CN104396747B - 一种皖贝母愈伤组织诱导增殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种皖贝母愈伤组织诱导增殖方法，包括以下步骤：将皖贝母生长期鳞茎消毒后切割成小方块，将其接种于诱导培养基中诱导形成愈伤组织后接种于增殖培养基中增殖获得致密愈伤组织；其中，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有6-BA和NAA。本发明所提供的方法简单易行，缩短了愈伤组织诱导的周期，提高了诱导成功率，出愈率为70-83.33％，胚性愈伤率为80.95-84％；并且，依照本发明所提供的诱导增殖方法获得的愈伤组织具有更好的质量和发育成苗的性能。

Description

一种皖贝母愈伤组织诱导增殖方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体的涉及一种皖贝母愈伤组织诱导增殖方法。

背景技术

皖贝母(F.anhuiensis)是百合科(Liliaceae)贝母属(FritillariaL.)的一种多年生球根植物，具有较高的药用价值和观赏价值。自然分布于安徽省大别山区和江淮丘陵区，适应范围较小，并且它喜欢冷凉的气候，喜湿润土壤，但怕积水，当温度超过30℃后，地上部分便会枯萎。目前多在安徽金寨、舒城、霍山一带进行栽培种植，但它作为一种常用药材，需求量大，因此长期处于供不应求的状态。

皖贝母常规的繁殖方法以播种和分球繁殖为主，用鳞茎进行繁殖，其繁殖系数低，且长期进行无性繁殖，容易造成种性退化，抗性降低，生长速度缓慢或出现变色、坏死、畸形等不健康状态。而用种子进行有性繁殖，繁殖周期长，一般要4-5年的时间才能长成开花种球，很难适应和满足产业化大生产和国内外市场的需求。而通过组织培养可以克服鳞茎繁殖和有性繁殖技术上的缺点，并且不受外界环境条件的限制，可以大大加快其繁殖速度，缩短育种年限，满足现代大规模生产的需要。

目前，关于贝母组织培养已有一些研究，并取得了一定的进展，这些研究多采用贝母的鳞茎作为外植体，通过离体培养进行愈伤的诱导，或进行鳞茎的再生等以达到快速繁殖的目的，已经在川贝母、平贝母、伊贝母、暗紫贝母等种类上取得了很好的效果。而目前关于皖贝母组培的研究较少，基于各种贝母种间存在差异，不同的贝母由于其生长特性的差异在进行愈伤组织诱导时所适用的诱导方式也有一定的差异，当将现有的贝母组织培养技术应用于皖贝母的愈伤组织诱导时，诱导效果不理想。因此需要提供一种操作过程简单易行、诱导成功率高的适用于皖贝母愈伤组织诱导的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于皖贝母愈伤组织诱导增殖的方法，从而简化皖贝母愈伤组织诱导的操作过程，提高皖贝母愈伤组织的诱导成功率。

为达到以上目的，本发明提供了一种皖贝母愈伤组织诱导增殖方法，所述方法包括以下步骤：

将皖贝母生长期鳞茎消毒后切割成小方块，将其接种于诱导培养基中诱导形成愈伤组织后接种于增殖培养基中增殖获得致密愈伤组织；

其中，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有6-BA和NAA。

可选的，所述诱导增殖的步骤包括：

1)利用诱导培养基在19-21℃的培养温度下，黑暗培养14-16天；

2)黑暗培养结束后转移至光照强度为900-1100lx、光照时间为9-11h/d、培养温度为19-21℃的条件下培养32-36天获得愈伤组织。

3)将愈伤组织接种于增殖培养基中，在光照强度为1500-2000lx、光照时间为9-11h/d、培养温度为19-21℃的条件下培养38-42天进行增殖扩繁获得致密愈伤组织。

可选的，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有浓度为0.5-2.0mg/L的6-BA，浓度为0.2-4.0mg/L的NAA。

可选的，所述增殖培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有浓度为0.5-2.0mg/L的6-BA，浓度为0.2-2.0mg/L的NAA，浓度为50-300mg/L的水解乳蛋白。

可选的，所述诱导培养基还含有浓度为30-35g/L的蔗糖，浓度为6.5-7.0g/L的琼脂。

可选的，所述增殖培养基还含有浓度为50-60g/L的蔗糖，浓度为6.5-7.0g/L的琼脂。

可选的，所述诱导培养基和增殖培养基的pH为5.8-6.0。

可选的，所述消毒的步骤包括：

将清洗干净的鳞茎在75％的酒精中表面消毒50-70s后用无菌水清洗2-3次，再将鳞茎在0.1％的升汞溶液中浸泡8-12min后用2％的次氯酸钠水溶液浸泡12-16min。

本发明所提供的方法简单易行，缩短了愈伤组织诱导的周期，提高了诱导成功率，出愈率为70-83.33％，胚性愈伤率为80.95-84％；并且，依照本发明所提供的诱导增殖方法获得的愈伤组织具有更好的质量和发育成苗的性能。

附图说明

图1为皖贝母生长期鳞茎切块刚接种到诱导培养基中的情况；

图2为经过黑暗培养后移至光照条件下培养10天左右鳞茎切块开始膨大的情况；

图3为膨大的鳞茎切块形成的愈伤组织；

图4为增殖培养后获得的致密愈伤组织。

具体实施方式

下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明提供了一种皖贝母愈伤组织诱导增殖方法，所述方法包括以下步骤：

将皖贝母生长期鳞茎消毒后切割成小方块，将其接种于诱导培养基中诱导形成愈伤组织后接种于增殖培养基中增殖获得致密愈伤组织；其中，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有6-BA和NAA。

在本发明中，所述生长期鳞茎采自处于营养生长期的皖贝母种球，即地上部分开始长叶至有花蕾前，一般的，营养生长期的鳞茎处于细胞生长旺盛时期，可以用作外植体用于诱导获得结构致密的愈伤组织。

本发明所提供的方法还包括在进行消毒前的清洗步骤，本发明对于清洗的方法没有特别的限制，只要能够去除杂物获得洁净的鳞茎即可，在本发明的一种实施方式中，可以先剥除皖贝母鳞茎上带有的老鳞茎及根等杂物，然后将鳞茎置于有洗洁精的溶液中浸泡15-25min，浸泡期间不停的摇晃以脱除鳞茎表面的杂物，之后用流动清水冲洗鳞茎60-90min获得清洗干净的鳞茎。

根据本发明所提供的方法，所述消毒的步骤包括：

将清洗干净的鳞茎在75％的酒精中表面消毒50-70s后用无菌水清洗2-3次，再将鳞茎在0.1％的升汞溶液中浸泡8-12min后用2％的次氯酸钠水溶液浸泡12-16min。在用次氯酸钠溶液浸泡后，还需要用无菌水对鳞茎清洗3-5次，每次3-5min，清洗结束后，用无菌滤纸吸干鳞茎表面的水分。为了避免杂菌污染，上述步骤需要在超净工作台中进行。

在诱导前，将鳞茎切割成小方块，所述小方块的尺寸约为5mm×5mm×3mm。

在本发明所提供的方法中，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有浓度为0.5-2.0mg/L的6-BA，浓度为0.2-4.0mg/L的NAA。

为了获得更好的诱导效果，提高愈伤组织的诱导率、使愈伤组织的质地更坚实。优选的，所述诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有浓度为2.0mg/L的6-BA，浓度为0.5mg/L的NAA，或者，以MS培养基为基本培养基，含有浓度为0.5mg/L的6-BA，浓度为4.0mg/L的NAA。

在本发明所提供的方法中，所述增殖培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有浓度为0.5-2.0mg/L的6-BA，浓度为0.2-2.0mg/L的NAA，浓度为50-300mg/L的水解乳蛋白。

优选的，为了获得更好的增殖效果，所述增殖培养基为：以MS培养基为基本培养基，含有浓度为2.0mg/L的6-BA，浓度为0.5mg/L的NAA，浓度为300mg/L的水解乳蛋白。

其中，所述MS培养基由以下浓度的各组分组成：硝酸钾1900mg/L、硝酸铵1650mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、硫酸镁370mg/L、氯化钙440mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L、硫酸亚铁27.8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L。

在本发明的一种实施方式中，为了使皖贝母的鳞茎切块获得更加充分的营养，所述诱导培养基还含有浓度为30-35g/L的蔗糖，浓度为6.5-7.0g/L的琼脂；所述增殖培养基还含有浓度为50-60g/L的蔗糖，浓度为6.5-7.0g/L的琼脂。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导培养基和增殖培养基的pH为5.8-6.0。

具体的，所述诱导的步骤包括：

1)利用诱导培养基在19-21℃的培养温度下，黑暗培养14-16天；

2)黑暗培养结束后转移至光照强度为900-1100lx、光照时间为9-11h/d、培养温度为19-21℃的条件下培养32-36天获得愈伤组织。

在步骤2)的诱导培养过程中，鳞茎切块逐渐膨大，并缓慢形成淡黄色的、疏松的颗粒状的愈伤组织。一般的愈伤诱导结束后，愈伤组织的尺寸为1-2cm。

出愈率为70-83.33％，胚性愈伤率为80.95-84％。

本发明所提供的方法还包括增殖培养步骤3)，所述增殖培养的步骤包括：将诱导获得的愈伤组织接种于增殖培养基中，在光照强度为1500-2000lx、光照时间为9-11h/d、培养温度为19-21℃的条件下培养38-42天进行增殖扩繁，获得致密愈伤组织。

扩繁结束的标准为小块儿的疏松的愈伤组织变成大块儿的结构致密的具有嫩黄光泽的致密愈伤组织，并随着扩繁的进行，致密愈伤组织表面长出绿色的小叶，有的甚至分化出小鳞茎，可为下一步鳞茎的形成和整个组培苗的培育奠定基础。

下面通过实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本分发明进行各种修改和替换。

实施例1

本实施例用于说明本发明所提供的诱导增殖方法。

(1)将种在北林科技花卉工程技术中心温室花盆内处于营养生长时期的皖贝母种球挖出。

(2)剥除上述鳞茎上带有的旧鳞茎及根等杂物，然后置于含有洗洁精的溶液中浸泡20min，期间应不停地摇晃，之后用自来水进行流水冲洗90min，然后将鳞茎在超净工作台上采用75％酒精进行表面消毒60s，无菌水冲洗3次，然后用0.1％的升汞处理10min，再用2％的次氯酸钠水溶液处理15min，无菌水冲洗3次，每次5min，然后用无菌滤纸吸干表面的水分，待用；

(3)将步骤(2)中处理后的鳞茎切成5mm×5mm×3mm的小块共30块，然后将其接入诱导愈伤组织的培养基中进行诱导培养。

诱导培养基的组分为：MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA，并且诱导培养基中添加按照质量体积比浓度为30g/L的蔗糖，6.5g/L的琼脂，诱导培养基的pH值为5.98，在20℃的培养温度下，黑暗培养15天；黑暗培养结束后转移至光照强度为1000lx、光照时间为10h/d、培养温度为20℃的条件下培养32天获得愈伤组织。

(4)愈伤组织的增殖培养

将诱导获得的愈伤组织接种于增殖培养基中(以MS培养基为基本培养基，含有浓度为2.0mg/L的6-BA，浓度为0.5mg/L的NAA，浓度为300mg/L的水解乳蛋白，并且增殖培养基中添加按照质量体积比浓度为50g/L的蔗糖，6.5g/L的琼脂)，在光照强度为1500lx、光照时间为10h/d、培养温度为20℃的条件下培养40天进行增殖扩繁获得致密愈伤组织。

统计诱导获得的致密愈伤组织的平均数量及增殖情况，结果列于表1。

在诱导增殖过程中，观察皖贝母生长期鳞茎切块刚接种到诱导培养基中的情况(见图1)；经过黑暗培养后移至光照条件下培养10天左右鳞茎切块开始膨大的情况(见图2)；膨大的鳞茎切块形成的愈伤组织情况(图3)；增殖培养后获得的致密愈伤组织情况(图4)。

实施例2

采用与实施例1相同的方法进行愈伤组织诱导增殖，不同的是，所使用的诱导培养基为MS+0.5mg/L6-BA+4.0mg/LNAA，并且，诱导培养基中添加按照质量体积比浓度为30g/L的蔗糖，6.5g/L的琼脂，诱导培养基的pH值为5.95。

统计诱导获得的致密愈伤组织的平均数量及增殖情况，结果列于表1。

实施例3

采用与实施例1相同的方法进行愈伤组织诱导增殖，不同的是，所使用的诱导培养基为MS+0.5mg/L6-BA+2.0mg/LNAA，并且，诱导培养基中添加按照质量体积比浓度为30g/L的蔗糖，6.5g/L的琼脂，诱导培养基的pH值为5.82。

统计诱导获得的致密愈伤组织的平均数量及增殖情况，结果列于表1。

实施例4

采用与实施例1相同的方法进行愈伤组织诱导增殖，不同的是，所使用的诱导培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，并且，诱导培养基中添加按照质量体积比浓度为30g/L的蔗糖，6.5g/L的琼脂，诱导培养基的pH值为5.87。

统计诱导获得的致密愈伤组织的平均数量及增殖情况，结果列于表1。

实施例5

采用与实施例1相同的方法进行愈伤组织诱导增殖，不同的是，所使用的增殖培养基为MS+0.5mg/L6-BA+2.0mg/LNAA+300mg/L的水解乳蛋白。

统计诱导获得的致密愈伤组织的平均数量及增殖情况，结果列于表1。

实施例6

采用与实施例1相同的方法进行愈伤组织诱导增殖，不同的是，所使用的增殖培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+300mg/L的水解乳蛋白

统计诱导获得的致密愈伤组织的平均数量及增殖情况，结果列于表1。

实施例7

采用与实施例1相同的方法进行愈伤组织诱导增殖，不同的是，所使用的增殖培养基中不加入蔗糖。

统计诱导获得的致密愈伤组织的平均数量及增殖情况，结果列于表1。

实施例8

采用与实施例1相同的方法进行愈伤组织诱导增殖，不同的是，所使用的增殖培养基中加入50mg/L水解乳蛋白。

统计诱导获得的致密愈伤组织的平均数量及增殖情况，结果列于表1。

实施例9

采用与实施例1相同的方法进行愈伤组织诱导增殖，不同的是，增殖培养的步骤为：在光照强度为2000lx、光照时间为10h/d、培养温度为21℃的条件下培养38天进行增殖扩繁。

统计诱导获得的致密愈伤组织的平均数量及增殖情况，结果列于表1。

对比例1

采用沈淑瑜等在《安徽贝母的组织培养及细胞组织学观察》一文中的诱导增殖方法进行皖贝母(即安徽贝母)愈伤组织的诱导，步骤如下：

用三年生鳞茎，经三天低温处理后，用75％酒精及0.2％HgCl₂灭菌，然后切成约0.5cm²的小块，接种于MS+2.0mg/L2,4-D+1.0mg/L6-BA中，培养温度为26土2℃，光照强度600-700lx，光照8-10h/d，一个月后观察其诱导情况。

统计诱导获得的致密愈伤组织的平均数量及增殖情况，结果列于表1。

对比例2

根据俞超等在《浙贝母鳞茎愈伤组织诱导分化及植株再生研究》一文中报道的方法进行愈伤组织的诱导增殖，具体步骤为：鳞茎预处理后先用75％酒精振荡消毒3min,再分别用0.1％升汞、5％次氯酸钠、10％双氧水振荡消毒20，25，30min，用无菌水冲洗10次以上，在无菌滤纸上切成3～5mm长宽，2mm厚的鳞茎块，接种在诱导培养基MS+NAA1.5mg/L+KT0.5mg/L上；诱导前鳞茎块暗处理4～5d，5d后转入培养箱，培养温度(20±1)℃，培养光照强度为1600lx，光照时间为12h/d，培养30d后统计诱导获得的致密愈伤组织的平均数量及增殖情况，结果列于表1。

对比例3

采用与实施例1相同的方法进行愈伤组织诱导增殖，不同的是，所使用的增殖培养基为MS+1.0mg/LNAA+2.0mg/L2,4-D。

统计诱导获得的致密愈伤组织的平均数量及增殖情况，结果列于表1。

对比例4

采用与实施例1相同的方法进行愈伤组织诱导增殖，不同的是，所使用的增殖培养基为MS+1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+1.0mg/L2,4-D。

统计诱导获得的致密愈伤组织的平均数量及增殖情况，结果列于表1。

对比例5

采用与实施例1相同的方法进行愈伤组织诱导增殖，不同的是，诱导培养的步骤为：在19℃的培养温度下，黑暗培养7天；黑暗培养结束后转移至光照强度为1000lx、光照时间为10h/d、培养温度为19℃的条件下培养30天获得愈伤组织。统计诱导获得的致密愈伤组织的平均数量及增殖情况，结果列于表1。

表1

实施例	接种块数(个)	出愈率％	胚性愈伤率％	增殖率％	褐化率％
						实施例1	30	83.33	84.00	315.23	16.67
实施例2	30	80.00	83.33	312.46	20.00
						实施例3	30	73.33	81.82	298.21	16.67
实施例4	30	70.00	80.95	301.25	16.67
						实施例5	30	83.33	84.00	295.16	20.00
实施例6	30	83.33	84.00	298.37	23.33
						实施例7	30	83.33	84.00	153.56	13.33
实施例8	30	83.33	84.00	311.45	33.33
						实施例9	30	83.33	84.00	257.64	26.67
对比例1	30	66.67	70.00	——	——
						对比例2	30	36.67	63.64	——	——
对比例3	30	83.33	84.00	185.89	20.00
						对比例4	30	83.33	84.00	178.93	23.33
对比例5	30	76.67	78.26	286.08	20.00

表1中，出愈率(％)＝诱导形成致密愈伤组织的块数/接种数×100％；胚性愈伤率(％)＝胚性愈伤组织块数/诱导形成致密愈伤组织的块数×100％；增值率(％)＝(增殖后鲜重-增殖前鲜重)/增殖前鲜重×100％；褐化率(％)＝褐化的愈伤组织块数/接种块数×100％。

将实施例1-9以及对比例1-5中获得的结果进行比较，可以发现，6-BA和NAA的组合要优于和2,4-D、KT的组合，即KT对皖贝母愈伤组织的诱导效果比本发明所提供的方法差，此外，本发明采用的是新鲜的鳞茎，其诱导率(70％-83.33％)明显高于目前现有技术的诱导率(36.67％和66.67％)，且增殖率可高达300％左右，且激素配比简单，操作简单易行，愈伤组织多为胚性愈伤组织，结构致密且具有嫩黄光泽，质量好。

对比实施例1和7可以发现，蔗糖在增殖培养中发挥重要作用，是增殖培养过程中主要的碳源；对比实施例1和8可以发现，在50-300mg/L的范围内，水解乳蛋白对褐化的抑制作用明显；对比实施例1和9可以发现，在增殖培养过程中，光照强度增加时，增殖率降低，褐化率升高。综上所述，实施例1的方案效果最好。对比实施例1和对比例3、4可以发现，其增殖效果以实施例1最高，说明在增殖培养基中添加2,4-D对愈伤组织增殖有一定的抑制作用。对比实施例1和对比例5可以发现，诱导前的黑暗处理时间在本发明所提供的范围内时间越长出愈率越高。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽地描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种皖贝母愈伤组织诱导增殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

将皖贝母生长期鳞茎消毒后切割成小方块，将其接种于诱导培养基中诱导形成愈伤组织后接种于增殖培养基中增殖获得致密愈伤组织；

其中，所述诱导培养基为：MS+0.5-2.0mg/L6-BA+0.2-4.0mg/LNAA；

其中，所述增殖培养基为：MS+0.5-2.0mg/L6-BA+0.2-2.0mg/LNAA+300mg/L水解乳蛋白。

2.根据权利要求1所述的皖贝母愈伤组织诱导增殖方法，其特征在于，所述诱导增殖的步骤包括：

1)利用诱导培养基在19-21℃的培养温度下，黑暗培养14-16天；

2)黑暗培养结束后转移至光照强度为900-1100lx、光照时间为9-11h/d、培养温度为19-21℃的条件下培养32-36天获得愈伤组织；

3)将愈伤组织接种于增殖培养基中，在光照强度为1500-2000lx、光照时间为9-11h/d、培养温度为19-21℃的条件下培养38-42天进行增殖扩繁获得致密愈伤组织。

3.根据权利要求2所述的皖贝母愈伤组织诱导增殖方法，其特征在于，所述诱导培养基还含有浓度为30-35g/L的蔗糖，浓度为6.5-7.0g/L的琼脂。

4.根据权利要求3所述的皖贝母愈伤组织诱导增殖方法，其特征在于，所述增殖培养基还含有浓度为50-60g/L的蔗糖，浓度为6.5-7.0g/L的琼脂。

5.根据权利要求4所述的皖贝母愈伤组织诱导增殖方法，其特征在于，所述诱导培养基和增殖培养基的pH为5.8-6.0。

6.根据权利要求1、2或5所述的皖贝母愈伤组织诱导增殖方法，其特征在于，所述消毒的步骤包括：

将清洗干净的鳞茎在75％的酒精中表面消毒50-70s后用无菌水清洗2-3次，再将鳞茎在0.1％的升汞溶液中浸泡8-12min后用2％的次氯酸钠水溶液浸泡12-16min。