CN105112365A - 一种人脐带间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种人脐带间充质干细胞的无血清培养基，属于干细胞技术领域，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分：重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、纤维连接蛋白、维生素C、生物素、干细胞生长因子和干细胞因子。本发明提供的人脐带间充质干细胞的无血清培养基无需进行培养瓶包被，操作简便，细胞增殖速率高，且保持了良好的干细胞幼稚形态和干细胞特性，具有良好的细胞诱导分化潜能，降低了成本。

Description

一种人脐带间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，涉及一种人脐带间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法。

背景技术

人脐带间充质干细胞源自脐带华尔氏通胶，是具有明显可塑性和多向分化潜能的一种成体干细胞，在不同生长因子的调节下，可分化成来源于3个胚层的不同组织细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞、肝样细胞、心肌样细胞、神经胶质细胞、神经元细胞和胰岛样细胞等。

干细胞生长因子（SCGF）是一种在骨髓造血微环境中起作用的早期造血刺激因子，具有多种生物学活性，在组织的损伤修复和伤口愈合过程中有显著的作用。现有的人干细胞生长因子有2种形式，即全长分子hSCGF-α和截短型分子hSCGF-β。市场上销售的重组hSCGF-α和重组hSCGF-β主要由PeproTech公司生产。

干细胞因子（SCF）是重要造血细胞因子，是酪氨酸激酶受体c―Kit的配体。SCF主要作用于早期造血干细胞、原始造血祖细胞，并且诱导这些细胞的存活、增殖和分化。

传统的含动物血清的干细胞培养基给干细胞的生产与科研带来多种不利因素。血清能为干细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，但其存在诸多缺点：批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，成分不明确，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。

无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入成分明确的血清替代成分，既能满足干细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。因此，发展无血清培养基是干细胞走向临床应用的重要条件。目前已有一些市售人脐带间充质干细胞无血清培养基，但是现有市售无血清培养基存在细胞贴壁性差、细胞增殖不够理想、价格昂贵等缺陷。比如Gibco无血清培养基、StemCELL无血清培养基的应用需要进行培养瓶包被，且培养的细胞增殖速率不够理想。

中国专利申请CN104164404公开了一种人脐带间质干细胞培养基，该培养基以a-MEM为基础培养基，添加的细胞因子及其他组分多达29种，组分非常复杂。

因此，现有技术存在细胞贴壁性差，组分过于复杂，细胞增殖速率不够理想等问题。

发明内容

为解决现有技术中存在的细胞贴壁性差，组分过于复杂，细胞增殖速率不够理想等问题，发明人通过大量试验筛选，得到一种人脐带间充质干细胞的无血清培养基，该培养基无需进行培养瓶包被，操作简便，细胞增殖速率高，且保持了良好的干细胞幼稚形态和干细胞特性，具有良好的细胞诱导分化潜能，降低了成本。

本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。

本发明提供一种人脐带间充质干细胞的无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素1~10μg/mL、人血清白蛋白0.2~3mg/mL、转铁蛋白0.1~10μg/mL、纤维连接蛋白1~20ng/mL、维生素C1.5~50μg/mL、生物素0.1~10μg/mL、干细胞生长因子0.5~10ng/mL和干细胞因子0.5~10ng/mL。

上述组分及其浓度是发明人经大量试验筛选确定的，采用上述技术方案的人脐带间充质干细胞的无血清培养基，无需添加动物血清，可以实现人脐带间充质干细胞的快速增殖，维持良好的干细胞特性，具有良好的细胞诱导分化潜能。上述组分中，重组人胰岛素可提高合成代谢能力，刺激细胞生长；人血清白蛋白能提供细胞生长所需的营养物质，还可调节渗透压，保护细胞免受机械损伤；转铁蛋白是血浆中主要的铁传递蛋白，为细胞内化和细胞代谢提供所需的铁；纤维连接蛋白（fibronectin）增强了人脐带间充质干细胞的贴壁性能；维生素C和生物素是维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用，此外维生素C还可抗氧化；通过干细胞生长因子和细胞生长因子的协同作用则可促进人脐带间充质干细胞的生长增殖，维持其干细胞特性，延缓老化的发生。

优选地，本发明提供的人脐带间充质干细胞的无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素2~8μg/mL、人血清白蛋白0.3~1mg/mL、转铁蛋白2~10μg/mL、纤维连接蛋白5~15ng/mL、维生素C5~20μg/mL、生物素1~8μg/mL、干细胞生长因子2~8ng/mL和干细胞因子2~8ng/mL。

优选地，本发明提供的人脐带间充质干细胞的无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素5μg/mL、人血清白蛋白0.5mg/mL、转铁蛋白5μg/mL、纤维连接蛋白10ng/mL、维生素C10μg/mL、生物素3.5μg/mL、干细胞生长因子5ng/mL和干细胞因子5ng/mL。

优选地，所述DMEM基础培养基为高糖型DMEM基础培养基或低糖型DMEM基础培养基。

优选地，本发明提供的人脐带间充质干细胞的无血清培养基还包括链霉素，链霉素的浓度为100μg/mL。

优选地，所述干细胞生长因子为人干细胞生长因子-α。

相应地，本发明还提供人脐带间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、纤维连接蛋白、维生素C、生物素、干细胞生长因子和干细胞因子，混匀，过膜除菌即得。

此外，本发明还提供人脐带间充质干细胞的无血清培养基在人脐带间充质干细胞培养中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种新的人脐带间充质干细胞的无血清培养基，与传统的含血清培养基和其他无血清培养基相比，本发明提供的培养基无需进行培养瓶包被，操作简便，细胞增殖速率高，且保持了良好的干细胞幼稚形态和干细胞特性，具有良好的细胞诱导分化潜能，降低了成本。本发明提供的制备方法简单，制得的人脐带间充质干细胞的无血清培养基培养得到的人脐带间充质干细胞表现出优异的细胞性能。

附图说明

图1不同培养基培养得到的P3代人脐带间充质干细胞的形态。

图2不同培养基培养的人脐带间充质干细胞的细胞增殖曲线。

图3不同培养基培养的人脐带间充质干细胞的成脂诱导分化染色结果图。

图4不同培养基培养的人脐带间充质干细胞的成骨诱导分化染色结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明中的各组分均为常规市售产品，例如人干细胞生长因子-α（hSCGF-α）购自美国peprotech公司，产品货号100-22A；干细胞因子（SCF）购自以色列ProSpec-Tany公司，产品货号CYT-255。

本发明中，培养基1：本发明实施例一提供的人脐带间充质干细胞的无血清培养基；培养基2：DMEM基础培养基+10%体积百分比的FBS；培养基3：LifeTecnology公司的StemPro?MSCSFM无血清培养基，货号A10332-01。

实施例一人脐带间充质干细胞的无血清培养基

人脐带间充质干细胞的无血清培养基，包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素5μg/mL、人血清白蛋白0.5mg/mL、转铁蛋白5μg/mL、纤维连接蛋白10ng/mL、维生素C10μg/mL、生物素3.5μg/mL、干细胞生长因子5ng/mL和干细胞因子5ng/mL。

制备方法：向高糖型DMEM基础培养基中，按所述浓度加入重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、纤维连接蛋白、维生素C、生物素、干细胞生长因子和干细胞因子，混匀，过膜除菌即得。

实施例二人脐带间充质干细胞的无血清培养基

人脐带间充质干细胞的无血清培养基，包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素8μg/mL、人血清白蛋白0.5mg/mL、转铁蛋白2μg/mL、纤维连接蛋白15ng/mL、维生素C15μg/mL、生物素1μg/mL、干细胞生长因子2ng/mL和干细胞因子8ng/mL。

制备方法与实施例一类似。

实施例三人脐带间充质干细胞的无血清培养基

人脐带间充质干细胞的无血清培养基，包括低糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素2μg/mL、人血清白蛋白3mg/mL、转铁蛋白8μg/mL、纤维连接蛋白5ng/mL、维生素C5μg/mL、生物素8μg/mL、干细胞生长因子8ng/mL和干细胞因子2ng/mL。

制备方法与实施例一类似。

实施例四人脐带间充质干细胞在不同培养基中培养得到的细胞形态

将P1代人脐带间充质干细胞以5000个/ml的密度接种到T25培养瓶中，接种5mL，分别用培养基1、培养基2和培养基3培养，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，待细胞长至80%~90%汇合度时进行传代培养，直至传代到第3代，比较细胞形态。结果如图1所示，培养基1所培养的细胞形态更为均一，保持了良好的干细胞幼稚形态。

实施例五人脐带间充质干细胞在不同培养基中培养的增殖

将P1代人脂肪间充质干细胞以5000个/mL的密度接种到6孔板中，接种2mL，分别用培养基1和培养基2培养，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，每3天将细胞用0.25%胰酶消化，计算细胞量，然后以5000个/mL的密度再次接种培养，直到第5代，根据每个代次的细胞数量，绘制细胞增殖曲线。结果如图2所示，培养基1所培养的细胞增殖速率明显大于培养基2和培养基3。

实施例六人脐带间充质干细胞在不同培养基中培养后的细胞表型检测

将实施例1中培养基1培养的人脐带间充质干细胞继续培养到第5代，去掉培养液，PBS洗涤3次，用0.25%胰蛋白酶液消化，1000r/min离心5min，调整细胞浓度，制成浓度为10⁵个/mL的单细胞悬液，加入10μL抗体，在4℃下孵育30min，用PBS洗涤2次，1000r/min离心5min，用500μL的PBS重悬细胞，然后上流式细胞仪检测。结果如表1所示，采用本发明提供的间充质干细胞无血清培养基培养的脐带间充质干细胞经过5次传代培养，能够很好的维持细胞生物学特性不变。

实施例七人脐带间充质干细胞在不同培养基中培养后的成脂诱导分化潜能

将P5代人脐带间充质干细胞以5000个/mL的密度接种于6孔板中，接种2mL，分别用培养基1、培养基2和培养基3进行培养，待细胞长至80%汇合度时，弃旧液，分别加入成脂诱导分化培养基（购自LifeTecnology公司，货号A10070-01），每3天换液一次，第21天时用油红O进行成脂鉴定，结果如图3所示。从图3可知，培养基1所培养的细胞其成脂分化潜能优于培养基2和培养基3。

实施例八人脐带间充质干细胞在不同培养基中培养后的成骨诱导分化潜能

将P5代人脐带间充质干细胞以5000个/ml的密度接种于6孔板中，接种2mL，分别用培养基1、培养基2和培养基3进行培养，待细胞长至80%汇合度时，弃旧液，分别加入成骨诱导培养基（购自LifeTecnology公司，货号A10072-01），每3天换液一次，第28天时用茜素红进行成骨鉴定，结果如图4所示。从图4可知，培养基1所培养的细胞其成骨分化潜能优于培养基2和培养基3。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种人脐带间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素1~10μg/mL、人血清白蛋白0.2~3mg/mL、转铁蛋白0.1~10μg/mL、纤维连接蛋白1~20ng/mL、维生素C1.5~50μg/mL、生物素0.1~10μg/mL、干细胞生长因子0.5~10ng/mL和干细胞因子0.5~10ng/mL。

2.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素2~8μg/mL、人血清白蛋白0.3~1mg/mL、转铁蛋白2~10μg/mL、纤维连接蛋白5~15ng/mL、维生素C5~20μg/mL、生物素1~8μg/mL、干细胞生长因子2~8ng/mL和干细胞因子2~8ng/mL。

3.根据权利要求2所述的人脐带间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：重组人胰岛素5μg/mL、人血清白蛋白0.5mg/mL、转铁蛋白5μg/mL、纤维连接蛋白10ng/mL、维生素C10μg/mL、生物素3.5μg/mL、干细胞生长因子5ng/mL和干细胞因子5ng/mL。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的人脐带间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：所述DMEM基础培养基为高糖型DMEM基础培养基或低糖型DMEM基础培养基。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的人脐带间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：还包括链霉素，链霉素的浓度为100μg/mL。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的人脐带间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：所述干细胞生长因子为人干细胞生长因子-α。

7.根据权利要求1所述的人脐带间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入重组人胰岛素、人血清白蛋白、转铁蛋白、纤维连接蛋白、维生素C、生物素、干细胞生长因子和干细胞因子，混匀，过膜除菌即得。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的人脐带间充质干细胞的无血清培养基在人脐带间充质干细胞培养中的用途。