CN102835311A

CN102835311A - 一种卡特兰组织培养的方法

Info

Publication number: CN102835311A
Application number: CN2012102874843A
Authority: CN
Inventors: 邵和平; 张琼; 张宁宁; 孙永平; 夏明霞
Original assignee: JIANGSU HILLS DISTRICT NANJING AGRICULTURAL SCIENCE RESEARCH INSTITUTE
Current assignee: JIANGSU HILLS DISTRICT NANJING AGRICULTURAL SCIENCE RESEARCH INSTITUTE
Priority date: 2012-08-14
Filing date: 2012-08-14
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2032-08-14
Also published as: CN102835311B

Abstract

本发明涉及一种卡特兰组织培养繁殖的方法，属于植物细胞工程技术领域。以卡特兰新梢为材料，通过愈伤组织诱导、继代培养和生根培养，进行卡特兰组培苗的快速扩繁。本发明提高了培养基数，有效解决了卡特兰茎尖常规培养方法的外植体褐变现象，扩大了增殖系数，具有最高的诱导成活率；培养基配方在MS和KC基本培养基的基础上改良，易配制，成本低。本发明是现有技术的有益改进，可为卡特兰产业化开发应用提供技术支撑。

Description

一种卡特兰组织培养的方法

一、技术领域

本发明涉及一种卡特兰的组织培养快速繁殖方法，属于植物细胞工程技术领域。

二、背景技术

卡特兰是世界上栽培最多，最受人们喜爱的洋兰之一。它花型优美，色彩艳丽，并且有特殊的芳香。一年四季都有不同的品种开花。花期较长，一般可开放2～3周，不仅是珍贵的盆花，还是重要的高档切花。组织培养技术的应用大大促进了卡特兰的规模生产，不仅能加快新品种推广，而且能够获得可观的经济效益。但是卡特兰外植体在初始培养中易褐化死亡，是原球茎诱导成功的一大障碍。目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起，即培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起。选择适当的外植体是克服褐变的最主要的手段，取材时应注意选择分生能力较强的外植体。成年植株比幼苗褐变程度严重，夏季材料比冬季、早春及秋季材料的褐变严重，冬季培养物的存活率明显高于夏秋季节。因此，采芽时机应尽可能避开生长旺盛期。对外植体要充分漂洗，促进酚类物质渗出。培养基的成分与褐变程度有关，要考虑所选培养基的状态和类型，筛选适宜的培养基配方。在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞。在外植体接种1~2天后立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，使外植体尽快分生，连续转移5~6次，可基本解决外植体的褐变问题。

现有技术方案：切取优良母株的新梢进行茎尖诱导繁育。通过研究，筛选出适合卡特兰茎尖培养及分生苗生长的培养基配方和组培快繁技术。新梢经消毒后，于无菌条件下将外包嫩叶剥至1~2 片，小心切除芽基部，保留生长点内长约2~3cm的茎尖顶端分生组织块，接入茎尖培养基内培养，每瓶放1块。将接种后的培养基置于室温(25 ±2)℃、相对湿度70%~90%、光照强度2000lx条件下诱导培养，经继代培养和生根培养，长成合格分生苗。茎尖诱导培养以配方A. 1/2 MS + BA 2 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 椰乳200 ml/L + 3 %蔗糖和配方B. 1/2 MS + BA 2mg/L + NAA 0.2 mg/L + 3% 蔗糖效果较好，表现为茎尖组织块分生率较高，诱导培养40天后外植体基部分生出较多的愈伤组织和不定芽点，经继代培养，不定芽点逐渐发育长成不定芽，切取的不定芽块转入生根培养，60 天后长成根茎叶齐全、生长正常的分生瓶苗，可出瓶移栽。

现有技术从茎尖诱导不定芽到分生苗的培养周期较长，可能与卡特兰内源激素的作用和植物体生长发育周期较长有关。茎尖培养极易发生褐变，导致外植体切口组织坏死。需通过以下几个方面的工作减轻外植体的褐变发生：首先，要避免在高温季节采芽，因为高温有利植物体内酚类物质的产生，培养时褐变严重，新芽成活率较低，春秋季是较适宜的采芽季节；其次，需在培养基内单独或混合加入活性炭1g/L、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)5g/L、柠檬酸2g/L 等药剂抑制褐变；再次，培养温度要保持在20～25 ℃，此时培养材料分泌产生的酚类物质较少，室温超过30℃时，褐变物质显著增加，成活率大大降低；此外，暗培养和勤转瓶(15～20 天转1 次) 也能减轻褐化物质对外植体的危害。

三、发明内容

技术问题

本发明通过切取卡特兰新梢的顶芽和不同部位的侧芽生长点进行液体培养，详细描述了茎尖外植体的切割方法，一个新梢可以切取5个外植体，提高了增殖系数。其次通过适宜的激素配比和液体培养技术，有效解决卡特兰茎尖常规培养方法的外植体褐变现象，提高培养质量。因为酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。液体培养阻断了外植体与氧气的接触，可有效抑制褐变现象，从而简化卡特兰的茎尖培养流程。

技术方案

利用卡特兰新梢顶芽和侧芽分生组织为外植体，通过添加适宜的激素配比和液体培养条件，进行愈伤组织诱导和分化，促进愈伤组织增殖并分化出原球茎，切割原球茎进行继代培养，培养出幼苗，经生根培养长成合格的瓶苗。

具体步骤如下：

（1）外植体的选择与灭菌

选6~8厘米长的新梢作外植体，用升汞消毒法进行消毒，分别取新梢上顶芽和侧芽作外植体进行培养，切割顶芽和侧芽生长点中心部位的分生组织大小为直径2~4mm。

（2）愈伤组织诱导培养

将外植体分生组织块放置在诱导培养基中，卡特兰茎尖增殖的诱导培养基为：改良的MS + 6-BA3～10mg/L + NAA0.5～5mg/L + 糖20000～30000mg/L，培养条件为液体震荡暗培养，温度20～25℃，液体培养皿放置在回旋器上，回旋频率120rpm，培养40~60天；

其中，改良的MS基本培养基为，单位：mg/L： NH4NO3：850～1850、KNO3：1000～1900、CaCl2·2H2O：250～650、MgSO4·7H2O：200～400、KH2PO4：50～200、KI：0.4～0.9、H3BO3：3.0～7.0、MnSO4·4H2O：12.0～25.0、ZnSO4·7H2O：2.5～9.5、Na2MoO4·2H2O：0.16～0.35、CuSO4·5H2O：0.016～0.025、CoCl2·6H2O：0.016～0.025、FeSO4·7H2O：20.0～30.0、Na2·EDTA·2H2O：18.0～40.0、肌醇：50~100、氨基乙酸：2.0~3.0、谷氨酸：10~18、天冬酰胺酸：10~18；

（3）继代培养

把增殖的愈伤组织转接到继代培养基，培养基配方为：改良的KC + 琼脂6000～8000mg/L + 糖20000～30000mg/L，培养条件为：温度20～28℃，光强1500～3000Lx，每天光照 12~16小时，每30天转接1次，愈伤组织上逐渐分化出原球茎，原球茎进一步切割转接培养，发育成幼苗；

其中，改良的KC基本培养基为，单位：mg/L：Ca(NO3)2·4H2O：500~1000、KH2PO4：200~400、MgSO4·7H2O：100～300、(NH4)2SO4：400～1000、NH4NO3：350～850、FeSO4·7H2O：10～50、KCl：200~400、MnSO4·4H2O：3.0～10.0；

（4) 生根培养

将3～4cm高的苗接入生根培养基中，培养基配方为：改良的KC + NAA0.2~2mg/L + 琼脂6000～8000mg/L + 糖20000～30000mg/L。培养条件为：光照培养，温度为20～28℃，光强1500～3000Lx，每天光照16小时。幼苗长成合格的瓶苗。

有益效果：

本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

1、外植体选择途径有优势，即可以扩大增殖系数，相比顶芽培养侧芽分生力强，具有较高的培养成活率。

2、液体培养可以克服卡特兰茎尖培养极易发生褐变的障碍，提高培养质量。

3、培养基配方在MS和KC基本培养基的基础上改良，易配制，成本低。

四、附图说明

图1 新梢侧芽诱导的愈伤组织

图2 愈伤组织分化的丛生苗

图3 卡特兰幼苗

五、具体实施方式

1、切割卡特兰新梢的顶芽和侧芽作外植体培养材料。在每年春秋两季卡特兰生长旺盛期采集材料，选6~8厘米长的新梢，用利刀切下放入保鲜袋中。在实验室内先把外表的尘土彻底冲洗干净，用升汞消毒法进行消毒：剥去外层叶片，再用流水冲洗30分钟，再用0.1%的升汞消毒10分钟，最后用无菌蒸馏水漂洗6～8次，每次5分钟。分别取新梢上的顶芽和侧芽作外植体进行培养。顶芽外植体在芽点下部水平切取，再在生长点中心部位的四周切割取出分生组织块；侧芽外植体切取先从芽点的上部纵向斜切一刀，在生长点下部横切一刀，把生长点分离，再在生长点中心部位切取的分生组织块大小为直径4~6mm。

2、获取的分生组织块在解剖镜下用无菌解剖刀剥除残留的叶原基后，重新切取生长点中心部位的分生组织块大小为直径2~4mm，作为外植体进行初始培养。

3、将外植体放置在诱导培养基中，卡特兰茎尖增殖的诱导培养基为改良MS基本培养基和附加不同成份的物质，改良MS基本培养基为，单位：mg/L：NH4NO3：850～1850、KNO3：1000～1900、CaCl2·2H2O：250～650、MgSO4·7H2O：200～400、KH2PO4：50～200、KI：0.4～0.9、H3BO3：3.0～7.0、MnSO4·4H2O：12.0～25.0、ZnSO4·7H2O：2.5～9.5、Na2MoO4·2H2O：0.16～0.35、CuSO4·5H2O：0.016～0.025、CoCl2·6H2O：0.016～0.025、FeSO4·7H2O：20.0～30.0、Na2·EDTA·2H2O：18.0～40.0、肌醇：50~100、氨基乙酸：2.0~3.0、谷氨酸：10~18、天冬酰胺酸：10~18；附加成份为：6-BA 3～10mg/L、NAA 0.5～5mg/L、糖20000～30000mg/L。

4、液体震荡暗培养，温度为20～25℃，液体培养皿放置在回旋器上，回旋频率120rpm。培养40-60天。

5、把增殖的愈伤组织转接到继代培养基，培养基配方包括改良KC基本培养基和附加不同成份的物质，改良KC基本培养基为，单位：mg/L：Ca(NO3)2·4H2O：500~1000、KH2PO4：200~400、MgSO4·7H2O：100～300、(NH4)2SO4：400～1000、NH4NO3：350～850、FeSO4·7H2O：10～50、KCl：200~400、MnSO4·4H2O：3.0～10.0；附加成份为：琼脂6000～8000mg/L、糖20000~30000mg/L；

6、光照培养，温度为20～28℃，光强1500～3000Lx，每天光照 12~16小时。每30天转接1次。愈伤组织上逐渐分化出原球茎，原球茎进一步切割转接培养，发育成幼苗；

7、生根转接，将3～4cm高的苗接入生根培养基中，这种生根培养基包括改良KC基本培养基和附加不同成份的物质，改良KC基本培养基的成份与继代培养基相同，附加成份为NAA0.2~2mg/L、琼脂6000～8000mg/L、糖20000~30000mg/L；

8、光照培养，温度为20～28℃，光强1500～3000Lx，每天光照16小时。

培养结果：外植体选择顶芽和侧芽可以扩大培养基数4倍。统计了两批新梢顶芽和不同部位侧芽生长点的诱导成活率，顶芽、第一侧芽、第二侧芽、第三侧芽、第四侧芽的诱导成活率分别为：40%、20%、75%、25%、25%。相比顶芽培养，第二侧芽培养生长势强，具有最高的诱导成活率。液体培养无褐化现象发生，可以克服卡特兰茎尖固体培养极易发生褐变的障碍，提高培养质量。培养基配方在MS和KC基本培养基的基础上改良，易配制，成本低。

Claims

1.卡特兰的组织培养方法，其特征在于，

（1）外植体的选择与灭菌

选6~8厘米长的新梢作材料，用升汞消毒法进行消毒，切取顶芽和侧芽生长点中心部位的分生组织块作外植体进行培养；

（2）愈伤组织诱导培养

将外植体分生组织块放置在诱导培养基中，卡特兰茎尖增殖的诱导培养基为：改良的MS + 6-BA3～10mg/L + NAA0.5～3mg/L + 糖20000～30000mg/L，培养条件为液体震荡暗培养，温度20～25℃，液体培养皿放置在回旋器上，回旋频率120rpm，培养40-60天；

其中，改良的MS基本培养基为，单位：mg/L：NH4NO3：850～1850、KNO3：1000～1900、CaCl2·2H2O：250～650、MgSO4·7H2O：200～400、KH2PO4：50～200、KI：0.4～0.9、H3BO3：3.0～7.0、MnSO4·4H2O：12.0～25.0、ZnSO4·7H2O：2.5～9.5、Na2MoO4·2H2O：0.16～0.35、CuSO4·5H2O：0.016～0.025、CoCl2·6H2O：0.016～0.025、FeSO4·7H2O：20.0～30.0、Na2·EDTA·2H2O：18.0～40.0、肌醇：50~100、氨基乙酸：2.0~3.0、谷氨酸：10~18、天冬酰胺酸：10~18；

（3）继代培养

把增殖的愈伤组织转接到继代培养基，培养基配方为：改良的KC + 琼脂6000～8000mg/L + 糖20000～30000mg/L，培养条件为：温度20～28℃，光强1500～3000Lx，每天光照 12~16小时，每30天转接1次，愈伤组织上逐渐分化出原球茎，原球茎进一步发育成幼苗；

（4) 生根培养

将3～4cm高的苗接入生根培养基中，培养基配方为：改良的KC + NAA0.2~2mg/L + 琼脂6000～8000mg/L + 糖20000～30000mg/L，培养条件为：光照培养，温度为20～28℃，光强1500～3000Lx，每天光照16小时。

2.根据权利要求1所述卡特兰的组织培养方法，其特征在于，切割顶芽和侧芽生长点中心部位的分生组织块大小为直径2~4mm。