CN109511648B - 临床局部注射用间充质干细胞保存液及保存间充质干细胞的方法 - Google Patents

临床局部注射用间充质干细胞保存液及保存间充质干细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种临床局部注射用间充质干细胞保存液及保存间充质干细胞的方法，保存液包括以下体积百分比的组分：自体血浆裂解物1‑5％、自体干细胞条件培养基提取物1‑5％、抗氧化剂0.1‑1％、透明质酸0.1‑0.4％，余量为生理盐水注射液。采用该保存液保存间充质干细胞后，细胞活率高，维持细胞活力的时间长，且保存液中无外源成分，安全性高。

Description

临床局部注射用间充质干细胞保存液及保存间充质干细胞的 方法
技术领域
本发明属于干细胞保存液技术领域，具体涉及一种临床局部注射用间充质干细胞保存液及保存间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)来源于发育早期的中胚层，1968年MSC在骨髓中发现，发现其具有多向分化潜能/造血支持和促进干细胞植入/免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。
细胞治疗可以修复受损细胞，替代坏死细胞，激活休眠细胞，再生新鲜细胞。干细胞注射到人体后会分泌细胞因子，可以促进细胞的生长，分泌的生长因子与衰老的细胞受体结合，增强细胞的活性，延缓衰老；同时分泌的生长因子与损伤的细胞受体相结合，可以起到损伤细胞的修复作用。
由于间充质干细胞在细胞分化和组织再生过程中存在着重要的调控作用，因此在组织工程中可作为种子细胞参与组织与器官的再生和重建。关于干细胞的研究和应用有可能为糖尿病以及神经系统、心血管、肝脏等重大疾病的治疗带来突破，同时也为各种组织缺损后的修复和重建带来新的希望，目前已成为未来生命科学和医学研究领域广泛关注的焦点。
细胞治疗涉及细胞的制备、扩增、回输等过程，通常，这些过程的实施地点及时间并不一致，从而需要把细胞运输到目的地，在运输过程中需要细胞保存液来维持细胞活性。但现有的细胞保存液加入了外源物质，会影响其安全性，同时现有保存液维持细胞活力的时间较短。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种临床用间充质干细胞保存液及保存间充质干细胞的方法，可有效解决现有的干细胞保存液安全性低，维持细胞活力的时间短的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种临床局部注射用间充质干细胞保存液，包括以下体积百分比的组分：
自体血浆裂解物1-5％、自体干细胞条件培养基提取物1-5％、抗氧化剂0.1-1％、透明质酸0.1-0.4％，余量为生理盐水注射液，这些成分均为临床注射级试剂；
其中，自体干细胞条件培养基提取物通过以下方法制备得到：
(1)选择生长状态良好的间充质干细胞，培养至生长密度为60-80％，然后使用PBS溶液对细胞进行清洗；
(2)将清洗后的细胞置于无酚红的DMEM培养基中，并加入0.1-1μmol/L黄芪甲苷，在培养箱中继续诱导培养20-28h；
(3)诱导培养结束后，去除培养基中分子量为3000以下的蛋白成分，然后进行浓缩，制得。
进一步地，临床局部注射用间充质干细胞保存液，包括以下体积百分比的组分：
自体血浆裂解物3％、自体干细胞条件培养基提取物3％、抗氧化剂1％、透明质酸0.4％，余量为生理盐水注射液。
进一步地，步骤(1)中将间充质干细胞置于DMEM培养基中进行培养，培养条件为37℃，5％CO2。
进一步地，步骤(2)中黄芪甲苷的加入量为1μmol/L。
进一步地，步骤(2)中诱导培养时培养条件为37℃，5％CO2。
进一步地，自体干细胞条件培养基提取物中含有VEGF、EGF、FGF、IGF-1和HGF，且VEGF、EGF、FGF、IGF-1和HGF的浓度分别为3000-6000ng/mL、100-300pg/mL、300-600pg/mL、3000-5000ng/mL和1000-2000pg/mL。
进一步地，自体血浆裂解物通过以下方法制备得到：
(1)用抗凝管采集患者或者正常人的外周血，离心，使其分为四层，从下而上依次为血浆层、白膜层、凝胶层和血细胞层，吸取血浆层轻轻吹打白膜层，然后将血浆及白膜层混匀后分装至离心管中，立即置于-80℃冻存；
(2)将步骤(1)所得冻存物冻融后进行离心，吸取离心上部分血浆，弃去离心底部膜碎片等制得自体血浆裂解物。
进一步地，抗氧化剂为维生素C注射液。
上述临床局部注射用间充质干细胞保存液保存间充质干细胞的方法，包括将间充质干细胞置于保存液中处理的步骤。
进一步地，保存方法包括以下步骤：将间充质干细胞置于保存液中，使得细胞终浓度为1-5×106个/mL，然后置于4℃保存。
本发明提供的临床局部注射用间充质干细胞保存液及保存间充质干细胞的方法，具有以下有益效果：
自体血浆裂解物是从人自身外周血中提取分离所得，富含血小板衍生生长因子、转化生长因子、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮细胞生长因子等多种血浆蛋白及无机盐，无机盐类及蛋白参与维持血浆渗透压、酸碱平衡及运输营养和代谢物质的过程，相当于结缔组织的细胞间质，为细胞的存活及新陈代谢活动提供良好的生存环境。
在制备自体干细胞条件培养基提取物的过程中加入了黄芪甲苷，可以诱导产生低氧培养环境，是通过低氧诱导的方式促使干细胞分泌大量的细胞因子，然后通过超滤浓缩的步骤制备成自体干细胞条件培养基提取物，其中富含大量的生长因子，为细胞的保存提供温和的生存环境。
透明质酸能够为细胞增殖与分化提供合适的场所，促进细胞的生长、分化重建与修复等，还可避免细胞因子半衰期短的问题。
维生素C可维持各种过氧化物酶的活性，作为抗氧化剂可以清除自由基，降低细胞在保存过程中自由基对细胞的损伤。
总之，自体血浆裂解物和自体干细胞条件培养基提取物中富含多种细胞因子、生长因子、趋化因子等，能够为间充质干细胞提供一个温和的保存环境，同时还能够延长间充质干细胞的保存时效；维生素C可降低细胞在保存过程中自由基等对细胞的损伤；透明质酸有助于在局部注射后维持因子/细胞保留在创伤部位，可有效避免局部注射导致的流失；这几种物质组合起来，协同起到增强细胞存活率，维持细胞活力时间的作用，此外，保存液中无外源成分，安全性高。
具体实施方式
实施例1
一种临床局部注射用间充质干细胞保存液，包括以下体积百分比的组分：
自体血浆裂解物3％、自体干细胞条件培养基提取物3％、抗氧化剂维生素C注射液1％、透明质酸0.4％，余量为生理盐水注射液，这些成分均为临床注射级试剂。
其中，自体血浆裂解物通过以下方法制备得到：
(1)用8mL枸橼酸钠抗凝管真空采血管，分2管一共采集患者16mL外周血；
(2)将采集的外周血放入离心机中离心，离心转速为1500r/min，离心10min，离心后的外周血分为四层，从下而上依次为血浆层、白膜层、凝胶层和血细胞层，吸取血浆层轻轻吹打白膜层，然后将血浆及白膜层混匀后分装至新的15mL离心管中立即置于-80℃冻存；
(3)将步骤(2)冻存物冻融后进行离心，离心转速为3000r/min，离心8min，离心结束后，吸取离心上部分血浆，弃去离心底部膜碎片等制得自体血浆裂解物。
自体干细胞条件培养基提取物通过以下方法制备得到：
(1)选择生长状态良好的间充质干细胞，置于DMEM培养基中进行培养，培养条件为37℃，5％CO2，培养至生长密度为60-80％时使用PBS溶液对细胞进行清洗；
(2)将清洗后的细胞置于无酚红的DMEM培养基中，并加入1μmol/L黄芪甲苷，在培养箱中继续诱导培养24h，培养条件为37℃，5％CO2；
(3)诱导培养结束后，去除培养基中分子量为3000以下的蛋白成分，然后进行浓缩，最后对培养基中的细胞因子进行检测，细胞因子包括VEGF、EGF、FGF、IGF-1和HGF，且VEGF、EGF、FGF、IGF-1和HGF的浓度分别为5442.02ng/mL、221.67pg/mL、517.33pg/mL、4900.11ng/mL和1508.69pg/mL。
实施例2
一种临床局部注射用间充质干细胞保存液，包括以下体积百分比的组分：
自体血浆裂解物1％、自体干细胞条件培养基提取物1％、抗氧化剂维生素C注射液0.1％、透明质酸0.1％，余量为生理盐水注射液。
自体血浆裂解物和自体干细胞条件培养基提取物的制备方法同实施例1。
实施例3
一种临床局部注射用间充质干细胞保存液，包括以下体积百分比的组分：
自体血浆裂解物5％、自体干细胞条件培养基提取物5％、抗氧化剂维生素C注射液1％、透明质酸0.4％，余量为生理盐水注射液。
自体血浆裂解物和自体干细胞条件培养基提取物的制备方法同实施例1。
实施例4
一种临床局部注射用间充质干细胞保存液，包括以下体积百分比的组分：
自体血浆裂解物2％、自体干细胞条件培养基提取物2％、抗氧化剂维生素C注射液1％、透明质酸0.4％，余量为生理盐水注射液。
自体血浆裂解物和自体干细胞条件培养基提取物的制备方法同实施例1。
实施例5
一种临床局部注射用间充质干细胞保存液，包括以下体积百分比的组分：
自体血浆裂解物3％、自体干细胞条件培养基提取物3％、抗氧化剂维生素C注射液0.5％、透明质酸0.2％，余量为生理盐水注射液。
自体血浆裂解物和自体干细胞条件培养基提取物的制备方法同实施例1。
实施例6
一种临床局部注射用间充质干细胞保存液，包括以下体积百分比的组分：
自体血浆裂解物4％、自体干细胞条件培养基提取物4％、抗氧化剂维生素C注射液1％、透明质酸0.4％，余量为生理盐水注射液。
自体血浆裂解物和自体干细胞条件培养基提取物的制备方法同实施例1。
对比例1
一种临床局部注射用间充质干细胞保存液，包括以下体积百分比的组分：
自体血浆裂解物3％、抗氧化剂维生素C注射液1％、透明质酸0.4％，余量为生理盐水注射液，这些成分均为临床注射级试剂。
自体血浆裂解物的制备方法同实施例1。
对比例2
一种临床局部注射用间充质干细胞保存液，包括以下体积百分比的组分：
自体干细胞条件培养基提取物3％、抗氧化剂维生素C注射液1％、透明质酸0.4％，余量为生理盐水注射液，这些成分均为临床注射级试剂。
自体干细胞条件培养基提取物的制备方法同实施例1。
对比例3
一种临床局部注射用间充质干细胞保存液，包括以下体积百分比的组分：
自体血浆裂解物0.2％、抗氧化剂维生素C注射液1％、透明质酸0.4％，余量为生理盐水注射液，这些成分均为临床注射级试剂。
自体血浆裂解物的制备方法同实施例1。
对比例4
一种临床局部注射用间充质干细胞保存液，包括以下体积百分比的组分：
自体干细胞条件培养基提取物0.2％、抗氧化剂维生素C注射液1％、透明质酸0.4％，余量为生理盐水注射液，这些成分均为临床注射级试剂。
自体干细胞条件培养基提取物的制备方法同实施例1。
对比例5
一种临床局部注射用间充质干细胞保存液，包括以下体积百分比的组分：
自体血浆裂解物3％、自体干细胞条件培养基提取物3％，余量为生理盐水注射液，这些成分均为临床注射级试剂。
自体血浆裂解物和自体干细胞条件培养基提取物的制备方法同实施例1。
实施例1-6和对比例1-5制得的保存液及生理盐水用于保存间充质干细胞，保存过程为：选择生长状况良好的间充质干细胞(第3代-第5代)，培养至细胞密度达80-90％，用0.25％的胰蛋白酶将其消化成单个细胞，然后加入生理盐水清洗1-2次，得细胞沉淀，然后加入适量生理盐水重悬细胞沉淀，用Invitrogen公司全自动细胞计数仪Countess进行计数(细胞活率≥90％)；然后加入保存液调整细胞浓度为1-5×106个/mL，封口后置于4℃保存。定时检测细胞活率及凝集程度，结果见表1-12。
表1实施例1间充质干细胞的细胞活率及凝集程度
Figure BDA0001870271780000081
表2实施例2间充质干细胞的细胞活率及凝集程度
Figure BDA0001870271780000082
表3实施例3间充质干细胞的细胞活率及凝集程度
Figure BDA0001870271780000083
表4实施例4间充质干细胞的细胞活率及凝集程度
Figure BDA0001870271780000091
表5实施例5间充质干细胞的细胞活率及凝集程度
Figure BDA0001870271780000092
表6实施例6间充质干细胞的细胞活率及凝集程度
Figure BDA0001870271780000093
表7对比例1间充质干细胞的细胞活率及凝集程度
Figure BDA0001870271780000094
Figure BDA0001870271780000101
表8对比例2间充质干细胞的细胞活率及凝集程度
Figure BDA0001870271780000102
表9对比例3间充质干细胞的细胞活率及凝集程度
Figure BDA0001870271780000103
表10对比例4间充质干细胞的细胞活率及凝集程度
Figure BDA0001870271780000104
表11对比例5间充质干细胞的细胞活率及凝集程度
Figure BDA0001870271780000111
表12生理盐水中间充质干细胞的细胞活率及凝集程度
Figure BDA0001870271780000112
注：－：未发现细胞成团现象；+：发现不超过2个细胞团；
++：发现3-5个细胞团；+++：发现超过5个细胞团。
由表1-12可知，对于细胞活率：对比例1-5与生理盐水组，细胞活率明显比实施例1-6要低，尤其是生理盐水组，2h后细胞活率下降很快，当保存14h时细胞活率已经非常低了，不能用于长时间保存间充质细胞；而对比例1和2与对比例3和4相比，前者细胞活率相对较高，说明自体血浆裂解物或自体干细胞条件培养基提取物的含量对细胞活率有一定的影响；对比例5与对比例1-4相比，对比例5中细胞活率明显比对比例1-4要高，但比实施例1-6细胞活率明显低，说明虽然自体血浆裂解物和自体干细胞条件培养基提取物对细胞活率有很大影响，但缺少其他组分时，也会明显影响细胞活率；将实施例1与实施例5进行对比，当自体血浆裂解物和自体干细胞条件培养基提取物含量一定的情况下，改变其他组分的含量，对细胞活率也有一定的影响，由此可知，只有将本发明中各组分结合在特定的含量情况下，对间充质干细胞进行保存时，才能更有效的提高细胞活率。
对于细胞凝集程度：随着时间的推移，细胞逐渐出现成团现象，生理盐水组在2h时就出现较多的成团细胞，对比例1-5组，当缺少自体血浆裂解物或自体干细胞条件培养基提取物时，细胞容易成团，而将本发明各组分结合起来制得的保存液保存间充质干细胞时，细胞凝集状态良好，保存48h时也不会出现明显的细胞成团现象，说明本发明提供的保存液在保证细胞状态的前提下，可有效延长细胞活力时间。

Claims (9)

1.一种临床局部注射用间充质干细胞保存液，其特征在于，包括以下体积百分比的组分：
自体血浆裂解物1-5%、自体干细胞条件培养基提取物1-5%、抗氧化剂0.1-1%、透明质酸0.1-0.4%，余量为生理盐水注射液；
其中，自体干细胞条件培养基提取物通过以下方法制备得到：
（1）选择生长状态良好的间充质干细胞，培养至生长密度为60-80%，然后使用PBS溶液对细胞进行清洗；
（2）将清洗后的细胞置于无酚红的DMEM培养基中，并加入0.1-1μmol/L黄芪甲苷，在培养箱中继续诱导培养20-28h；
（3）诱导培养结束后，去除培养基中分子量为3000以下的蛋白成分，然后进行浓缩，制得；
其中自体血浆裂解物通过以下方法制备得到：
（1）采集人外周血，离心，使其分为四层，从下而上依次为血浆层、白膜层、凝胶层和血细胞层，吸取血浆层和白膜层，立即置于-80℃冻存；
（2）将步骤（1）所得冻存物冻融后进行离心，吸取上部分血浆，弃去底部沉淀物，制得自体血浆裂解物。
2.根据权利要求1所述的临床局部注射用间充质干细胞保存液，其特征在于，包括以下体积百分比的组分：
自体血浆裂解物3%、自体干细胞条件培养基提取物3%、抗氧化剂1%、透明质酸0.4%，余量为生理盐水注射液。
3.根据权利要求1或2所述的临床局部注射用间充质干细胞保存液，其特征在于，步骤（1）中将间充质干细胞置于DMEM培养基中进行培养，培养条件为37℃，5%CO2。
4.根据权利要求1或2所述的临床局部注射用间充质干细胞保存液，其特征在于，步骤（2）中黄芪甲苷的加入量为1μmol/L。
5.根据权利要求1或2所述的临床局部注射用间充质干细胞保存液，其特征在于，步骤（2）中诱导培养时培养条件为37℃，5%CO2。
6.根据权利要求1或2所述的临床局部注射用间充质干细胞保存液，其特征在于，自体干细胞条件培养基提取物中含有VEGF、EGF、FGF、IGF-1和HGF，且VEGF、EGF、FGF、IGF-1和HGF的浓度分别为3000-6000ng/mL、100-300pg/mL、300-600pg/mL、3000-5000ng/mL和1000-2000pg/mL。
7.根据权利要求1或2所述的临床局部注射用间充质干细胞保存液，其特征在于，抗氧化剂为维生素C注射液。
8.采用权利要求1-7任一项所述的临床局部注射用间充质干细胞保存液保存间充质干细胞的方法，其特征在于，包括将间充质干细胞置于保存液中处理的步骤。
9.根据权利要求8所述的临床局部注射用间充质干细胞保存液保存间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将间充质干细胞置于保存液中，使得细胞终浓度为（1-5）×106个/ mL，然后置于4℃保存。
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