CN105039173B - 一种千层塔内生被孢霉菌及其应用 - Google Patents

一种千层塔内生被孢霉菌及其应用 Download PDF

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本发明公开了一种千层塔内生被孢霉菌及其应用，该被孢霉菌的分类命名为被孢霉(Mortierella sp.)，保藏编号：CGMCC10769，CGMCC10769可使千层塔中石杉碱甲的量提高到对照的1.3倍，为获得高含量石杉碱甲的千层塔资源提供新途径。该霉菌发酵获得菌丝，将菌丝稀释后施加到千层塔培养基质中，从而提高千层塔中石杉碱甲的含量，达到对照的130％。该方法将千层塔的内生真菌作为生物诱导剂添加到栽培基质中，可显著提高千层塔中石杉碱甲的含量，从而为获得高含量石杉碱甲的千层塔资源提供新途径。

Description

一种千层塔内生被孢霉菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种千层塔内生被孢霉菌及其应用。
背景技术
千层塔(Huperzia serrata(Thunb.)Trev.)为石松目(Lycopodiales)石杉科(Lycopodiaceae)石杉属(Lycopodium L.)多年生草本蕨类植物。千层塔始载于《植物名实图考》，性味辛苦、平。具有散瘀消肿、解毒和止痛的功效。1927年我国科技工作者报道了从该植物中分离的石杉碱甲具有横纹肌松弛作用，之后的大量研究发现石杉碱甲是一种高效、低毒、可逆和高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂。现在，被石杉碱甲及经作为治疗阿尔茨海默病(AD，Alzheimer disease)的药物，同时在美国被用做益智的营养保健品。
千层塔是重要的药用低等蕨类植物，现存的该类植物大多生长缓慢，野生状态下千层塔的繁殖主要以孢子繁殖为主，孢子萌发周期长，萌发后属地下生配子体，需6-15年才能成熟。因此极大地限制了千层塔野生资源的再生。千层塔中的石杉碱甲含量又很低(0.007％)，再加上其全合成石杉碱甲步骤繁琐、价格昂贵且有副作用。目前，石杉碱甲的提取主要依赖于野生资源，提取率仅为0.006％-0.1％，因而大量的市场需求、受限的自然资源和自身生长繁殖的限制。因此，不论是石杉碱甲直接或者间接获得都是以千层塔的原植物为原料，这种自然界有限的资源将处于灭绝的边缘。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种千层塔内生被孢霉菌及其应用，该被孢霉菌的分类命名为被孢霉(Mortierella sp.)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2015年6月10日，保藏编号：CGMCC10769，CGMCC10769可使千层塔中石杉碱甲的量提高到对照的1.3倍，为获得高含量石杉碱甲的千层塔资源提供新途径。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种千层塔内生被孢霉菌，该被孢霉菌的名称为被孢霉，Mortierella sp.，该被孢霉菌的保藏编号为CGMCC10769。
所述的千层塔内生被孢霉菌促进千层塔中石杉碱甲生成的应用。
具体的，该应用包括在千层塔植株移栽培养过程中将千层塔内生被孢霉菌菌丝放置在千层塔植株的根部用于促进千层塔中石杉碱甲生成。
更具体的，将质量为20～80mg千层塔内生被孢霉菌菌丝放置在单株千层塔的根部用于促进千层塔中石杉碱甲生成。
再具体的，将千层塔植株在温度为25℃±2℃、光照强度为2000Lux和光周期16小时的条件下进行移栽培养。
本发明的优点在于：
(1)本发明从千层塔根部分离出高山被孢霉(Mortierella alpina)，该被孢霉菌的分类命名为被孢霉(Mortierella sp.)，保藏编号：CGMCC10769，通过在千层塔植株栽培过程中加入该菌的菌丝体溶液，可明显提高千层塔中石杉碱甲的含量，从而为获得高含量石杉碱甲的千层塔资源提供新途径；
(2)本发明通过在千层塔植株栽培过程中添加从其根部分离出的高山被孢霉活菌丝，可使千层塔中石杉碱甲的含量提高到0.052％，每株千层塔植株根部周围浇灌的内生真菌悬浮液中内生真菌菌丝的剂量为60mg。
具体实施方式
根际内生真菌侵染宿主后，与宿主稳定的长期相互作用即形成内生菌根。内生菌根能与80％的陆生植物形成共生关系，这种共生关系有利于提高植物抗御不良环境的能力,促进植物生长。目前大量研究表明内生菌根能促进植物吸收土壤中的无机盐等养分，诱导产生植物激素，例如细胞分裂素和赤霉酸，促进植物生长，分泌生物碱、萜类、类黄酮和类固醇等抗菌活性物质，帮助植物防御病原体，提高植物的抗病性等。
本发明从千层塔根部分离出高山被孢霉(Mortierella alpina)，该被孢霉菌的分类命名为被孢霉(Mortierella sp.)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2015年6月10日，保藏编号：CGMCC10769，通过在千层塔植株栽培过程中加入该菌的菌丝体溶液，可明显提高千层塔中石杉碱甲的含量，从而为获得高含量石杉碱甲的千层塔资源提供新途径。
采用该方法能够使千层塔中石杉碱甲的含量提高30％从而为获得高含量石杉碱甲的千层塔资源提供新途径。
本发明的千层塔野生植株采自湖北省恩施市盛家坝乡。
CGMCC10769的分离：
取野生千层塔新鲜的根，用0.1％氯化汞溶液进行表面灭菌，取其根毛区，用5％次氯酸钠溶液进行表面灭菌；然后放置到PDA固体培养基(马铃薯200g、葡萄糖20g)上培养；培养30天后，获得内生菌菌丝体。
再通过PDA固体培养基,采用平板划线法获得内生菌的纯培养物；
CGMCC10769的鉴定：
将CGMCC10769通过分子生物学方法进行鉴别，rDNA的ITS片段的扩增产物与GENBANK中的高山被孢霉(Mortierella alpina)序列比对，近缘性≥99％。该菌的ITS序列如下(从5’—3’端)：
TTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAGCCCTACCTGATTTCAGATCAAAATTTGAATGAGTTTTCTGTATTATCAAGACTGACTCCTGGAGCAAATGTTAGCCAAAGATTTGACAATGAATGCCAAAACTATTAGGCCAAACTGCTGTATTAGGTGACAGCCAAGAACTACATTTTAAAAGGGCCAACCATGACAGTCGGCGCATTCCAATTCCACGCCATAAACCCAAAGGTTAGGTGTGAGAGTGCTCATGATACTGAAACAGGCATACTCCTCGGAATACCAAGGAGTGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACGTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTTTTAAACAGATTATTAAAATCATTTGTTTAATTGTTCAGAAAAAATTTCATAAGGATGATATATTGTTTTTGGGACCGGCCCTTGCGAACCATTTTAAAGTCCCAAAATTACATACGGTCAAAGCCAGCACAAAGGAAAAGATCTTTCAGTGTTGAAAGATTTCTCTTGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAG。
以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：
将千层塔株高大于5cm的野生植株移栽到水苔基质中培养。培养温度25℃±2℃，光照强度为2000Lux、光周期16小时。2个月后千层塔中石杉碱甲的含量为0.019％。
实施例2：
(1)千层塔根被孢霉属真菌的分离
取野生千层塔新鲜的根，用0.1％氯化汞溶液进行表面灭菌，取其根毛区，用5％次氯酸钠溶液进行表面灭菌；然后放置到PDA固体培养基(马铃薯200g、葡萄糖20g)上培养；培养30天后，获得内生菌菌丝体；
再通过PDA固体培养基,采用平板划线法获得内生菌的纯培养物；
(2)内生菌灭活菌丝的制备
将内生菌纯培养物接种于PDA液体培养基中，培养条件在28℃、摇床转速120转/分钟的培养条件下获得菌丝体，将菌丝冷藏于4℃下过夜。次日取出，在室温下用搅拌机将菌丝打断，然后用自来水稀释备用。
(3)千层塔中石杉碱甲的诱导
将千层塔高于5cm的野生植株移栽到水苔基质中，培养2周后，将灭活的菌丝悬浮液浇灌到千层塔小苗根部周围，每株千层塔植株根部周围浇灌的内生真菌悬浮液中内生真菌菌丝的质量为20mg。培养温度25℃±2℃，光照强度为2000Lux、光周期16小时。
2个月后测定千层塔中石杉碱甲的含量为0.022％。
实施例3：
本实施例与实施例2不同的是，将千层塔移栽到水苔基质中，培养2周后，将灭活的菌丝悬浮液浇灌到千层塔小苗根部周围，每株千层塔植株根部周围浇灌的内生真菌悬浮液中内生真菌菌丝的剂量为40mg。培养温度25℃±2℃，光照强度为2000Lux、光周期16小时。2个月后测定千层塔中石杉碱甲的含量为0.036％。
实施例4：
本实施例与实施例2不同的是，将千层塔移栽到水苔基质中，培养2周后，将灭活的菌丝悬浮液浇灌到千层塔小苗根部周围，每株千层塔植株根部周围浇灌的内生真菌悬浮液中内生真菌菌丝的剂量为60mg。培养温度25℃±2℃，光照强度为2000Lux、光周期16小时。2个月后测定千层塔中石杉碱甲的含量为0.052％。
实施例5：
本实施例与实施例2不同的是，将千层塔移栽到水苔基质中，培养2周后，将灭活的菌丝悬浮液浇灌到千层塔小苗根部周围，每株千层塔植株根部周围浇灌的内生真菌悬浮液中内生真菌菌丝的剂量为80mg。培养温度25℃±2℃，光照强度为2000Lux、光周期16小时。2个月后测定千层塔中石杉碱甲的含量为0.050％。

Claims (5)

1.一种千层塔内生被孢霉菌，其特征在于，该被孢霉菌的名称为被孢霉(Mortierellasp.)，该被孢霉菌的保藏编号为CGMCC10769。
2.权利要求1所述的千层塔内生被孢霉菌促进千层塔中石杉碱甲生成的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，该应用包括在千层塔植株移栽培养过程中将千层塔内生被孢霉菌菌丝放置在千层塔植株的根部用于促进千层塔中石杉碱甲生成。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，将质量为20～80mg千层塔内生被孢霉菌菌丝放置在单株千层塔植株的根部用于促进千层塔中石杉碱甲生成。
5.如权利要求2、3或4所述的应用，其特征在于，将千层塔植株在温度为25℃±2℃、光照强度为2000Lux和光周期16小时的条件下进行移栽培养。
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