CN108719070A - 一种白及的组培种子消毒及接种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白及的组培种子消毒及接种方法，属于植物组织培养技术领域。本方法是：①配置0.5mg/L萘乙酸水溶液；②高压蒸汽灭菌；③白及种子准备；④白及种子表面消毒及接种，在超净工作台中，取出含有白及种子的茶叶包放入灭菌瓶中，加入75%酒精消毒30‑45秒后倒出酒精，再加入2%次氯酸钠溶液，消毒4‑6分钟，在消毒过程中要不断小心摇晃，之后倒掉；用镊子夹出消毒后的茶叶包放入另一灭菌瓶中，用无菌水清洗4‑5次；取出茶叶包，用灭菌刀切去茶叶包边缘，用镊子取出种子接入培养基表面摊匀，盖好盖子即可进行培养。本发明将白及种荚里种子直接取出进行消毒，再装入茶叶包中并用0.5mg/L萘乙酸溶液进行前处理，操作更为简便，提高了工作效率，降低了工作成本。

Description

一种白及的组培种子消毒及接种方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种白及的组培种子消毒及接

种方法。

背景技术

白及（Bletilla striata (Thunb.ex A. Murray) Rchb.f.）为兰科白及属多年生草本植物，植株高18-60cm；假鳞茎扁球形，上面具荸荠似的环带，富粘性；茎粗壮，劲直。

白及常野生于丘陵、低山溪边以及阴蔽草丛或者林下湿地，分布于我国秦岭以南省区以及日本等地，以块茎入药，具有补肺止血、消肿生肌等功效；同时也广泛应用于医药、美容、涂料、印染等行业。近年来，由于需求量大，人工野生白及受到严重的私挖滥采，资源量急剧减少，已经列入世界濒危植物保护品种，且已被《中国植物红皮书—稀有濒危植物》第1册收录，同时也被写入了《濒危野生动植物国际贸易公约》（CITES）保护种类。

尽管白及生长过程中能大量生产种子，但种子极细小，只有在显微镜下才能看得清，质轻且构造简单无胚乳，处于原胚阶段，不具备自然萌发所需的足够养分。在自然状态下，白及种荚成熟以后会开裂，释放种子。白及种荚是封闭的，未开裂时可采用75%酒精和升汞溶液等消毒剂对种荚表面进行消毒。但白及种荚在贮藏过程中，易于开裂，导致种子失水且易受污染，难以正常进行表面消毒，进而影响白及种子萌发率和种荚利用率。

CN106171974A公开了一种白及种子表面消毒及接种方法，主要采用将滤膜放入注射器针头及针管之间夹紧，然后将白及种子放入针管中，采用75%酒精10ml浸泡30秒，10ml0.1%升汞消毒7-10分钟，再用无菌水清洗5次。最后将消毒后的白及种子混入经灭菌的洗洁精分散剂后再打入各个培养基表面。这种方式解决了白及种子表面消毒，且接种时种子分布较均匀。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种白及的组培种子消毒及接种方法，不仅能够有效控制消毒时间，保证消毒效果，还可以提高白及种子萌发率和种荚利用率，操作简便。

本发明的目的是这样实现的，具体地说，本方法包括以下步骤：

①配置0.5mg/L萘乙酸水溶液

在1L蒸馏水中加入0.5mg/L萘乙酸，摇晃混匀；

②高压蒸汽灭菌

将一次性小号茶叶包装入玻璃瓶中密封，与0.5mg/L萘乙酸溶液、蒸馏水一起放入高压蒸汽灭菌锅中，在116℃条件灭菌30分钟后放入超净工作台待用；

③白及种子准备

在超净工作台中，用75%酒精擦拭白及种荚表面后取出种子，放入一次性小号茶叶包，茶叶包拉线系紧后放入0.5mg/L萘乙酸水溶液中浸泡5-24小时；

④白及种子表面消毒及接种

在超净工作台中，取出含有白及种子的茶叶包放入灭菌瓶中，加入75%酒精消毒30-45秒后倒出酒精，再加入2%次氯酸钠溶液，消毒4-6分钟，在消毒过程中要不断小心摇晃，之后倒掉；用镊子夹出消毒后的茶叶包放入另一灭菌瓶中，用无菌水清洗4-5次；取出茶叶包，用灭菌刀切去茶叶包边缘，用镊子取出种子接入培养基表面摊匀，盖好盖子即可进行培养。

本方法的工作机理

本方法主要为提高白及种荚的利用率和种子萌发率，将裂开的白及种荚里的种子用茶叶包收集起来进行一系列前期处理和消毒操作，最后进行接种组培。

与现有技术相比，本方法的创新点在于：

现有白及组培，大部分均采用完好没裂开的白及种荚进行表面消毒，然而白及种荚在储存过程中，极易随着时间延长会裂开，储存在种荚里面的种子也会因此失水，从而降低了白及种荚利用率和种子萌发率。本方法主要为将裂开的白及种荚种子直接取出进行消毒和接种，改善了现有白及组培大部分只能利用完整种荚进行消毒接种的局限，提高了白及种荚的利用率；同时，本方法创造性的将白及种子取出装入茶叶包后放入萘乙酸溶液中进行前期处理，增强了白及种子的活力，提高了白及种子萌发率。

与CN106171974A公开的一种白及种子表面消毒及接种方法相比，本方法不是采用注射器等工具，而是将白及种子装入茶叶包中，方便整体操作，且若干个处理可同时进行，提高了工作效率，降低了工作成本。

与现有技术相比，本发明具有下列优点和积极效果：

①本发明将白及种荚里种子直接取出进行消毒，解决了裂开的白及种荚无法正常进行表面消毒的问题，提高了白及种荚的利用率；

②本发明将白及种子装入茶叶包中并用0.5mg/L萘乙酸溶液进行前处理，解决了由于长时间储存导致白及种子失水不易萌发的问题，提高了白及种子的萌发率；

③本发明采用茶叶包而不是注射器处理白及种子，操作更为简便，且若干个处理可同时进行，提高了工作效率，降低了工作成本。

附图说明

图1-1是裂开的白及种荚图片，

图1-2是白及种子图片；

图2是在超净工作台上将白及种子装入灭菌的茶叶包图片；

图3是将茶叶袋放入0.5mg/L萘乙酸水溶液中浸泡图片；

图4是次氯酸钠消毒图片；

图5-1是水冲洗后接种图片之一，

图5-2是水冲洗后接种图片之二，

图5-3是水冲洗后接种图片之三。

具体实施方式

下面结合实施例和附图详细说明：

一、实施例1

1、配置0.5mg/L萘乙酸水溶液：在一升蒸馏水中加入0.5mg/L萘乙酸，摇晃混匀；

2、高压蒸汽灭菌：将一次性小号茶叶包装入玻璃瓶中密封，与0.5mg/L萘乙酸溶液、蒸馏水一起放入高压蒸汽灭菌锅中，在116℃条件灭菌30分钟后放入超净工作台待用；

3、白及种子准备：在超净工作台中，用75%酒精擦拭白及种荚表面后取出种子（如图1-1,1-2），放入一次性小号茶叶包（如图2）；茶叶包拉线系紧后放入0.5mg/L萘乙酸水溶液中浸泡5小时（如图3）；

4、白及种子表面消毒及接种：在超净工作台中，取出含有白及种子的茶叶包放入灭菌瓶中，加入75%酒精消毒40秒后倒出酒精，再加入2%次氯酸钠溶液，消毒4分钟（如图4），在消毒过程中要不断小心摇晃，之后倒掉；用镊子夹出消毒后的茶叶包放入另一灭菌瓶中，用无菌水清洗4-5次；取出茶叶包（如图5-1），用灭菌刀切去茶叶包边缘（如图5-2），用镊子取出种子接入9瓶培养基表面摊匀（如图5-3），盖好盖子进行培养；

10天后，污染率为22.2%，种子萌发率为80.7～83.8%。

二、实施例2

1、重复实施例1中1-3步骤；

2、白及种子表面消毒及接种：在超净工作台中，取出含有白及种子的茶叶包放入灭菌瓶中，加入75%酒精消毒40秒后倒出酒精，再加入2%次氯酸钠溶液，消毒5分钟，在消毒过程中要不断小心摇晃，之后倒掉；用镊子夹出消毒后的茶叶包放入另一灭菌瓶中，用无菌水清洗4-5次；取出茶叶包，用灭菌刀切去茶叶包边缘，用镊子取出种子接入9瓶培养基表面摊匀，盖好盖子进行培养；

10天后，污染率为11.11%，种子萌发率80.0～84.3%。

三、实施例3

1、重复实施例1中1-3步骤；

2、白及种子表面消毒及接种：在超净工作台中，取出含有白及种子的茶叶包放入灭菌瓶中，加入75%酒精消毒40秒后倒出酒精，再加入2%次氯酸钠溶液，消毒6分钟，在消毒过程中要不断小心摇晃，之后倒掉。用镊子夹出消毒后的茶叶包放入另一灭菌瓶中，用无菌水清洗4-5次。取出茶叶包，用灭菌刀切去茶叶包边缘，用镊子取出种子接入9瓶培养基表面摊匀，盖好盖子进行培养；

10天后，污染率为0，种子萌发率为79～89.2%。

本实验采用的白及种荚储存期为7-8个月；运用此方法时，次氯酸钠的消毒时间越长在一定程度上可以降低污染率，但对白及种子萌发率可能有一定影响；经过多次实验重复，在控制污染率并保证白及种子萌发率的情况下，次氯酸钠消毒时间在4-6分钟皆可。

Claims (1)

1.一种白及的组培种子消毒及接种方法，其特征在于包括下列步骤：

①配置0.5mg/L萘乙酸水溶液

在1L蒸馏水中加入0.5mg/L萘乙酸，摇晃混匀；

②高压蒸汽灭菌

将一次性小号茶叶包装入玻璃瓶中密封，与0.5mg/L萘乙酸溶液、蒸馏水一起放入高压蒸汽灭菌锅中，在116℃条件灭菌30分钟后放入超净工作台待用；

③白及种子准备

在超净工作台中，用75%酒精擦拭白及种荚表面后取出种子，放入一次性小号茶叶包，茶叶包拉线系紧后放入0.5mg/L萘乙酸水溶液中浸泡5-24小时；

④白及种子表面消毒及接种

在超净工作台中，取出含有白及种子的茶叶包放入灭菌瓶中，加入75%酒精消毒30-45秒后倒出酒精，再加入2%次氯酸钠溶液，消毒4-6分钟，在消毒过程中要不断小心摇晃，之后倒掉；用镊子夹出消毒后的茶叶包放入另一灭菌瓶中，用无菌水清洗4-5次；取出茶叶包，用灭菌刀切去茶叶包边缘，用镊子取出种子接入培养基表面摊匀，盖好盖子即可进行培养。