CN104285790B

CN104285790B - 卡特兰初代诱导培养基及外植体预处理方法

Info

Publication number: CN104285790B
Application number: CN201410508438.0A
Authority: CN
Inventors: 陈永得
Original assignee: ZUNYI COUNTY UNIVERSE STAR SIGHTSEEING AND LEISURE AGRICULTURE Co Ltd
Current assignee: Xuzhou Dacheng Environmental Technology Co ltd
Priority date: 2014-09-28
Filing date: 2014-09-28
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2034-09-28
Also published as: CN104285790A

Abstract

本发明公开了一种卡特兰初代诱导培养基及外植体预处理方法。本发明所述的卡特兰初代诱导培养基，其以改良MS培养基为基础培养基，并添加有柠檬酸、水杨酸、硝酸镧、6-BA、NAA、琼脂粉、蔗糖和硅胶，能够有效减少卡特兰外植体褐化。

Description

卡特兰初代诱导培养基及外植体预处理方法

技术领域

本发明涉及兰花组织培养技术领域，特别是涉及一种卡特兰初代诱导培养基及外植体预处理方法。

背景技术

卡特兰，又名嘉德丽亚兰(CattleyaHybrida)，因其花朵硕大，色泽艳丽，富有美感，品种众多，有的品种还具有芳香气味，而被誉为“洋兰之王”，具有极高的欣赏价值和经济价值。

卡特兰的繁殖可以通过种子繁殖、分株繁殖和组织培养。由于卡特兰种子在自然条件下极难萌发，分株法繁殖率低，难以达到大规模生产的目的，而组织培养法是目前卡特兰大规模生产的主要方法。然而，卡特兰的外植体在组织培养过程中极易褐化坏死，是原球茎诱导成功的一大障碍，也是制约卡特兰组培快速繁殖的关键。

针对卡特兰外植体褐化问题，现有的卡特兰初代诱导培养基通常在1/4MS培养基的基础上，添加2.5～3mg/L的6-BA、0.15～0.2mg/L的NAA、6～7g/L的琼脂粉、25～30g/L的蔗糖，以及0.1％～0.2％的活性炭。活性炭对酚类物质有吸附作用，能减少酚类物质被氧化为醌类物质，减少褐化现象，然而，活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附酚类物质的同时，亦会吸附培养基中的其它营养成分，对外植体的诱导分化产生负面影响。

发明内容

基于此，有必要针对卡特兰组织培养过程中外植体褐化的问题，提供一种能有效减少卡特兰外植体褐化的卡特兰初代诱导培养基。

此外，有必要针对卡特兰组织培养过程中外植体褐化的问题，提供一种能有效减少卡特兰外植体褐化的卡特兰外植体预处理方法。

一种卡特兰初代诱导培养基，其以改良MS培养基为基础培养基，并添加有柠檬酸、水杨酸、硝酸镧、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、琼脂粉、蔗糖和硅胶。

在其中一个实施例中，所述改良MS培养基中，二水氯化钙(CaCl₂·2H₂O)的浓度为230mg/L，维生素B1的浓度为1mg/L，其余成分及其浓度与标准MS培养基相同。

在其中一个实施例中，柠檬酸的浓度为30～80mg/L，水杨酸的浓度为50～150mg/L，硝酸镧的浓度为3～7mg/L，6-BA的浓度为2.5～3mg/L，NAA的浓度为0.15～0.2mg/L，琼脂粉的浓度为6～7g/L，蔗糖浓度为25～30g/L，硅胶的浓度为1～5g/L。

在其中一个实施例中，柠檬酸的浓度为50mg/L，水杨酸的浓度为100mg/L，硝酸镧的浓度为5mg/L，6-BA的浓度为3mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L，琼脂粉的浓度为6g/L，蔗糖浓度为30g/L，硅胶的浓度为3g/L。

在其中一个实施例中，所述的硅胶为固体，呈颗粒状、管状或棒状，其均匀镶嵌于经凝固后的卡特兰初代诱导培养基中。

在其中一个实施例中，所述卡特兰初代诱导培养基的pH值为5.5。

一种卡特兰外植体预处理方法，包括以下步骤：取健康、生长良好的卡特兰侧芽作为外植体，于2～5℃低温处理12～24小时，经灭菌处理后将侧芽接种于本发明所述的卡特兰初代诱导培养基中，然后置于人工气候箱中，在温度为15～20℃、湿度为80～90％、光照强度为1800～2000lux、光暗周期为12h光照/12h黑暗的条件下进行培养，诱导出原球茎。

在其中一个实施例中，所述的灭菌处理包括以下步骤：在超净工作台中，取出低温处理后的侧芽，除去侧芽外的苞片，侧芽留一片叶子，用70％的酒精擦洗几秒，用无菌水冲洗干净后，置于质量浓度为0.1％的氯化汞溶液中灭菌5～10分钟，再用无菌水冲洗干净。

本发明的卡特兰初代诱导培养基中，采用改良的MS培养基，通过降低钙离子的浓度，能够减轻外植体褐化，并通过提高维生素B1的含量，竞争性抑制外植体内单酚酶和二酚酶的活性，减少酚类物质氧化成醌类物质，从而减缓褐化现象的出现；此外，培养基中添加的柠檬酸具有抗氧化作用，能有效减缓外植体的氧化酶促反应，水杨酸则能够提高植物组织自身的抗氧化能力，增加叶绿素含量，两者同时作用，能显著降低外植体褐化程度，使褐化率从17.03％下降到3.88％；硝酸镧中的稀土元素“镧”，能够加快外植体诱导出原球茎，促使萌动时间从42天缩短为28天，同时亦能有效抑制褐化现象，提高外植体的成活率，提高卡特兰组织培养的生产效率；6-BA和NAA为广谱性植物生长调节剂，能够促进卡特兰外植体的萌发；硅胶具有特异性吸附作用，能够吸附植物组织的酚类、醌类物质，减少酶促反应的底物，抑制褐化现象的发生，但对培养基中的营养成分没有吸收作用，不会影响组织生长；以琼脂作为固体培养平台，为植材提供养分、水分与透气的效用，并以蔗糖作为碳源，在成活率以及萌发率不受影响的前提下，降低了培养基的制备成本。

本发明的卡特兰初代诱导培养基中，柠檬酸的浓度优选为30～80mg/L，水杨酸的浓度优选为50～150mg/L，若柠檬酸、水杨酸的用量过低，抗氧化作用差，若柠檬酸、水杨酸的用量过高，则会抑制植株生长，降低萌发率；硝酸镧的浓度优选为3～7mg/L，若其用量过低，促进萌发的效果不理想，若其用量过高，则会抑制植株生长，增加萌发所需时间。

本发明的卡特兰初代诱导培养基中，采用固体硅胶，均匀镶嵌于经固化后的培养基中，使之与培养基充分接触；培养结束后，固体硅胶可从培养基中分离回收，通过乙醇洗涤所吸附的物质后，可以循环使用，能够降低培养基的成本，提高产品的市场竞争力。

本发明的卡特兰初代诱导培养基，将pH值控制在5.5，呈弱酸性环境，能够抑制褐变过程的发生，从而降低褐变率。

本发明的卡特兰初代诱导培养基，通过生化(柠檬酸、水杨酸、硝酸镧等)和物理(硅胶、低温处理、暗培养等)的双重作用，能有效抑制卡特兰外植体褐化现象的发生，提高外植体的成活率，以及缩短外植体的萌发时间。

本发明的卡特兰外植体预处理方法，通过对外植体在2～5℃下进行低温处理12～24小时，能够有效减少外植体分泌酚类、醌类物质，从而减少酶促反应底物，抑制褐化现象的发生；接种于培养基后置于人工气候箱中，在温度为15～20℃、湿度为80～90％、光照强度为1800～2000lux、光暗周期为12h光照/12h黑暗的条件下进行培养，若温度过高、光照过强或光照时间过长，会提高多酚氧化酶(PPO)的活性，促进多酚类物质的氧化，而加速外植体褐变，同时，亦会使植物生陈代谢加快，使CO₂浓度提高，环境中的CO₂向细胞内扩散，细胞内CO₃ ^2-增多，与细胞膜上的CO₃ ^2-结合，使有效CO₃ ^2-减少，导致细胞内膜系统瓦解，酚类物质与PPO相互接触，加剧褐变。

具体实施方式

实施例一：本发明所述的卡特兰初代诱导培养基的制备

按照表1所示的配方，分别称取改良MS培养基中的各成分，置于三角瓶中，加入适量纯化水，搅拌溶解，定容至1L，制得改良MS培养基，备用。

表1改良MS培养基的成分及其用量

按照表2所示的配方，分别将柠檬酸、水杨酸、硝酸镧、6-BA、NAA、琼脂粉和蔗糖加入所制得的改良MS培养基中，搅拌溶解，并调节pH值至5.5。然后将三角瓶封口，置于高压灭菌锅中，于121℃灭菌20min，然后置于超净工作台中自然冷却，得到灭菌的培养基母液，备用。

在超净工作台中，将无菌的硅胶切成颗粒状，直径为5～10mm；待灭菌的培养基母液冷却至60℃后，加入硅胶颗粒，摇匀，然后分装至组织培养瓶中，晾凉，待其凝固后将组织培养瓶封口，得到本发明的卡特兰初代诱导培养基，备用。

表2卡特兰初代诱导培养基的成分及其用量

成分	终浓度
		改良MS培养基	-
柠檬酸	50mg/L
		水杨酸	100mg/L
硝酸镧	5mg/L
		6-BA	3mg/L
NAA	0.2mg/L
		琼脂粉	6g/L
蔗糖	30g/L
		硅胶	3g/L

实施例二：本发明所述的卡特兰外植体预处理方法

从健康、生长良好的卡特兰上切取1～2cm的侧芽，用洗涤剂漂洗干净，于2～5℃下低温处理12～24小时；在超净工作台中，取出低温处理后的侧芽，除去侧芽外的苞片，侧芽留一片叶子，用70％的酒精擦洗几秒，用无菌水冲洗干净后，置于质量浓度为0.1％的氯化汞溶液中灭菌5～10分钟，再用无菌水冲洗干净；在培养皿中切取直径为0.5～2mm的侧芽，备用。

在超净工作台中，将经过灭菌处理的侧芽接种于实施例一所制得的卡特兰初代诱导培养基中，然后将组织培养瓶置于人工气候箱中进行培养，人工气候箱的环境参数设置为：温度15～20℃、湿度80～90％、光照强度1800～2000lux、光暗周期12h光照/12h黑暗，培养30天即可诱导出原球茎。

实施例三：卡特兰外植体褐化率、成活率、萌发率测试

参照实施例二所述的卡特兰外植体预处理方法，分别将卡特兰侧芽接种于表3所示的初代诱导培养基中，培养20天后分别记录侧芽的褐化率、萌发率和成活率，培养60天后分别统计其萌发率，结果如表4所示。

表3卡特兰初代诱导培养基

备注：上述对照组1、对照组2以及各试验组均采用表1所示的改良MS培养基作为基础培养基；对照组3采用1/4MS培养基作为基础培养基，并添加有0.2％的活性炭；对照组2、对照组3参照实施例二所述的外植体处理方法，但不进行低温处理。

表4卡特兰外植体褐化率、萌发率、成活率测试结果

备注：综合评分y＝c*0.5+d*0.2-a*0.2-b*0.1。

由表4的测试结果可见，与对照组相比，通过在培养基中添加柠檬酸、水杨酸、硝酸镧或硅胶，均能使褐化率降低、萌发时间缩短、萌发率和成活率提高；由各试验组的结果相比，可见培养基中同时添加柠檬酸、水杨酸、硝酸镧和硅胶时，能够产生最佳的相互协同作用；与试验组5、8、15的结果相比，可见添加稀土元素“镧”能够促进萌发，缩短萌发时间，减少褐化的机会。与对照组2相比，对照组1的外植体经过低温处理后，其褐化率降低、萌发时间缩短，萌发率和成活率提高；与对照组3相比，试验组10的褐化率从17.03％下降至3.88％，萌发时间从42天缩短至28天，萌发率从78.94％提高至98.82％，成活率从29.56％大幅上升至73.43％，成效显著。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种卡特兰初代诱导培养基，其特征在于：以改良MS培养基为基础培养基，并添加有柠檬酸、水杨酸、硝酸镧、6-苄氨基腺嘌呤、萘乙酸、琼脂粉、蔗糖和硅胶；其中，柠檬酸的浓度为30～80mg/L，水杨酸的浓度为50～150mg/L，硝酸镧的浓度为3～7mg/L，6-苄氨基腺嘌呤的浓度为2.5～3mg/L，萘乙酸的浓度为0.15～0.2mg/L，琼脂粉的浓度为6～7g/L，蔗糖浓度为25～30g/L，硅胶的浓度为1～5g/L；所述改良MS培养基中，二水氯化钙的浓度为230mg/L，维生素B1的浓度为1mg/L，其余成分及其浓度与标准MS培养基相同。

2.根据权利要求1所述的卡特兰初代诱导培养基，其特征在于：柠檬酸的浓度为50mg/L，水杨酸的浓度为100mg/L，硝酸镧的浓度为5mg/L，6-苄氨基腺嘌呤的浓度为3mg/L，萘乙酸的浓度为0.2mg/L，琼脂粉的浓度为6g/L，蔗糖浓度为30g/L，硅胶的浓度为3g/L。

3.根据权利要求1或2所述的卡特兰初代诱导培养基，其特征在于：所述的硅胶为固体，呈颗粒状、管状或棒状，其均匀镶嵌于经凝固后的卡特兰初代诱导培养基中。

4.根据权利要求1或2所述的卡特兰初代诱导培养基，其特征在于：所述卡特兰初代诱导培养基的pH值为5.5。

5.一种卡特兰外植体预处理方法，包括以下步骤：取健康、生长良好的卡特兰侧芽作为外植体，于2～5℃低温处理12～24小时，经灭菌处理后将侧芽接种于权利要求1至4其中之一所述的卡特兰初代诱导培养基中，然后置于人工气候箱中，在温度为15～20℃、湿度为80～90％、光照强度为1800～2000lux、光暗周期为12h光照/12h黑暗的条件下进行培养，诱导出原球茎。

6.根据权利要求5所述的卡特兰外植体预处理方法，其特征在于，所述的灭菌处理包括以下步骤：在超净工作台中，取出低温处理后的侧芽，除去侧芽外的苞片，侧芽留一片叶子，用70％的酒精擦洗几秒，用无菌水冲洗干净后，置于质量浓度为0.1％的氯化汞溶液中灭菌5～10分钟，再用无菌水冲洗干净。