CN112314437B

CN112314437B - 一种荷花组织培养的初代培养方法

Info

Publication number: CN112314437B
Application number: CN202011222745.4A
Authority: CN
Inventors: 靖晶; 李军; 刘凤军; 姜红卫; 徐君
Original assignee: Suzhou Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Suzhou Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-11-05
Filing date: 2020-11-05
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2040-11-05
Also published as: CN112314437A

Abstract

本发明公开了一种荷花组织培养的初代培养方法，步骤包括：S1:挑选顶芽及腋芽完好无损的发育良好的藕根，用解剖刀片沿着顶芽基部，连根部将顶芽切下,作为外植体；S2:将切取的外植体浸泡在0.09‑0.16％洗洁精水里1‑2h，之后用小毛刷在洗洁精水里轻刷干净，然放置在流动的自来水下冲洗1‑2h，再置于超净工作台下，用无菌水冲洗5‑8次；S3:对外植体进行浸泡消毒处理：采用75％酒精消毒1‑3min后，再用0.1％次氯酸钠消毒10‑20min，最后再在2％ppm中浸泡1‑2h，再用无菌水冲洗5～6次，用无菌滤纸去除表面多余水分，本发明的方案可以有效降低荷花组织褐变率，实现更高的成活率、生长速度和出芽数。

Description

一种荷花组织培养的初代培养方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，特别是涉及一种荷花组织培养的初代培养方法

背景技术

荷花以其优美的姿态、丰富的花色深受我国人民喜爱，属我国的十大名花之一，具有较高的观赏价值和经济价值。近年来，随着我国经济的持续快速发展，人民生活水平不断提高，荷花碗莲、鲜切花产业日益兴盛，市场对荷花新品种的需求量日益旺盛和多元化。

传统荷花的育种方式是杂交育种，这种方式具有育种周期长工作量大、容易发生生殖障碍引起胚胎败育等缺点。通过分子生物学技术结合组织培养技术的育种方法，可以缩短育种年限，节约时间成本，是未来荷花育种发展的方向和趋势。

另外，荷花的常规繁殖方式主要依赖种藕分生进行无性繁殖，这种繁殖方式带来一系列问题，从淤泥里挖藕耗时耗力，同时长期的无性繁殖导致病毒的积累和品种的退化。而茎尖组织培养的方法是尝试解决这一问题的有效途径，不同消毒灭菌方式对莲茎尖诱导率也存在较大影响，不同的培养基类型对莲茎尖诱导率也存在影响

莲组培育苗困难，尤其以腋芽为外植体进行组织培养时，易发生外植体褐化、污染率高、诱导率低、芽苗不生长、分生困难、生根不稳定等技术瓶颈，严重限制了荷花分子育种方法的推广及应用,外植体的灭菌方式是困扰其组织培养困难的技术瓶颈

莲的组培再生体系建立极为困难，目前国内外有关莲通过愈伤组织实现再生培养成功的报道尚鲜少见。利用莲顶芽或腋芽离体培养诱导再生的快繁技术，一直是各研究机构的研发热点(李良俊，1998)。花莲作为观赏花卉，属莲的一大类，在这方面的研究才刚刚起步。在花莲芽离体培养的前期研究中，由于莲地下茎长期在泥土中生长，芽自身多带细菌，因此消毒极其困难，容易褐化，生理活性差，花莲地下茎段芽离体组培效果不理想，最佳始芽的分化率仅为58.1％(李良俊， 1995)。确定事宜的消毒剂类型和消毒时间对于外植体灭菌尤为重要，在植物组织培养中，升汞和次氯酸钠是目前比较常见的2种外植体消毒剂。大量的研究证明，升汞作为一种重金属强消毒剂，在杀死外植体表面细菌的同时，通常也大大降低了植株细胞的活性(李国树等2014)。次氯酸钠性质温和，但是单纯使用，消毒效果不佳，污染率高；消毒液的混合使用可以有效的降低外植体的污染率(周俊辉等2003),

莲组培育苗困难，尤其以腋芽为外植体进行组织培养时，易发生外植体褐化、污染率高、诱导率低、芽苗不生长、分生困难、生根不稳定等技术瓶颈，严重限制了荷花分子育种方法的推广及应用。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种一种荷花组织培养的初代培养方法。用以解决现有技术中外植体褐化、污染率高、诱导率低、芽苗不生长等问题。

本发明所采用的技术方案是：1、一种荷花组织培养的初代培养方法，包括如下步骤：

S1:挑选顶芽及腋芽完好无损的发育良好的藕根，用解剖刀片沿着顶芽基部，连根部将顶芽切下,作为外植体；

S2:将切取的外植体浸泡在0.09-0.16％洗洁精水里1-2h，之后用小毛刷在洗洁精水里轻刷干净，然放置在流动的自来水下冲洗1-2h，再置于超净工作台下，用无菌水冲洗5-8次；

S3:对外植体进行浸泡消毒处理：采用75％酒精消毒1-3min后，再用0.1％次氯酸钠消毒10-20min，最后再在2％ppm中浸泡1-2h，再用无菌水冲洗5～6次，用无菌滤纸去除表面多余水分；

S4:利用解剖刀将顶芽叶鞘剥去，外植体长度约1cm，以直插式插入诱导培养基上；

S5:接种后放置在光照培养箱中进行培养，设置光照强度1000～4000lx，每天光照12h，温度28℃。

优选的，所述诱导培养基的成分为：MS培养基+30.0g/L蔗糖+0.4研究不同细胞分裂素对顶芽诱导培养的影响，NAA浓度0.1mg/L，KT浓度梯度为 3.0mg/L。

优选的，所述S3中75％的酒精消毒1min,0.1％次氯酸钠消毒10min，2％ppm 中浸泡2h外植体消毒效果较佳。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)可以有效降低荷花组织褐变率，实现更高的成活率、生长速度和出芽数；

(2)可以增加组培快繁体系的稳定性，节省人力物力。

附图说明

图1为本发明实施例中外植体C型腋芽；

图2为本发明实施例中外植体A型顶芽

图3为本发明实施例中外植体B型顶芽。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明。

实施例：

本实施例所述材料均来源于苏州市农科院望亭荷花基地，自育品种“荷塘情深”。

S1:春季4月，荷花地下根状茎开始萌动，在荷花翻盆后，挑选顶芽及腋芽完好无损的发育良好的藕根，在自来水下将淤泥冲洗干净，带回实验室处理，用解剖刀片沿着顶芽基部，连根部将顶芽切下,作为外植体。

S2:将切取的外植体浸泡在0.09％洗洁精水里1h，之后用小毛刷在洗洁精水里轻刷干净，然放置在流动的自来水下冲洗1h，再置于超净工作台下，用无菌水冲洗5次；

S3:对外植体进行浸泡消毒处理：采用75％酒精消毒1min后，再用0.1％次氯酸钠消毒10min，最后再在2％ppm中浸泡2h，再用无菌水冲洗5次，然后用无菌滤纸去除表面多余水分；

采用本发明的方案，通过以下对比数据进行如下2组实验

表2.1不同灭菌方式的比较

表2.1

结果分析：

按照表1所设定的9种不同灭菌方法进行消毒和灭菌，培养30d后记录外植体的消毒污染情况。从表中可以看出，不同的处理方法，顶芽污染率的差异显著。 0.1％次氯酸钠消毒5min，污染率最高达到98.9％a。随着次氯酸钠消毒时间的延长，消毒时间10min的时候，污染率仅仅降低了2.23％，当时间延长至15min时，污染率下降了15.57％；升汞消毒5min，污染率为93.7a，随着升汞消毒时间的增加，从5min到15min，污染率仅仅下降了12.6％；当采用传统表面消毒剂结合生物消毒剂(ppm)的方法时(方法7)，对比不用ppm浸泡的方式，污染率下降了56.67％。当使用浓度更高的ppm浸泡，2％的ppm浸泡1h，污染率是31.3％d， 2％的ppm浸泡2h，污染率下降到27.77％d。因此，莲外植体消毒，效果最好的消毒方式是先用75％酒精消毒1min后，再用0.1％次氯酸钠处理10min，最后再在 2％ppm中浸泡2h。

2、不同外植体的污染、存活死亡对比

根据不同的解剖方式，将外植体分为A型、B型及C型，其中：A型顶芽为将顶芽外面包裹的叶鞘及几层未展开叶芽全部除掉，只剩下顶芽生长锥，外植体长度约1cm左右，；B型顶芽为只剥去顶芽外层叶鞘，保留顶芽生长锥和未展开叶芽，长度约1～2cm左右；C型腋芽为：仅仅除去顶芽外部包裹的一层叶鞘，外植体约1～2cm左右。之后按照如表2.21-2.23设定的实验方法进行消毒及杀菌，定期观察外植体污染及存活情况并进行记录，培养30d后外植体消毒实验结果如下表2.2.1所示。

表2.21：不同外植体类型污染情况比较

如表2.2.1所示，0.1％次氯酸钠消毒5min时，不同类型外植体污染率差异不显著，但是随着消毒时间的延长，不同类型的外植体污染情况差异显著，A类型外植体污染率最低，B类型外植体污染率次之，C类型外植体污染率最高。

在成活率的统计中(如下表2.2.2所示)，

表2.2.2不同外植体类型成活率比较

0.1％次氯酸钠消毒5min时，不同类型的外植体存活率均为0；消毒时间10min 时，不同类型的外植体存活率差异不显著；消毒时间15min时，差异显著，A类型外植体存活率最低，B类型外植体次之，C类型外植体最高。

在死亡率的比较中(如下表2.2.3)，

表2.2.3不同外植体类型死亡情况比较

0.1％次氯酸钠消毒5min时，不同类型的外植体死亡率差异不显著；消毒时间延长至10min、15min、20min时，不同类型外植体差异显著，C类型外植体死亡率最低，B类型外植体次之，A类型外植体死亡率最高。

1.不同诱导培养基配方对比

将大小一致的B型外植体芽接种至含有不同细胞分裂素的诱导培养基上进行初代培养，根据外植体生长的情况，对诱导率、外植体芽生长状况等生长指标进行统计。

结果(表2.3)所示，添加不同浓度的6-BA和KT，外植体的诱导效果差异显著。对比CK，添加一定浓度的6-BA和KT后，均能在一定程度上缩短芽的萌发期限，提高诱导率。随着6-BA和KT浓度的增加，芽的萌发天数明显变短，诱导率提高，芽的长度变短。A1-A4,诱导率差异显著，A4的诱导率达到84.43％，萌动天数也最短，但是后期芽苗生长势较弱，褐化严重。A3的诱导率同样可以达到83.33％，但是同时伴随有褐化问题。添加KT的培养基，从B1-B4，诱导率明显提高，芽的萌发速度也变的更快。B4的诱导率最高，但是芽后期生长势弱，B3的诱导率对比B4降低8.9％，芽萌发也较早、芽的生长很健壮。 B1、B2的芽诱导率均不高、萌发速度也较慢。在6-BA和KT的对比试验中，可以发现，KT比6-BA比较不会出现褐化问题。因此，综合考虑诱导率和芽的生长情况，比较适合芽初代诱导培养的培养基配方是B3，KT浓度为3.0 mg/L。

表2.3：不同细胞分裂素浓度对外植体诱导的影响

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种荷花组织培养的初代培养方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1:挑选顶芽及腋芽完好无损的发育良好的藕根，用解剖刀片沿着顶芽基部，连根部将顶芽切下,作为外植体;

S2: 将切取的外植体浸泡在0.09-0.16%洗洁精水里1-2h，之后用小毛刷在洗洁精水里轻刷干净，然放置在流动的自来水下冲洗1-2h，再置于超净工作台下，用无菌水冲洗5-8次；

S3:对外植体进行浸泡消毒处理：采用75%酒精消毒1-3 min后，再用0.1%次氯酸钠消毒10-20min，最后再在2%生物消毒剂ppm中浸泡1-2h，再用无菌水冲洗5~6次，用无菌滤纸去除表面多余水分；

S4: 利用解剖刀将顶芽叶鞘剥去，外植体长度约1cm，以直插式插入诱导培养基上；

S5: 接种后放置在光照培养箱中进行培养，设置光照强度1000~4000lx，每天光照12h，温度28℃;所述诱导培养基的成分为：MS培养基+30.0g/L蔗糖+NAA浓度0.1 mg/L+KT3.0mg/L。

2.如权利要求1所述的一种荷花组织培养的初代培养方法，其特征在于：所述S3中75%的酒精消毒1min,0.1%次氯酸钠消毒10min，2%生物消毒剂ppm中浸泡2h外植体消毒效果较佳。