CN113181215A - 一种骨髓间充质干细胞外泌体制剂及促进造血损伤恢复的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞技术领域，涉及一种外泌体制剂，包括骨髓间充质干细胞来源的外泌体和维生素的制剂。来源于骨髓分离的间充质干细胞后传代培养后纯化获得，可促进放化疗后患者的白细胞、血红蛋白、血小板的增殖，促进造血干细胞增殖，促进单个核细胞的CD34+细胞比例，从而达到促进放化疗后造血功能恢复的作用。

Description

一种骨髓间充质干细胞外泌体制剂及促进造血损伤恢复的 用途

技术领域

本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种骨髓间充质干细胞外泌体制剂及促进造血损伤恢复的用途。

背景技术

外泌体是特殊的膜外囊泡，其直径为30～150nm，密度为1.13～1.19g/mL，具有稳定的双分子磷脂结构，能保护其自身携带的DNA片段、miRNA、mRNA以及功能性蛋白等生物活性物质不被破坏。外泌体能通过组织液或血液运输至靶细胞，在作用于靶细胞后释放内容物激活胞内相关信号通路，进而发挥如细胞凋亡、血管生成、再生修复、炎症反应和免疫应答等生物学功能。

骨髓间充质干细胞是骨髓基质干细胞，是人们在哺乳动物的骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。它们对骨髓中的造血干细胞(HSC)不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子(如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等)来支持造血。在标准培养基条件下具有贴壁性；并特定的表面抗原表达，阳性表达如CD29、CD73、CD90、CD105等表面分子；较少表达如CD14、CD31、CD34、CD45、CD11b、CD79α、CD19以及HLA-DR等分子；骨髓间充质干细胞具有多向分化、免疫调节、组织修复和造血支持的功能，已在临床上用于治疗各种不同的疾病，包括骨缺损、移植物与宿主疾病、自身免疫性疾病、血液系统疾病等。因此，骨髓间充质干细胞在组织工程和再生医学应用中具有广阔的治疗前景。

骨髓间充质干细胞具有向中胚层起源细胞分化潜能及自我更新的干细胞特征，是骨髓造血微环境中重要的构成组分及前体成分，参与胚胎血细胞的生成及维持造血，其本身及其衍生分化的基质细胞参与构建不同的造血龛结构，包括成骨细胞龛、基质细胞龛和脂肪细胞龛，经由细胞间多种黏附分子及相应信号通路或可溶性细胞因子直接或间接协同调控造血细胞的生成和分化。

放、化疗是临床治疗恶性肿瘤的常用方法，然而其不良反应很多，其中对骨髓的损伤是最常见的不良反应。放、化疗容易损伤骨髓造血细胞及造血微环境，造成造血损伤。

文献表明间充质干细胞相比其他细胞能够产生足够数量的外泌体，其干细胞的增殖分化特性是通过外泌体进行调控的，间充质干细胞来源的外泌体包含细胞因子和生长因子、信号脂质、mRNAs和调节性miRNA。

叶酸又名维生素B9，是一种水溶性维生素，有促进骨髓中幼细胞成熟的作用，人类如缺乏叶酸，可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症。

维生素C能通过促进叶酸转变为四氢叶酸，从而促进红细胞的生成与成熟。

维生素B12又叫钴胺素，将甲基丙二酰辅酶A转化成琥珀酰辅酶A，参与三羧酸循环，其中琥珀酰辅酶A与血红蛋白的合成有关。促进红细胞的发育和成熟，使肌体造血机能处于正常状态，预防恶性贫血。

造血干细胞移植是能够重建患者造血的一种方法：造血干细胞能够向下分化为各种成熟血细胞及免疫细胞，如红细胞、血小板、淋巴细胞等，在受者体内完全重建整个造血系统。然而，相当一部分需要进行移植的患者缺乏人白细胞抗原(HLA)相合的供者，HLA配型是限制异基因造血干细胞移植发展的最大阻碍。半相合移植是解决HLA配型相合供者难寻的一个方法，但是，由于供受者之间配型的差异，影响供者顺利植入恢复造血。骨髓间充质干细胞的促进半相合供者植入、加快造血恢复的作用，使得半相合移植方案获得成功。

目前公认，骨髓间充质干细胞具有支持造血的功能。但是细胞的维持和扩增培养的成本高和时间长、输注的间充质干细胞在体内的总体含量很低、存活时间很短，制约了间充质干细胞的疗效。使用间充质干细胞分泌的可溶性细胞因子以达到其生物学作用也是可行的一条道路，但进入人生物体内后，细胞因子会被细胞外介质稀释，影响其疗效，同时细胞因子分离和储存难度大、费用高，也是制约其使用的重要方面。

CN110507668A公开了STRO-1+同质性骨髓基质干细胞来源的外泌体，包含干细胞和STRO-1+骨髓间充质干细胞来源的外泌体，用于治疗免疫相关疾病；涂超等，提出人骨髓来源间充质干细胞外泌体，通过激活Hedgehog信号通路可促进MG63和SGC7901细胞生长，通过通路抑制剂可抑制肿瘤生长；CN110721198A公开了骨髓间充质干细胞来源的外泌体和维生素、防腐剂组成制剂用于预防癫痫产生的脑损伤；周娟等，提出间充质干细胞源性外泌体的抗炎免疫调节功能；Aristea K.Batsali等记载了骨髓来源的间充质干细胞可用于造血功能治疗。

发明内容

然而，上述现有技术，没有对骨髓间充质干细胞特异性表达分子进行筛选，没有发现骨髓间充质干细胞外泌体制剂促进造血修复的作用，没有专门针对放化疗导致的造血功能障碍进行治疗，并且没有制作复合制剂，强化其促造血功能。因此亟待一种骨髓来源间充质干细胞制剂用于对放射治疗导致的造血功能障碍进行治疗。

针对上述现有技术的问题，本发明一个方面提供了一种外泌体制剂，其包括骨髓间充质干细胞来源的外泌体，或者其包括骨髓间充质干细胞来源的外泌体以及维生素组合物，所述的维生素组合物为维生素B9、维生素C和维生素B12的组合。

进一步的，所述外泌体来源于骨髓分离的间充质干细胞后传代培养后纯化获得。

进一步的，所述传代培养为三代次以上。

进一步的，所述外泌体特异性表达CD63和/或CD44。

进一步的，所述外泌体不表达HLA-DR、CD34、CD29、CD73中的任意一种或多种。

进一步的，所述外泌体与维生素B9、维生素C和维生素B12的质量比为2:1.8-2.2:4.5-5.5:0.8-1.2，优选为2:2:5:1。

本发明另一个方面提供了本发明上述外泌体制剂在制备促进外周血来源的单个核细胞增殖、促进单个核细胞向造血干细胞分化，以及提高单个核细胞中造血干细胞比例的试剂中的用途；所述外周血来源的单个核细胞为以粒细胞集落刺激因子动员后采集得到的外周血造血干细胞采集物中的淋巴细胞分离液分离出单个核细胞。

本发明另一个方面提供本发明上述外泌体制剂在制备用于促进造血损伤恢复的药物中的应用，其中造血损伤为放射治疗或化学药物治疗导致的。

进一步的，促进造血损伤恢复的表现为促进由于放射治疗或化学药物治疗导致外周血中白细胞、血红蛋白、血小板中一种或几种降低后向正常水平回归。

本发明另一个方面提供了维生素组合物在制备提高骨髓间充质干细胞来源的外泌体对促进外周血来源的单个核细胞增殖、促进单个核细胞中造血干细胞增殖，以及提高单个核细胞中造血干细胞比例的药物中的用途；所述的维生素组合物为维生素B9、维生素C和维生素B12的组合；所述外周血来源的单个核细胞为以粒细胞集落刺激因子动员后采集得到的外周血造血干细胞采集物中的淋巴细胞分离液分离出单个核细胞。

进一步的，所述维生素组合物中维生素B9、维生素C和维生素B12的质量比为1.8-2.2:4.5-5.5:0.8-1.2，优选为2:5:1。

本发明另一个方面提供了维生素组合物在制备提高骨髓间充质干细胞来源的外泌体对造血损伤恢复效果药物中的用途；所述的维生素组合物为维生素B9、维生素C和维生素B12的组合。

进一步的，促进造血损伤恢复的表现为促进由于放射治疗或化学药物治疗导致外周血中白细胞、血红蛋白、血小板中一种或几种降低后向正常水平回归。

进一步的，所述维生素组合物中维生素B9、维生素C和维生素B12的质量比为1.8-2.2:4.5-5.5:0.8-1.2，优选为2:5:1。

进一步的，外泌体来源于骨髓进行密度梯度离心分离的间充质干细胞后传代再进一步密度离心培养后获得，经过优化需传代培养三次以上可达到最大活性。维生素可以是B族维生素和/或C族维生素，具体选自维生素B9、维生素C、维生素B12中的一种或几种，几种维生素能够起到协同作用。其中骨髓间充质干细胞来源的外泌体可特异性表达CD63和/或CD44，而不表达HLA-DR，CD34，CD29，CD73；与骨髓间充质干细胞具有类似的标志物。

在外泌体制剂中，外泌体浓度为40μg/mL，维生素B9的含量为20μg/μL，维生素C的含量为50μg/μL，维生素B12含量为10μg/μL。

本发明还提供了外泌体制剂在制备用于促进造血损伤恢复的药物中的应用，其中造血损伤可以是放射治疗导致的，其中放射性治疗的放射剂量为1-3Gy，促进造血损伤恢复的表现为促进外周血中白细胞、血红蛋白、血小板中一种或几种的增殖，或促进造血干细胞增殖，和/或促进单个核细胞的CD34+细胞比例。

有益效果

本方案采用的是一种骨髓间充质干细胞来源的外泌体制剂用于造血损伤修复

1.本发明骨髓间充质干细胞外泌体制剂成分为P3骨髓间充质干细胞分泌的外泌体及维生素B9、维生素C、维生素B12。上述组分具有协同促进造血功能恢复的作用。

2.间充质干细胞外泌体能够发挥间充质干细胞的作用，还能避免了间充质干细胞细胞输注后的相关副作用，比如因细胞团块大所致的栓塞等。

3.外泌体提取方法简单易于操作。其更稳定、易保存、自身无生长增殖能力，无诱发肿瘤的风险；体积小，无微血管堵塞风险；此外是纳米级靶向载体，可以很好地利用增强渗透效应，不仅可透过血脑屏障、血脊髓屏障，还能选择性地渗入到受损组织部位；细胞转运效率高并且无免疫排斥的风险。

4.外泌体的囊泡结构可以保持内部蛋白及遗传物质的活性。外泌体可直接进入靶细胞，通过向靶细胞转运特异性蛋白、脂质及RNA等生物活性物质，来诱导靶细胞的增殖、迁移、血管化等生物学变化，从而改变局部微环境，稳定而持久地发挥多种生物学功能。

附图说明

图1为本发明实施例二中提取外泌体电镜照片；

图2为本发明实施例二中BCA蛋白分析标准曲线；

图3为本发明实施例二中外泌体表面抗原的流式鉴定结果；

图4为本发明实施例三中对照组、制剂基础液组、外泌体组和外泌体制剂组等各组细胞体外培养72小时后显微镜下照片；

图5为本发明实施例三中对照组、制剂基础液组、外泌体组外和泌体制剂组等各组细胞体外培养增殖曲线；

图6为本发明实施例三中各培养组促进CD34+细胞比例统计结果；

图7为本发明实施例三中各培养组促进造血恢复实验结果，图中显示对照组、制剂基础液组、外泌体组和外泌体制剂组辐射后小鼠白细胞(WBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(PLT)的变化；

图8为本发明实施例三中各组细胞治疗小鼠生存期实验结果，与对照组、外泌体组、制剂基础液组相比，外泌体制剂组小鼠生存时间显著增长，P<0.05。

具体实施方式

术语“外周血造血干细胞采集物”指通过对供者的外周血干细胞的采集获得的。在一些实施例中，所述的供者为健康供者。在一些实施例中，所述供者在采集外周血干细胞前进行了造血干细胞动员，动员方法为以人粒细胞集落刺激因子进行皮下注射。在一些优选的实施例中，动员方法为给予健康供者应用重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)5μg/(kg.d)q 12h皮下注射4.5天进行动员外周血造血干细胞。在一些实施例中，采集方法为以血细胞分离机进行采集。在一些优选地实施例中，以血细胞分离机进行采集，循环全血量为10000mL，得到200-300mL的外周血造血干细胞采集物。

在本发明的一个具体实施例中，骨髓间充质干细胞来源的外泌体通过离心骨髓间充质干细胞上清液获得。在一个优选的具体实施例中，所述离心为先通过10000g的离心力离心去除沉淀，然后再以100000g以上的离心力离心收集沉淀，获得骨髓间充质干细胞来源的外泌体。优选地，所述离心为将骨髓间充质干细胞上清液中4℃条件下，以300g离心力离心5-20min弃去沉淀，加入缓冲液后以2000g离心力离心5-20min弃去沉淀，加入缓冲液后再以10000g离心力离心20-40min弃去沉淀，以100000g离心力离心1小时以上，弃去上清后再以100000g离心力离心1小时以上。

在一个优选的具体实施例中，骨髓间充质干细胞上清通过将骨髓间充质干细胞的分离、纯化和传代培养获得。在一个优选的具体实施例中，骨髓间充质干细胞的分离方法为去骨髓制成细胞悬液，通过淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞，传代培养3代以上获得骨髓间充质干细胞。

实施例一骨髓间充质干细胞外泌体的分离纯化

1.骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

⑴取新鲜供者骨髓3mL，在50mL离心管中用PBS缓冲液稀释至15mL，制成细胞悬液备用。

⑵重新取一只干净的50mL离心管，向管内加入20mL的淋巴细胞分离液。

⑶用移液枪吸取一定细胞悬液，沿管壁轻缓叠加到淋巴细胞分离液上，保持液面分离。配平后室温水平离心400g×20min，缓慢增速，无制动停转。

⑷离心结束后可见离心管中分层清晰，乳白色白膜状界面即为单个核细胞。管中由上到下分别为PBS，单核细胞层，淋巴细胞分离液，红细胞沉淀。

⑸取一只15mL离心管，缓慢吸取白膜层上PBS缓冲液弃入废液缸，将白膜层细胞吸取干净后加入15mL离心管，加入PBS缓冲液吹打重悬，配平后室温水平离心250g×10min，缓慢增速，无制动停转。

⑹弃去上清，细胞沉淀由10mL PBS缓冲液重新洗，配平，室温水平离心250g×10min，缓慢增速，无制动停转，重复该步骤2-3次。

⑺用2mL低糖DMEM培养基重悬细胞沉淀，血球计数板计数。

⑻将细胞浓度调整在5-10×10⁶个/mL，接种入75cm²培养瓶，按照1:9的比例加入无血清低糖DMEM培养基30mL。

⑼将培养瓶放入培养箱培养。注意此时培养箱条件为37℃，5％CO₂，湿度饱和。

⑽每3天全量换液，待细胞覆盖面积约达80％-90％时，用0.25％胰蛋白酶消化2-3分钟。用培养液终止消化并反复吹打瓶壁细胞，PBS缓冲液洗1-2遍后分瓶传代并标记为P1。用显微镜每天观察，细胞覆盖面积达到80％左右后重复上述步骤，反复扩增传代，依传代次数标记。从P3起留取上清放入4℃冰箱保存，并取细胞冻存。

2.骨髓间充质干细胞培养上清外泌体的分离和鉴定

⑴取6只干净的15mL离心管，每管中用移液管加入13mL留取的骨髓间充质干细胞上清，4℃水平离心300g×10min。

⑵取6只超速离心机专用离心管(以下简称超离管)，缓慢吸取15mL离心管中的上清中转移其中，弃去底部沉淀，每只离心管中含有大约10mL的液体，用PBS缓冲液配平(误差在0.01g以内)，于超速离心机中4℃水平离心2000g×10min。

⑶另取6只超离管，缓慢吸取步骤⑵中的液体转移至新的超离管中，弃去底部沉淀，保持每只离心管中所含液体体积在10mL左右，PBS缓冲液配平(误差在0.01g以内)，于超速离心机中4℃水平离心10000g×30min。

⑷另取6只超离管，余下步骤与⑶相同，放入超速离心机后调整转速为100000g×2h。

⑸弃去上清，用PBS缓冲液重悬6只超离管内沉淀，配平后置于超速离心机中4℃水平离心100000g×1h。

⑹弃去上清，将超离管倒扣至灭菌纱布上，沥干1-2min，待管内无液体后用100μLPBS缓冲液重悬底物，封存于1.5mL EP管中，放入4℃冰箱或-80℃冰箱保存。

实施例二外泌体的鉴定、定量与制剂制备

1.应用透射电镜鉴定外周血造血干细胞外泌体

1)微量移液器吸取10μL备用的外泌体至无菌铜网状栅中上，静置5min。

2)沿铜网的边缘用滤纸轻柔将水吸干。

3)向铜网状栅中上加20μL的2％磷钨酸钠进行负染，室温放置5min。

4)沿铜网的边缘用滤纸轻柔吸干水分。

5)白炽灯轻柔地烤干铜网。

6)将处理好的铜网状栅放入电镜中，调整电镜，进行观察。

7)外周血造血干细胞采集物外泌体透射电镜结果：外周血造血干细胞放置2-4h后培养上清中提取的外泌体，形态呈类圆形，大小不均一，直径在100nm左右。

骨髓间充质干细胞的培养上清中能够提取到外泌体，观察骨髓间充质干细胞外泌体在电镜下的形态，可见其呈类圆形或杯状，大小不均一，直径在30～150nm左右，与文献中报道中相似，如附图1所示。

2.骨髓间充质干细胞外泌体的定量及鉴定检测

⑴蛋白定量检测

①打开水浴箱，设定温度为37℃，取一个泡沫箱，向其中加入一定液氮。

②从EP管中取出30μL提取好的外泌体放入另一EP管中，用止血掐夹住EP管上端，将盛装液体部分浸入液氮，使其迅速冻结。将EP管快速取出放于水浴箱中，轻轻晃动使液体融化。重复上述步骤，反复冻融5-7次，将外泌体裂解。

③按照A液：B液：C液体积比25：24：1的比例配制工作液(MR)和标品。

④取96孔板，空出最边缘一圈的孔，以防读数时造成误差。选取两排，1排标记1-7号孔，2排标记1-2号孔。向1排1号孔中加入150μL已配制好的标品，浓度为40μg/mL，2-7号孔中加入150μLPBS缓冲液。

⑤向1排2号孔中加入150μL标品如上，从3号至6号孔用倍比稀释法加入样品。剩余的一个孔中加入150μL的PBS缓冲液。

⑥将裂解好的外泌体用PBS缓冲液稀释10倍，终体积为300μL。向2排1-2号孔中各加入150μL样本。

⑦向各孔中均加入150μL配制好的工作液，放入37℃培养箱中避光孵育2h。

⑧2h后将96孔板放入酶标仪中，调整激光波长562nm，读取吸光度值。

结果

由标品的浓度与吸光度OD值绘制浓度OD值的标准曲线，获得线性公式，再根据R²值判断此次标准曲线的拟合度与可靠性，一般认为R²值高于0.99时，拟合度与可靠性都较好，结果如图2所示。

⑵表面抗原的流式鉴定

①取出保存的外泌体，根据蛋白定量浓度取出5μg液体备用。

②将5μg外泌体与10μL乳胶珠放在1.5mL EP管中，室温共孵育15min。

③将混合的外泌体与乳胶珠中加入PBS缓冲液1mL，室温孵育2h或4℃过夜孵育。

④将110μL浓度为1M的甘氨酸加入EP管中，轻柔吹打混匀，将EP管置于试管架上竖立，室温放置30min后4000rpm×3min，小心弃去上清。

⑤用1mLPBS/0.5％BSA重悬微珠，室温离心4000rpm×3min，弃去上清。重复此步骤2次。将最后获得的微珠沉淀用0.5mLPBS缓冲液重悬。

⑥取三只干净的流式管，分别加入①CD29，CD44，CD63；②4℃冰箱避光孵育30min，用PBS漂洗两次，弃去上清后用500μLPBS重悬，流式细胞仪上机分析，调整FSC，SSC信号及电压。

外泌体除了特异性表达CD63外，还带有其来源细胞的某些标志。本实验结果表明，在间充质干细胞外泌体中，CD63与CD44阳性表达，CD63表达率96.0％，CD44表达率50.2％，而HLA-DR，CD34，CD29，CD73等表达均为阴性(图3)。

3.促造血恢复的骨髓间充质干细胞外泌体复方制剂的制备

⑴在无菌生理盐水中加入维生素B9(终浓度20μg/μL)，维生素C(终浓度50μg/μL)，维生素B12(终浓度10μg/μL)制备成制剂基础液。并将上述制剂基础液过滤除菌。

⑵根据蛋白定量结果将制备取上述无菌制备60μg外泌体置于上述制备的制剂基础液中1.5mL中，使外泌体终浓度为40μg/mL。

实施例三外泌体制剂的治疗实验

1.骨髓间充质干细胞外泌体复方制剂促进外周血单个核细胞增殖。

通过将本发明实施例二所制备的外泌体制剂加入动员后外周血单个核细胞共培养，探究间充质干细胞外泌体复方制剂在体外对外周血单个核细胞是否有促进增殖的作用。

⑴体外分离培养外周血单个核细胞：

供者动员后外周血造血干细胞1mL经人淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，清洗并重悬于2mL PBS中，调整细胞浓度为1×10⁶/mL。接种于培养瓶中，按比例加入外泌体复方制剂或者外泌体(外泌终浓度40μg/mL)，对照组添加PBS。

⑵外泌体与外周血单个核细胞共培养：

①外泌体组及外泌体复方制剂组有明确促进外周血单个核细胞扩增的作用。

结果见图4，不同组细胞体外培养72小时后增殖图

可见加入骨髓外泌体或其复方制剂后外周血单个核细胞明显增殖。

细胞数量随共培养的时间延长而增加。共培养4天时外泌体制剂组细胞数是外泌组细胞数的1.3倍(P<0.05)，是对照组细胞数的1.9倍(P<0.05)，制剂基础液组的1.8倍(P<0.05)；6天时外泌体制剂组细胞是外泌组细胞数的1.5倍(P<0.05)，是对照组细胞数的2.4倍(P<0.05),制剂基础液组的2.3倍。8天时外泌体制剂组细胞是外泌组细胞数的1.3倍(P<0.05)，是对照组细胞数的2.4倍(P<0.05)，制剂基础液组的2.3倍。不同共培养组外周血单个核细胞生长曲线见图5。

②外泌体促进CD34+细胞比例

本实验着重检测了外泌体培养2天及4天时的各组CD34+细胞含量的变化情况。结果见图6，实验结果显示可见加入骨髓间充质干细胞外泌体或其复方制剂后造血干细胞明显增殖。

结合细胞总数与CD34+细胞的比例，发现2天时，外泌体复方制剂组与外泌体组中CD34+细胞数相比具有差异，CD34+细胞率分别是5.2％和4.13％；4天时，外泌体复方制剂组CD34+细胞数目比例是8.9％，显著高于外泌体组(7.4％)、对照组3.86％、制剂基础液组4.7％。方差分析结果显示各组具有统计学差异P<0.05，结果见图6。

2.骨髓间充质干细胞外泌体复方制剂促进放疗后造血损伤快速恢复

(1)选取8-10周的雄性NPG小鼠，分为两组，每组各8只，均以钴-60TBI照射2Gy，剂量率1.03。建立NPG小鼠放射损伤模型

(2)外泌体制剂小鼠尾静脉输注

照射后24h内将0.4mL外泌体制剂尾静脉注射入NPG放射损伤小鼠体内，其它组注入无菌PBS(对照组),及单纯外泌体和制剂基础液。

(3)小鼠血相测定

在+1，+4，+7，+10，+14，+21，+28d时，剪尾方法从两组小鼠尾静脉采取30-40μL的外周血，检验其中白细胞(WBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(PLT)情况。

(4)小鼠生存情况观察

观察小鼠生存情况，绘制生存曲线。

(5)结果

与对照组、制剂基础液和外泌体组相比，外泌体制剂组能够显著升高辐射后小鼠白细胞、血红蛋白、血小板的最低值，加快造血恢复速度，且并未观察到移植物抗宿主病等不良反应，并且能够延长小鼠的生存结果见图7-8。

Claims (14)

1.一种外泌体制剂，其特征在于，其包括骨髓间充质干细胞来源的外泌体，或者其包括骨髓间充质干细胞来源的外泌体以及维生素组合物，所述的维生素组合物为维生素B9、维生素C和维生素B12的组合。

2.根据权利要求1所述的外泌体制剂，其特征在于，所述外泌体来源于骨髓分离的间充质干细胞后传代培养后纯化获得。

3.根据权利要求2所述的外泌体制剂，其特征在于，所述传代培养为三代次以上。

4.根据权利要求1所述的外泌体制剂，其特征在于，所述外泌体与维生素B9、维生素C和维生素B12的质量比为2:1.8-2.2:4.5-5.5:0.8-1.2，优选为2:2:5:1。

5.根据权利要求1所述的外泌体制剂，其特征在于，所述外泌体特异性表达CD63和/或CD44。

6.根据权利要求1所述的外泌体制剂，其特征在于，所述外泌体不表达HLA-DR、CD34、CD29、CD73中的任意一种或多种。

7.权利要求1-6任一项所述的外泌体制剂在制备促进外周血来源的单个核细胞增殖、促进单个核细胞向造血干细胞分化，以及提高单个核细胞中造血干细胞比例的试剂中的用途；所述外周血来源的单个核细胞为以粒细胞集落刺激因子动员后采集得到的外周血造血干细胞采集物中的淋巴细胞分离液分离出单个核细胞。

8.权利要求1-6任一项所述的外泌体制剂在制备用于促进造血损伤恢复的药物中的应用，其中造血损伤为放射治疗或化学药物治疗导致的。

9.根据权利要求8所述的用途， 促进造血损伤恢复的表现为促进由于放射治疗或化学药物治疗导致外周血中白细胞、血红蛋白、血小板中一种或几种降低后向正常水平回归。

10.维生素组合物在制备提高骨髓间充质干细胞来源的外泌体对促进外周血来源的单个核细胞增殖、促进单个核细胞中造血干细胞增殖，以及提高单个核细胞中造血干细胞比例的药物中的用途；所述的维生素组合物为维生素B9、维生素C和维生素B12的组合；所述外周血来源的单个核细胞为以粒细胞集落刺激因子动员后采集得到的外周血造血干细胞采集物中的淋巴细胞分离液分离出单个核细胞。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述维生素组合物中维生素B9、维生素C和维生素B12的质量比为1.8-2.2:4.5-5.5:0.8-1.2，优选为2:5:1。

12.维生素组合物在制备提高骨髓间充质干细胞来源的外泌体对造血损伤恢复效果药物中的用途；所述的维生素组合物为维生素B9、维生素C和维生素B12的组合。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，促进造血损伤恢复的表现为促进由于放射治疗或化学药物治疗导致外周血中白细胞、血红蛋白、血小板中一种或几种降低后向正常水平回归。

14.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述维生素组合物中维生素B9、维生素C和维生素B12的质量比为1.8-2.2:4.5-5.5:0.8-1.2，优选为2:5:1。

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