进细胞外基质的形成、提高成纤维细胞合成胶原含量、抑制软骨中白细胞介素-1对蛋白聚糖合成的调节作用；成纤维细胞生长因子(FGF)能够产生胶原、刺激血管形成、使肌细胞增殖；血管内皮生长因子(VEGF)可提高组织内新生血管含量等。有研究表明，富血小板血浆可增加增加细胞周期中G1期调控表达，同时提高了Ⅰ型胶原及人成纤维细胞中基质金属蛋白酶-1的表达。综上所述，这些生长因子可帮助皮肤减缓衰老，提高胶原含量和组织内新生血管含量，使皮肤呈现活力与光泽。研究如何更好更有效的利用外周血中的这些生长因子，以及如何更高效的利用外周血，具有十分重大的意义。
发明内容
本发明针对现有技术的上述问题，提供一种利用外周血制备的美容针剂，以及该种美容针剂的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种美容针剂，包括自体活性细胞和浓缩血小板，所述自体活性细胞和浓缩血小板均从同一自体外周血中分离而得。
以上所述美容针剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、离心分离外周血样本，分别收集血浆层和浓缩血细胞层。
优选的，步骤S1中，离心分离外周血样本的离心参数为400×g，离心时间为15min。
S2、离心分离步骤S1收集的血浆层，分别收集上层血清和血小板沉淀；然后用血清重悬血小板沉淀，得浓缩血小板。
优选的，步骤S2中，离心分离步骤S1收集的血浆层的离心参数为1500×g，离心时间为15min。
优选的，步骤S1中的外周血样本的量为30mL时，步骤S2中所述用血清重悬血小板沉淀时，血清的用量为1-3mL。
浓缩血小板若需要长时间保存时，向步骤S2得到的浓缩血小板中加入DMSO，然后置于-80℃的环境中保持。
复苏的方法：取出置于-80℃环境中的浓缩血小板，将浓缩血小板放入37℃的水浴中，融化后加入常温生理盐水并离心洗涤，然后用1-2mL的血清重悬，得到复苏后浓缩血小板。
优选的，步骤S1和步骤S2中，进行离心分离的环境温度为22-30℃。
S3、用生理盐水稀释步骤S1收集的浓缩血细胞层至两倍体积，得稀释液；然后将稀释液加到Ficoll分离液的上面，接着进行离心分离，收集白膜层并洗涤，收集得到外周血单个核细胞。
优选的，步骤S3中，稀释液与Ficoll分离液的体积比为2:1。
优选的，步骤S3中，稀释液与Ficoll分离液进行离心的离心参数为700×g，离心时间为20min。
S4、用培养基对步骤S3收集的外周血单个核细胞进行培养，优选培养5天，离心收集细胞沉淀，然后用0.9％氯化钠注射液重悬细胞沉淀并加入生理盐水进行离心洗涤，用自体血浆重悬洗涤后的细胞沉淀，得到自体活细胞。
优选的，步骤S4中，所述培养基由DMEM/F12培养基、B-27B-27无血清添加剂和BFGF组成，每500mL DMEM/F12培养基加入10mL B-27B-27无血清添加剂和3ul BFGF；所述DMEM/F12培养基中DMEM与F12的体积比为1:1。
优选的，步骤S4中，细胞培养后离心收集细胞沉淀的离心参数为500×g，离心时间为6min。
优选的，步骤S4中，用5mL自体血浆重悬洗涤后的细胞沉淀，得到自体活细胞。
优选的，步骤S4中，培养外周血单个核细胞中，培养瓶的细胞密度为1×106-2×106/mL。
优选的，步骤S4中，用步骤S1收集到的部分血浆重悬洗涤后的细胞沉淀。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过对同一次采集的外周血分别分离收集浓缩血小板和自体活性细胞，使美容针剂同时包含来自同一份外周血样本的浓缩血小板和自体活性细胞，不仅在修复皮肤等方面或有更好的效果，产品效用更加全面，还可以最大限度地提高血液利用率。本发明的美容针剂同时包括自体活性细胞和浓缩血小板，二者混合使用，自体生长因子及其他细胞因子的合成及分解用于稳定因组织损伤引起的内环境的紊乱，且制备方法简易，成本相对较低，来源丰富，并且不用考虑伦理问题。
附图说明
图1为实施例中外周血单个核细胞扩增培养后的自体活性细胞图；
图2为实施例中外周血单个核细胞扩增培养后的自体活性细胞流式检测图(Vimentine)；
图3为实施例中外周血单个核细胞扩增培养后的自体活性细胞流式检测图(CD42b)；
图4为实施例中外周血单个核细胞扩增培养后的自体活性细胞流式检测图(CD31)。
具体实施方式
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
实施例
本实施例提供一种利用外周血制备的美容针剂，以及该种美容针剂的制备方法。
本实施例的美容针剂包括自体活性细胞和浓缩血小板，所述自体活性细胞和浓缩血小板均从同一自体外周血中分离而得。
本实施例的美容针剂的制备方法，具体步骤如下：
1)采集健康志愿者外周血30ml，血小板密度为1.71×108/ml，分配至离心管中，400×g室温(22-30℃，离心机设定温度在此温度范围内)离心15min，用巴氏吸管收集黄色或深黄色的血浆层(浊液)，剩余液体为浓缩血细胞。
2)浓缩血小板的制备：将步骤1)中收集的血浆层，1500×g室温离心15min，血小板沉淀后，将上层血清收集至离心管中，然后取适量血清(1-3mL)与血小板沉淀重悬成悬浊液，得浓缩血小板。计数浓缩血小板中血小板的密度为1.48×109/ml。
3)浓缩血小板保存：向制得的浓缩血小板缓慢加入DMSO(终浓度4-6％)，置于-80℃超低温冰箱中保存。
4)浓缩血小板复苏：将冻存的浓缩血小板混合物放入37℃水浴锅中复苏，完全融化后轻轻混匀，立刻取样进行检测。在装有浓缩血小板的离心管中加入常温生理盐水，1500×g离心15min洗涤，洗涤两次后用1-2ml血清重悬为终产品，立刻进行计数，放置1h，混匀后再次计数，结果如下表1所示。
5)白膜层提取：用生理盐水稀释步骤1)收集的浓缩血细胞层至两倍体积，得稀释液；将Ficoll分离液加入离心管的底部，将稀释液缓慢的加到Ficoll分离液上层，血液稀释液与Ficoll分离液的体积比为2:1，700×g离心20min，吸取离心管内的白膜层(外周血单个核细胞)，移到50mL离心管内并补加生理盐水至50mL，洗涤二次离心收集外周血单个核细胞。
6)自体活性细胞制备：用培养基步骤5)收集的外周血单个核细胞，分装在培养瓶中，种瓶细胞密度为1×106-2×106/mL，将培养瓶放入细胞培养箱中培养5天，镜下拍照，用细胞刮刀小心将贴壁细胞刮下，500×g离心6min收集细胞，弃上清后补加0.9％氯化钠注射液重悬细胞沉淀并加入生理盐水定容至15ml，清洗两次后，用5ml自体血浆(步骤1收集到的部分血浆)重悬洗涤后的细胞沉淀，得到自体活细胞产品。
所述培养基由DMEM/F12培养基、B-27B-27无血清添加剂和BFGF组成，每500mLDMEM/F12培养基加入10mL B-27B-27无血清添加剂和3ul BFGF；所述DMEM/F12培养基中DMEM与F12的体积比为1:1。
本实施例中，使用invitrigen公司的B-27B-27无血清添加剂产品(B-27Serum-Free Supplement)。
在步骤6)中，取少了洗涤后的细胞沉淀用0.9％氯化钠注射液重悬，进行流式检测，检测结果如下表2及图2-4所示。
表1 对冻存的浓缩血小板进行计数的结果
Figure BDA0001729808140000061
Figure BDA0001729808140000071
表1可以看出不同样品中血小板PLT密度和数量，结果可知分离出的PRP比全血密度升高约8.7倍，提取出的PLT数量为2962×106/ml，经过冻存复苏后数量为3218×106/ml，表明实验期间PRP经过冻存基本无损失。
表2 自体活性细胞流式检测结果
占单核细胞中的比例(％)
Vimentine 96.6
CD42b 15.9
CD31 95.5
根据流式检测结果可知，样品中有相对较多的内皮细胞(CD42b、CD31)，理论上具有一定程度的损伤修复和调节血管张力能力等；有相对较多波形蛋白(Vimentine)，是中间丝的其中一种蛋白质，是维持细胞骨架完整性必不可少的成分；此外还有一定量的血小板。
本实施例通过对同一次采集的外周血分别分离收集浓缩血小板和自体活性细胞，使美容针剂同时包含来自同一份外周血样本的浓缩血小板和自体活性细胞，不仅在修复皮肤等方面或有更好的效果，产品效用更加全面，还可以最大限度地提高血液利用率。
本实施例的美容针剂同时包括自体活性细胞和浓缩血小板，二者混合使用，自体生长因子及其他细胞因子的合成及分解用于稳定因组织损伤引起的内环境的紊乱，且制备方法简易，成本相对较低，来源丰富，并且不用考虑伦理问题。
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。

Claims (3)

1.一种美容针剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、在22-30℃、400×g条件下离心分离外周血样本，离心时间为15min，分别收集血浆层和浓缩血细胞层；
S2、在22-30℃、1500×g条件下离心分离步骤S1收集的血浆层，离心时间为15min，分别收集上层血清和血小板沉淀；然后用血清重悬血小板沉淀，得浓缩血小板；
S3、用生理盐水稀释步骤S1收集的浓缩血细胞层至两倍体积，得稀释液；然后将稀释液加到Ficoll分离液的上面，接着进行在700×g条件下离心分离，离心时间为20min，收集白膜层并洗涤，收集得到外周血单个核细胞；
S4、用培养基对步骤S3收集的外周血单个核细胞进行培养，培养瓶的细胞密度为1×106-2×106/mL，离心收集细胞沉淀，然后用0.9％氯化钠注射液重悬细胞沉淀并加入生理盐水进行离心洗涤，用自体血浆重悬洗涤后的细胞沉淀，得到自体活细胞；所述培养基由DMEM/F12培养基、B-27B-27无血清添加剂和BFGF组成，每500mLDMEM/F12培养基加入10mLB-27B-27无血清添加剂和3ul BFGF；所述DMEM/F12培养基中DMEM与F12的体积比为1:1；
将步骤S2所得的浓缩血小板和步骤S4所得的自体活性细胞混合，得到美容针剂；所述自体活性细胞和浓缩血小板均从同一自体外周血中分离而得。
2.根据权利要求1所述的美容针剂的制备方法，其特征在于，步骤S1中，外周血样本的量为30mL时，步骤S2中，所述用血清重悬血小板沉淀时，血清的用量为1-3mL。
3.根据权利要求1所述的美容针剂的制备方法，其特征在于，步骤S4中，用5mL自体血浆重悬洗涤后的细胞沉淀，得到自体活细胞。
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