CN104013644A - 一种用于皮肤衰老修复的间充质干细胞的条件培养基制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于修复皮肤衰老的间充质干细胞条件培养基制剂，其制备方法包括常规条件下培养间充质干细胞至其生长密度为60%~80%，然后进行换液处理，使用无酚红的DMEM培养基培养，并加入黄芪甲苷，在培养箱中继续诱导培养24h，培养完毕后去除分子量3000以下的细胞因子，进行浓缩，并对培养基中的细胞因子进行检测，并在浓缩后的培养基溶液中加入0.01mg/ml~0.6mg/ml的还原型谷胱甘肽和0.01%~0.4%的透明质酸。条件培养基制剂中富含多种细胞生长因子，黄芪甲苷可以保持干细胞特性并刺激其分泌各种因子能力；透明质酸避免了细胞因子半衰期短和疗效时间短的弊端，提高皮肤修复效果。

Description

一种用于皮肤衰老修复的间充质干细胞的条件培养基制剂
技术领域
本发明涉及使用生物干细胞进行诱导培养的技术领域，具体涉及到一种间充质干细胞的条件培养制剂以及该制剂在修复皮肤衰老中的应用。
背景技术
皮肤衰老是一个非常复杂的过程。主要表现为染色体端粒缩短，DNA甲基化水平下降，改变多种细胞因子的表达水平，如EGF等生长因子及其受体数量及功能的变化，其中一个重要原因是皮下血管萎缩，从而导致皮肤供血不足，产生病理生理作用，细胞缺乏营养，对外界反应性逐渐降低，皮肤细胞增殖分化能力减弱、新陈代谢减缓，皮肤出现皱纹、色斑等衰老症状。
在当前的护肤美容行业中，传统的化学美容、物理美容已经不能满足需求，天然植物提取成分美容正值鼎盛，细胞因子美容以其功效显著、效果持久受到越来越多的关注。细胞因子作用于护肤美容，摆脱了传统的化学美容、物理美容的束缚，为我们带来了全新的体验，从人体的内在实现美丽、年轻态。
干细胞生长因子是一种多功能强力细胞因子，在人体微环境与靶细胞的特异受体结合，发挥刺激靶细胞分化增殖、促使靶细胞合成分泌、趋化诱导炎症细胞等生物学功能，启动细胞内的代谢过程和细胞间的物质、信息传递。不少细胞因子受体具有激酶活性，特别是酪氨酸激酶活性(如PDGF受体、EGF受体)。通过细胞因子与相应受体的结合，激活受体，促进皮下血管的形成修复皮下血液微循环系统，改善细胞生长的微环境，诱导多种细胞的增殖和分化，加速皮肤新生细胞替代衰老细胞的进程，从而达到延缓衰老的效果。
为了解决现有技术中的上述不足，本发明提出了一种新的解决方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于皮肤衰老修复的间充质干细胞的条件培养基制剂。
为达上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种用于皮肤衰老修复的间充质干细胞的条件培养基制剂，其制备方法包括以下步骤：
A、选取具有活性的间充质干细胞，在常规条件下培养间充质干细胞至其生长密度为60％～80％，然后进行换液处理，使用PBS溶液清洗；
B、在清洗后的间充质干细胞中加入无酚红的DMEM培养基和培养基总体积0.1umol/L～1umol/L的黄芪甲苷，在培养箱中继续诱导培养20h～28h，培养完毕后将间充质干细胞的培养基使用高效滤网过滤，去除分子量3000以下的细胞因子；
C、经过高效滤网后的培养基溶液形成浓缩液，并对培养基浓缩液中的细胞因子进行检测，检测细胞因子VEGF、IGF-1、HGF、EGF、PDGF和FGF的含量；
D、在浓缩后的培养基溶液中加入0.01mg/ml～0.6mg/ml的还原型谷胱甘肽和0.01％～0.4％的透明质酸。
优选的，步骤A中的常规条件为，使用的培养基为含量0.1umol/L～1umol/L的黄芪甲苷DMEM培养基，其培养温度为35℃～39℃，培养体系含有4％～6％的二氧化碳。
优选的，步骤B中的诱导培养条件为，培养温度为35℃～39℃，培养体系含有4％～6％的二氧化碳。
本发明提供的方法制备的间充质干细胞条件培养制剂在皮肤修复中的应用。
综上所述，本发明具有以下优点：
在本发明中提供的制备方法中，首先进行了换液培养，在诱导培养时添加适宜浓度的黄芪甲苷，刺激间充质干细胞分泌多种细胞生长因子，如VEGF、HGF、EGF、PDGF、FGF、IGF-1，制成条件培养基制剂，同时加入缓释载体透明质酸和还原型谷胱甘肽。本方法制备的条件培养基制剂中富含多种细胞生长因子，透明质酸和还原型谷胱甘肽，其中黄芪甲苷可以诱导产生低氧培养环境，增强细胞存活率及其分泌能力；透明质酸避免了细胞因子半衰期短和疗效时间短的弊端，提高治疗效果；还原性谷胱甘肽可以清除体内自由基，增强肌肤免疫力，改善皮肤抗氧化能力，延缓肌肤衰老，促进体内毒素排出，直接还原黑色素，防止黑色素沉着，淡化色斑，使肌肤白皙润泽、嫩滑细腻；
使用本方法制备的制剂在应用于皮肤修复或者美容时，富含的多种细胞因子作用于皮肤，摆脱了传统的化学美容、物理美容的束缚，通过刺激自体的修复功能，从根本上解决皮肤衰老等问题。本方法中未添加任何防腐剂等对机体有害的物质。免去手术除皱带来的长期的手术恢复期，不影响正常的生活和工作，从人体的内在实现美丽、年轻态。
具体实施方式
实施例1
选取具有活性的间充质干细胞，在常规条件下培养间充质干细胞至其生长密度为60％，然后进行换液处理，使用PBS溶液清洗。本发明的常规培养条件是指，使用的培养基为DMEM培养基，其培养温度为37℃，培养体系含有5％的二氧化碳；其中，培养体系含有5％的二氧化碳是指干细胞培养环境中二氧化碳的浓度为5％。
本发明所述的换液处理是指使用其他培养基进行培养前，需要对间充质干细胞进行清洗处理，避免原培养基混入新培养基中。常规处理使用的培养基为DMEM培养基，诱导时采用的培养基为无酚红的DMEM培养基，诱导培养时的培养温度为37℃，培养体系含有5％的二氧化碳。
进行换液处理后，在清洗后的间充质干细胞中加入无酚红的DMEM培养基和培养基总体积0.1umol/L的黄芪甲苷，即每升培养基中加入0.1umol的黄芪甲苷。加入黄芪甲苷后在培养箱中继续诱导培养24h，培养完毕后将间充质干细胞的培养基使用高效滤网过滤，去除分子量3000以下的细胞因子。
经过高效滤网后的培养基溶液形成浓缩液，并对培养基浓缩液中的细胞因子进行检测，检测细胞因子VEGF、IGF-1、HGF、EGF、PDGF和FGF的含量。在浓缩后的培养基溶液中加入0.01mg/ml的还原型谷胱甘肽和占培养基浓缩液重量0.01％的透明质酸。
在实施例1中，使用Elisa细胞因子检测试剂盒对制备的条件培养制剂的细胞因子含量进行检测。
实施例2
选取具有活性的间充质干细胞，在常规条件下培养间充质干细胞至其生长密度为80％，然后进行换液处理，使用PBS溶液清洗。本发明的常规培养条件是指，使用的培养基为DMEM培养基，其培养温度为39℃，培养体系含有6％的二氧化碳；其中，培养体系含有6％的二氧化碳是指干细胞培养环境中二氧化碳的浓度为6％。
本发明所述的换液处理是指使用其他培养基进行培养前，需要对间充质干细胞进行清洗处理，避免原培养基混入新培养基中。常规处理使用的培养基为DMEM培养基，诱导时采用的培养基为无酚红的DMEM培养基，诱导培养时的培养温度为37℃，培养体系含有5％的二氧化碳。
进行换液处理后，在清洗后的间充质干细胞中加入无酚红的DMEM培养基和培养基总体积1umol/L的黄芪甲苷，即每升培养基中加入1umol的黄芪甲苷。加入黄芪甲苷后在培养箱中继续诱导培养24h，培养完毕后将间充质干细胞的培养基使用高效滤网过滤，去除分子量3000以下的细胞因子。
经过高效滤网后的培养基溶液形成浓缩液，并对培养基浓缩液中的细胞因子进行检测，检测细胞因子VEGF、IGF-1、HGF、EGF、PDGF和FGF的含量。在浓缩后的培养基溶液中加入0.6mg/ml的还原型谷胱甘肽和占培养基浓缩液重量0.4％的透明质酸。
在实施例2中，使用Elisa细胞因子检测试剂盒对制备的条件培养制剂的细胞因子含量进行检测。
对照组1
本对照组选取与实施例1和实施例2相同的间充质干细胞，在常规条件下培养至其生长密度为60％，然后进行相同的换液处理，使用无酚红的DMEM培养基进行培养，其培养条件与实施例1相同。在诱导培养过程中，不添加黄芪甲苷，保持培养体系低氧环境，加入与实施例1中等量的无酚红DMEM培养基即可，后续的过滤及其他步骤与实施例1保持一致，完成后检测其细胞因子含量。
对照组2
本对照组选取与实施例1和实施例2相同的间充质干细胞，在常规条件下培养至其生长密度为80％，然后进行相同的换液处理，使用无酚红的DMEM培养基进行培养，其培养条件与实施例2相同。在诱导培养过程中，不添加黄芪甲苷，保持培养体系中的氧含量正常，即氧含量与大气相同，然后加入与实施例2中等量的无酚红DMEM培养基即可，后续的过滤及其他步骤与实施例2保持一致，完成后检测其细胞因子含量。
本发明中实施例1和实施例2，对照组1和对照组2的检测结果如下。
从上表可以得知，采用实施例1和实施例2中所述的方法制备的间充质干细胞制剂，较其他方法生产的制剂，细胞因子的含量大大增加，这些细胞因子的增加，能够有利于皮肤修复，同时在制剂中加入了透明质酸和还原型谷胱甘肽，能够增强细胞因子的效力。

Claims (4)

1.一种用于皮肤衰老修复的间充质干细胞的条件培养基制剂，其制备方法包括以下步骤：
A、选取具有活性的间充质干细胞，在常规条件下培养间充质干细胞至其生长密度为60%~80%，然后进行换液处理，使用PBS溶液清洗；
B、在清洗后的间充质干细胞中加入无酚红的DMEM培养基和培养基总体积0.1umol/L~1umol/L的黄芪甲苷，在培养箱中继续诱导培养20h~28h，培养完毕后将间充质干细胞的培养基使用高效滤网过滤，去除分子量3000以下的细胞因子；
C、经过高效滤网后的培养基溶液形成浓缩液，并对培养基浓缩液中的细胞因子进行检测，检测细胞因子VEGF、IGF-1、HGF、EGF和FGF的含量；
D、在浓缩后的培养基溶液中加入0.01mg/ml~0.6mg/ml的还原型谷胱甘肽和0.01%~0.4%的透明质酸。
2.如权利要求1所述的条件培养基制剂，其特征在于：步骤A中的常规条件为，使用的培养基为DMEM培养基，其培养温度为35℃~39℃，培养体系含有4%~6%的二氧化碳。
3.如权利要求1所述的条件培养基制剂，其特征在于：步骤B中的低氧诱导培养条件为，0.1umol/L~1umol/L的黄芪甲苷，培养温度为35℃~39℃，培养体系含有4%~6%的二氧化碳。
4.按照权利要求1所述的间充质干细胞条件培养制剂在皮肤修复中的应用。
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