CN102972290A - 一种提高白及组培苗移栽成活率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高白及组培苗移栽成活率的方法，所用专用培养基由种子萌发培养基1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.75mg/L+椰子汁20%+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L、增殖培养基MS+6-BA1.0mg/L+KT3.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L、生根培养基MS+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L组成，按以下步骤进行：A.白及种子无菌萌发；B、增殖培养；C、生根培养和抗逆诱导；D、炼苗移栽。本发明在生根阶段加入SA0.3g/L+CTS2g/L的自制诱抗剂10ml/L，使其在生根培养的同时诱导组培苗的抗逆性，增强苗对外界环境的适应能力，以提高苗的移栽成活率。

Description

一种提高白及组培苗移栽成活率的方法

技术领域

本发明属于组培育苗技术领域，具体说涉及一种提高白及组培苗移栽成活率的方法。 

  

背景技术：

白及（Bletilla striata（Thunb.）Rchb.f.）为兰科白及属多年生草本植物，以干燥假鳞茎入药，具有收敛止血，清热利湿，消肿生肌之功效，临床上广泛用于治疗咳血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、肺结核咳血、溃疡病出血等病症，在我国民间作为药用已有上千年的历史,为多种中成药的原料。另外工业上用作染布的粘合剂、在卷烟生产中用白及作粘合剂卷制烟条，在美容上用作护肤化妆品的原料，此外，白及花色艳丽，是一种很好的景观植物。近年来，由于白及的药用价值和观赏价值引起人们的关注，野生白及遭到过度采挖，导致野生资源越来越少，目前已被《中国植物红皮书一稀有濒危植物》第1册收录，同时也被写入了《濒危野生动植物国际贸易公约》保护种类。白及的种子非常细小且无胚乳，自然条件下极难萌发和生长，实生苗的栽培较为困难，传统栽培主要靠分株繁殖，但分株繁殖周期长，繁殖效率低，而且耗种量大，很难满足大量栽培的需要。组织培养技术可以快速繁殖大量种苗，远较分株繁殖快捷高效。近年来，一些地区开展了白及组培快繁的研究，但实验证明白及组培苗移栽成活率非常低，未能使组培快繁技术应用于生产实践。

  

发明内容：

本发明的目的在于提供一种提高白及组培苗移栽成活率的方法，该方法在生根阶段加入自制诱抗剂，使其在生根培养的同时诱导组培苗的抗逆性，增强苗对外界环境的适应能力，以提高苗的移栽成活率。

  

本发明的技术方案是：一种提高白及组培苗移栽成活率的方法，为组织培养方法，所用专用培养基由种子萌发培养基、增殖培养基、生根培养基组成，其中：

种子萌发培养基的配方配比为：1/2MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.75mg/L+椰子汁20%+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

增殖培养基的配方配比为：MS+6-BA 1.0mg/L + KT 3.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

生根培养基的配方配比为：MS+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L；

一种提高白及组培苗移栽成活率的方法，按以下步骤进行：

A. 白及种子无菌萌发：将采摘来的未开裂蒴果用自来水冲洗30min，然后用洗衣粉浸泡20min，再用自来水冲洗30min，然后在超净工作台上用75%酒精浸泡30秒，无菌水冲洗2-3次，再置于次氯酸钠溶液中12分钟，期间不断搅拌，无菌水冲洗3-5次，然后浸泡在无菌水中待用；用无菌的解剖刀将已消毒的白及蒴果切开，将白及种子接种在上述的种子萌发培养基中，培养于光照12小时/天，光照强度3000 1x，温度21士2^oC的培养室；接种一星期后，种子萌发为肉眼可见的白色原球茎，两星期后白色原球茎膨大变绿，萌发率可达到99%以上；

B、增殖培养：培养45天待种子苗长到2-3cm左右，在超净工作台上，将种子苗取出，采用直立插入的方法转接到上述的增殖培养基中，培养于光照12小时/天，光照强度3000 1x，温度21士2^oC的培养室。两个月后，增殖倍率达到5；

C、生根培养和抗逆诱导：在超净工作台上，将白及无根苗取出，采用直立插入的方式接种到上述的生根培养基中，生根培养基中同时加有自制诱抗剂10ml/L，培养于光照12小时/天，光照强度为30001x，温度为21士2^oC的培养室；两个月后，平均每株生根数可达到2-4条；所述自制诱抗剂的配方配比为：SA 0.3 g/L + CTS 2 g/L；

D、炼苗移栽：从培养室取出培养瓶，置于炼苗室常温适应3d，旋松盖子2d，然后开盖适应3d；炼苗完成后，洗干净白及根部的琼脂，移栽到盛有松针土的花盆中；花盆周围摆上装满水的盆或敞口瓶以保持周围环境的湿度，移栽后精心管理，每天早晚叶面喷水；2周后可观察到叶片返青，继续培养35天后可见到新叶开始生长，表明移栽的苗已经成活。

  

与现有技术相比，常规培养的白及组培苗移栽成活率非常低，仅为20%，本发明在生根阶段加入自制诱抗剂，使其在生根培养的同时诱导组培苗的抗逆性，增强苗对外界环境的适应能力，以提高苗的移栽成活率，这是本发明的关键点。通过本发明培养的组培苗，其移栽成活率可达63%，提高了43个百分点，是原成活率的3.15倍，说明本发明的处理确实有效。

  

附图说明

图1是处理A苗和处理B苗在PEG胁迫下的相对含水量； 

图2是处理A苗和处理B苗在PEG胁迫下的相对电导率。

  

具体实施方式：

下面根据附图和实施例对本发明的一种提高白及组培苗移栽成活率的方法作进一步的说明。

一种提高白及组培苗移栽成活率的方法，为组织培养方法，所用专用培养基由种子萌发培养基、增殖培养基、生根培养基组成。 

培养基筛选： 

首先，种子萌发培养基的选择：

选择基本培养基、6-BA、NAA、椰子汁四个因素，分别设定3个水平（见表1），采用L9（3⁴）正交表（见表2）进行正交试验以考察白及种子萌发的适宜培养基。各组培养基均添加30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH值为5.8。

                表1 白及种子萌发正交试验因素与水平表 

种子萌发作九组处理，各处理除种子萌发培养基不同外，其余处理方式相同，如下：

将采摘来的未开裂蒴果用自来水冲洗30min，然后用洗衣粉浸泡20min，再用自来水冲洗30min，然后在超净工作台上用75%酒精浸泡30秒，无菌水冲洗2-3次，再置于次氯酸钠溶液中12分钟，期间不断搅拌，无菌水冲洗3-5次，然后浸泡在无菌水中待用。用无菌的解剖刀将已消毒的白及蒴果切开，将白及种子接种在表2所述培养基中，培养于光照12小时/天，光照强度3000 1x，温度21士2^oC的培养室。两周后统计原球茎数、计算萌发率并对试验结果进行极差分析。白及种子萌发正交试验结果见表3，结果表明白及种子萌发培养基的最佳组合为A₂B₃C₂D₃,即1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.75mg/L+椰子汁20%。

  

表3  白及种子萌发正交试验结果

将白及种子接种到1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.75mg/L+椰子汁20%+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L的培养基上，两周后统计白及种子的萌发率达到99%以上，比正交设计中的任何一个组合都高，且萌发整齐统一，生长状态良好。

所以，选择种子萌发培养基的配方配比为：1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA 0.75mg/L+椰子汁20%+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L。 

  

增殖培养基的选择：

选择6-BA、KT、基本培养基三个因素，分别设定3个水平（见表4），采用L9（3⁴）正交表（见表5）进行正交试验以考察白及组培苗增殖培养的适宜培养基。各组培养基均添加30g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH值为5.8。

            表4  白及组培苗增殖培养正交试验因素与水平表 

增殖培养作九组处理，各处理除增殖培养基不同外，其余处理方式相同，如下：

种子无菌萌发：将采摘来的未开裂蒴果用自来水冲洗30min，然后用洗衣粉浸泡20min，再用自来水冲洗30min，然后在超净工作台上用75%酒精浸泡30秒，无菌水冲洗2-3次，再置于次氯酸钠溶液中12分钟，期间不断搅拌，无菌水冲洗3-5次，然后浸泡在无菌水中待用。用无菌的解剖刀将已消毒的白及蒴果切开，将白及种子接种在1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.75mg/L+椰子汁20%+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L的种子萌发培养基中，培养于光照12小时/天，光照强度3000 1x，温度21士2^oC的培养室。

增殖培养：培养45天待种子苗长到2-3cm左右，在超净工作台上，将种子苗取出，采用直立插入的方法转接到表5所述的培养基中，培养于光照12小时/天，光照强度3000 1x，温度21士2^oC的培养室。两个月后统计增殖倍率并对试验结果进行极差分析。白及增殖培养正交试验结果见表6，结果表明，白及组培苗增殖培养基的最佳组合为A₁B₃C₂,即MS+6-BA1.0mg/L+KT3.0mg/L。 

表6 白及增殖培养正交试验结果 

将白及组培苗接种到MS + 6-BA1.0 mg/L +KT3.0 mg/L +蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L的培养基上，2个月后统计增殖倍率为5，比正交设计中的任何一个组合都高，且苗生长良好。所以，选择增殖培养基的配方配比为：MS+6-BA1.0mg/L+KT3.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L。

  

生根培养基的选择：

选择NAA、IBA、基本培养基三个因素，分别设定3个水平（见表7），采用L9（3⁴）正交表（见表8）进行正交试验以考察白及组培苗生根培养的适宜培养基。各组培养基均添加20g/L蔗糖和8g/L琼脂，pH值为5.8。

             表7 白及生根培养正交试验因素与水平表 

生根培养作九组处理，各处理除生根培养基不同外，其余处理方式相同，如下：

种子无菌萌发：将采摘来的未开裂蒴果用自来水冲洗30min，然后用洗衣粉浸泡20min，再用自来水冲洗30min，然后在超净工作台上用75%酒精浸泡30秒，无菌水冲洗2-3次，再置于次氯酸钠溶液中12分钟，期间不断搅拌，无菌水冲洗3-5次，然后浸泡在无菌水中待用。用无菌的解剖刀将已消毒的白及蒴果切开，将白及种子接种在1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.75mg/L+椰子汁20%+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L的种子萌发培养基中，培养于光照12小时/天，光照强度3000 1x，温度21士2^oC的培养室。

    增殖培养：培养45天待种子苗长到2-3cm左右，在超净工作台上，将种子苗取出，采用直立插入的方法转接到MS+6-BA 1.0mg/L + KT 3.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L的增殖培养基中，培养于光照12小时/天，光照强度3000 1x，温度21士2^oC的培养室。培养2-3月，可得大量无根苗。 

生根培养：在超净工作台上，将白及无根苗取出，采用直立插入的方式接种到表8所述培养基中，培养于光照12小时/天，光照强度3000 1x，温度21士2^oC的培养室。2个月后统计生根数、计算平均每株生根数并对试验结果进行极差分析。白及组培苗生根培养正交试验结果见表9，结果表明白及组培苗生根培养基的最佳组合为A₁B₁C₃,即MS+NAA0.5mg/L。 

  

表9                      白及生根培养正交试验结果

将白及组培苗接种到MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L的培养基上， 2个月后统计白及组培苗平均每株生根数为3.1，比正交设计中的任何一个组合都高，且根系生长良好。所以，选择生根培养基的配方配比为：MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L。

  

自制诱抗剂的作用实验：

作两组处理，一组在生根阶段不加诱抗剂，另一组在生根阶段加入自制诱抗剂。操作如下：

种子无菌萌发：将采摘来的未开裂蒴果用自来水冲洗30min，然后用洗衣粉浸泡20min，再用自来水冲洗30min，然后在超净工作台上用75%酒精浸泡30秒，无菌水冲洗2-3次，再置于次氯酸钠溶液中12分钟，期间不断搅拌，无菌水冲洗3-5次，然后浸泡在无菌水中待用。用无菌的解剖刀将已消毒的白及蒴果切开，将白及种子接种在1/2MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.75mg/L+椰子汁20%+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L的种子萌发培养基中，培养于光照12小时/天，光照强度3000 1x，温度21士2^oC的培养室。

增殖培养：培养45天待种子苗长到2-3cm左右，在超净工作台上，将种子苗取出，采用直立插入的方法转接到MS+6-BA 1.0mg/L + KT 3.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L的增殖培养基中，培养于光照12小时/天，光照强度3000 1x，温度21士2^oC的培养室。培养2-3月，可得大量无根苗。 

生根培养：在超净工作台上，将白及无根苗取出，采用直立插入的方式接种到表10所述培养基中，培养于光照12小时/天，光照强度3000 1x，温度21士2^oC的培养室。 

  

表10、两组处理生根阶段所用培养基配方

相对含水量和相对电导率测定：

待生根后，取处理A苗和处理B苗，用无菌水将幼根冲洗干净，用无菌滤纸把组培苗表面水分吸去，放入MS营养液中适应性培养3d，然后移入30%的PEG-6000溶液中进行渗透胁迫处理。在处理的0天、1天、2天、3天、4天取成熟叶测定叶片相对含水量和相对电导率。

  

叶片相对含水量测定方法：

用千分之一的电子天平称取叶片鲜重（Wf），浸入蒸馏水中 12小时取出，吸干表面水分，称饱和鲜重（Wt），置烘箱 105℃下杀青 5min，70℃下烘至恒重，称干重（Wd），记录数据。叶片相对含水量（RWC）按下式计算：

RWC（%）=（Wf-Wd）/(Wt-Wd) × 100

相对电导率测定方法：

准确称取叶片0.200g，用去离子水冲洗2次，,并用洁净滤纸吸干多余水分,然后剪成约0.5cm²小块放入大试管中，准确加入10ml去离子水，用干净的纱布将试管封口，放入真空干燥器里用真空泵抽气半小时，室温下静置10min，摇匀，用DDS-11A数显电导仪测定溶液电导率S1，然后加试管塞后放入100℃沸水浴中15min，取出试管后用自来水冷却至室温，并在室温下平衡10min，摇匀，用电导仪测电导率S2，并同时测定去离子水电导率S0。按下列公式计算相对电导率：

相对电导率（％）＝100*(S1-S0)/(S2-S0)

处理A苗和处理B苗在30%PEG胁迫下的相对含水量变化见图1

处理A苗和处理B苗在30%PEG胁迫下的相对电导率变化见图2

相对含水量反映了植物的保水能力，在渗透胁迫下，植物叶片的相对含水量都是下降的，但抗性强的植物叶片含水量下降速度往往比抗性弱的植物叶片要迟缓。

从图1可见，两种组培苗相对含水量均随PEG胁迫处理时间的延长而下降，但处理B苗的相对含水量下降幅度小于处理A苗。说明在生根阶段加入诱抗剂培养的组培苗比没加诱抗剂培养的组培苗保水能力强。 

  

植物细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要的作用。正常情况下，细胞膜具有选择透性。当植物受到逆境胁迫时，如干旱、低温和高温等，细胞膜遭到破坏，膜透性增大，从而使细胞内的电解质外渗，使植物细胞浸提液的电导率增大。膜透性增大的程度与逆境胁迫强度有关，也与植物抗逆性的强弱有关。通常比较不同品种在相同胁迫下相对电导率的增大程度，即可在一定程度上反映品种间的抗逆性的强弱。

从图2看出，渗透胁迫下两种苗的相对电导率都有不同程度的增加，说明在渗透胁迫下细胞质膜受到了不同程度的破坏，但处理B苗的相对电导率的增加较缓慢，幅度较小。说明在生根阶段加入诱抗剂培养的组培苗较能保持植株在遭受逆境胁迫时膜系统的稳定，即对逆境的适应能力较强。 

    

处理A和处理B苗的炼苗移栽：生根后，从培养室取出培养瓶，置于炼苗室常温适应3d，旋松盖子2d，然后开盖适应3d。炼苗完成后，洗干净白及根部的琼脂，移栽到盛有松针土的花盆中。花盆周围摆上装满水的盆或敞口瓶以保持周围环境的湿度，移栽后精心管理，每天早晚叶面喷水。待苗开始长新叶时统计成活率。

    处理A和处理B的生根率、平均生根数及移栽成活率见表11 

表11、处理A和处理B的生根率、平均每株生根数及移栽成活率

处理B较处理A发根稍慢，但发根整齐，长势良好，移栽成活率显著提高。

  

特别说明：本发明所述移栽成活率是在组培苗移栽到基质后，开始生长新叶时统计的成活率，与一些文献中描述的成活率有区别。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变换材质、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。 

Claims (1)

1.一种提高白及组培苗移栽成活率的方法，其特征是：为组织培养方法，所用专用培养基由种子萌发培养基、增殖培养基和生根培养基组成，其中：

种子萌发培养基的配方配比为： 1/2MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.75mg/L+椰子汁20%+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

增殖培养基的配方配比为：MS+6-BA 1.0mg/L + KT 3.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉8g/L；

生根培养基的配方配比为：MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂粉8g/L；

按以下步骤进行：

A. 白及种子无菌萌发： 将采摘来的未开裂蒴果用自来水冲洗30min，然后用洗衣粉浸泡20min，再用自来水冲洗30min，然后在超净工作台上用75%酒精浸泡30秒，无菌水冲洗2-3次，再置于次氯酸钠溶液中12分钟，期间不断搅拌，无菌水冲洗3-5次，然后浸泡在无菌水中待用；用无菌的解剖刀将已消毒的白及蒴果切开，将白及种子接种在所述的种子萌发培养基中，培养于光照12小时/天，光照强度3000 1x，温度21士2^oC的培养室；接种一星期后，种子萌发为肉眼可见的白色原球茎，两星期后白色原球茎膨大变绿；

B、增殖培养：培养45天待种子苗长到2-3cm左右，在超净工作台上，将种子苗取出，采用直立插入的方法转接到所述的增殖培养基中，培养于光照12小时/天，光照强度3000 1x，温度21士2^oC的培养室；两个月后，增殖倍率达到5；

C、生根培养和抗逆诱导：在超净工作台上，将白及无根苗取出，采用直立插入的方式接种到所述的生根培养基中，生根培养基中同时加有自制诱抗剂10ml/L，培养于光照12小时/天，光照强度3000 1x，温度21士2^oC的培养室；两个月后，生根数可达2-4条/株；

所述自制诱抗剂的配方配比为：SA 0.3 g/L + CTS 2 g/L；

D、炼苗移栽：从培养室取出培养瓶，置于炼苗室常温适应3d，旋松盖子2d，然后开盖适应3d；炼苗完成后，洗干净白及根部的琼脂，移栽到盛有松针土的花盆中；花盆周围摆上装满水的盆或敞口瓶以保持周围环境的湿度，移栽后精心管理，每天早晚叶面喷水；2周后可观察到叶片返青，继续培养35天后可见到新叶开始生长，表明移栽的苗已经成活。

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