CN104805054B

CN104805054B - 干细胞无血清培养基

Info

Publication number: CN104805054B
Application number: CN201510219207.2A
Authority: CN
Inventors: 吴炯
Original assignee: Accurate Medical Industry Development Co Ltd Is Led In Xiamen
Current assignee: Juwei cell (Xiamen) Medical Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2018-07-27
Anticipated expiration: 2035-04-30
Also published as: CN104805054A

Abstract

本发明公开了一种干细胞无血清培养基，由基础培养基和添加物组成，基础培养基为DMEM/F12，添加物包含：血清替代物2～15％(v/v)、维生素C 20～100ug/ml、干细胞生长因子0.5～10ng/ml、人血小板源生长因子5～20ng/ml、L‑谷氨酰胺1～5mmol/ml。采用本发明的干细胞无血清培养基进行细胞培养，具有细胞周期短，增殖能力强，细胞均一性好，纯度高，有效的抑制干细胞的分化和内皮细胞的贴壁生长，保证干细胞的纯度和干性，另外该培养基不含胎牛血清等动物源成分，通过该培养基获得的干细胞适合于临床应用。

Description

干细胞无血清培养基

技术领域

本发明涉及细胞培养用培养基，特别涉及一种干细胞无血清培养基。

背景技术

细胞培养在干细胞冻存中广泛应用。在传统培养过程中通常需要添加一定量的胎牛血清，血清中含有细胞生长所需的生长因子、激素、载体蛋白、贴壁因子、微量元素以及其他营养物质，可以促进细胞生长。但是，在规模化生产和实际应用中，血清的添加存在如下缺点：

1)血清易受病毒、支原体或其他病原体的污染；

2)不同批次的血清之间的质量差异造成最终产品批次间的质量差异；

3)大量血清的存在增加生产后期纯化的难度，增加工艺流程、提高生产成本，回收率降低；

4)部分血清成分难以彻底去除，严重影响最终产品质量，具有安全隐患。

为了克服血清添加带来的上述缺陷，自上世纪八十年代起许多科研单位或生物医药公司就相继开发出了若干无血清培养基，如Sigma公司旗下JRH公司生产的Excell系列无血清培养基，Invitrogen公司旗下Gibco公司生产的VP-AGT系列无血清培养基等等。但是，上述无血清培养基未针对不同细胞进行分化，用于干细胞培养仍存在一些问题，如干细胞易发生分化、干细胞的纯度及干性低。

发明内容

本发明的目的是提供一种干细胞无血清培养基，采用本发明的干细胞无血清培养基进行细胞培养，具有细胞周期短，增殖能力强，细胞均一性好，纯度高，有效的抑制干细胞的分化和内皮细胞的贴壁生长，保证干细胞的纯度和干性，另外该培养基不含胎牛血清等动物源成分，通过该培养基获得的干细胞适合于临床应用。

为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种干细胞无血清培养基，由基础培养基和添加物组成，基础培养基为DMEM/F12，添加物包含：血清替代物2～15％(v/v)、维生素C 20～100ug/ml、干细胞生长因子0.5～10ng/ml、人血小板源生长因子5～20ng/ml、L-谷氨酰胺1～5mmol/ml。

在一些实施方式中，无血清培养基由基础培养基和添加物组成，基础培养基为DMEM/F12，添加物包含：血清替代物5％(v/v)、维生素C 50ug/ml、干细胞生长因子2ng/ml、人血小板源生长因子20ng/ml、L-谷氨酰胺2mmol/ml。

在一些实施方式中，干细胞无血清培养基用于培养脂肪间充质干细胞。

本发明的有益效果为：

人血小板源生长因子(Platelet derived growth factor，PDGF)是一个具有双链结构的蛋白多肽，是血小板分泌的主要丝裂原，是一个极为重要的、随血循环而行、作用于间充质干细胞的生长因子。它直接促进正常细胞的增殖和分化。人血小板源生长因子有BB、AB、AA三种类型，本发明采用PDGF～BB。

干细胞生长因子(Stem Cell Growth Factors SCGF)是美国AgingOff Biotech,Inc.联合哈弗大学、宾夕法尼亚大学、匹兹堡大学、麻省理工大学等机构共同开放的一种具有刺激自体内源性干细胞生长的高效蛋白质、酶组合，也是体外培养干细胞必不可少的各种细胞生长因子的组合，富含表皮生长因子(EGF)、纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、肝细胞生长因子(HGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)等多重有效成分。

血清替代物(Ultroser G)包含6类真核生物细胞生长所必须的物质，包括生长因子、粘附因子、荷尔蒙、结合蛋白、维生素、微量矿物元素等，它的生物活性远高于血清。血清替代物一般为液体形态。

采用本发明的干细胞无血清培养基进行细胞培养，具有细胞周期短，增殖能力强，细胞均一性好，纯度高，有效的抑制干细胞的分化和内皮细胞的贴壁生长，保证干细胞的纯度和干性，另外该培养基不含胎牛血清等动物源成分，通过该培养基获得的干细胞适合于临床应用。

附图说明

图1为本发明的五个实验组中A组的细胞1：3传代后达80％融合度时的流式检测结果；

图2为本发明的五个实验组中A组中细胞培养首次达到80％融合度时的显微镜观察照片以及P10代的显微镜观察照片；

图3为本发明的五个实验组中B组的细胞1：3传代后达80％融合度时的流式检测结果；

图4为本发明的五个实验组中B组中细胞培养首次达到80％融合度时的显微镜观察照片以及P10代的显微镜观察照片；

图5为本发明的五个实验组中C组的细胞1：3传代后达80％融合度时的流式检测结果；

图6为本发明的五个实验组中C组中细胞培养首次达到80％融合度时的显微镜观察照片以及P10代的显微镜观察照片；

图7为本发明的五个实验组中D组的细胞1：3传代后达80％融合度时的流式检测结果；

图8为本发明的五个实验组中D组中细胞培养首次达到80％融合度时的显微镜观察照片以及P10代的显微镜观察照片；

图9为本发明的五个实验组中E组的细胞1：3传代后达80％融合度时的流式检测结果；

图10为本发明的五个实验组中E组中细胞培养首次达到80％融合度时的显微镜观察照片以及P8代的显微镜观察照片。

具体实施方式

下面采用脂肪间充质干细胞的分离培养对本发明作进一步详细的说明。

脂肪间充质干细胞的分离培养的步骤如下：

获取脂肪组织：由专业的医院或美容机构通过肿胀法吸脂手术获得患者腹部浅表层的脂肪组织，其中，患者经筛查合格，即HBV抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、ALT、支原体检测项目均为阴性。

消化脂肪组织：采用生理盐水洗涤脂肪组织，取10ml脂肪组织，加入等体积的0.4％(v/v)的P型胶原酶充分混匀，37℃150rpm震荡消化16min。

离心收集：消化产物经150目筛网过滤，收集细胞初悬液，将细胞初悬液经三次梯度离心后，取离心得到的沉淀即脂肪间充质干细胞。

细胞培养：将分离的单个脂肪间充质干细胞接种于五组盛有不同培养基的六孔板中，每组三个样本，每个样板接种1.0×10⁵个细胞，然后置于37℃、饱和湿度、CO₂体积分数为5％的培养箱内培养；

换液：细胞培养24h后首次换液，每三天全量换液，观察细胞生长情况；

传代培养：待细胞达到80％～90％融合度，倒掉培养瓶内的培养基，用0.9％的生理盐水洗涤细胞表面两次，加入10ml的0.075％～0.125％(m/v)的胰蛋白酶(购自罗氏公司Roch)，37℃消化1～3min后，显微镜下观察到细胞开始变圆，加入适量培养液终止消化，用移液管吹打细胞，使细胞完全脱落，将脱落的细胞和培养液转移到离心管内，1200～1800rpm，离心6～8min，将离心所得的沉淀用无血清培养基重悬，按1：3的比例接种进行传代培养。

检测：对收集细胞进行流式检测。经流式检测：阳性指标CD73、CD90、CD105，阴性指标CD34、HLA-DR。

五组实验中，A组、B组、C组、D组采用本发明的干细胞无血清培养基，E组采用的培养基为含15％胎牛血清的DMEM/F12。其中，A组、B组、C组、D组的干细胞无血清培养基由DMEM/F12和添加物构成，添加物含量如表1所示。

A组、本发明的干细胞无血清培养基，由DMEM/F12和添加物构成，添加物为：血清替代物5％(v/v)、维生素C 50ug/ml、干细胞生长因子2ng/ml、人血小板源生长因子20ng/ml，L-谷氨酰胺2mmol/ml；

B组、本发明的干细胞无血清培养基，由DMEM/F12和添加物构成，添加物为：血清替代物15％(v/v)、维生素C 100ug/ml、干细胞生长因子10ng/ml、人血小板源生长因子20ng/ml，L-谷氨酰胺为5mmol/ml；

C组、本发明的干细胞无血清培养基，由DMEM/F12和添加物构成，添加物为：血清替代物2％(v/v)、维生素C 20ug/ml、干细胞生长因子0.5ng/ml、人血小板源生长因子5ng/ml，L-谷氨酰胺为1mmol/ml；

D组、本发明的干细胞无血清培养基，由DMEM/F12和添加物构成，添加物为：血清替代物8％(v/v)、维生素C 80ug/ml、干细胞生长因子5ng/ml、人血小板源生长因子10ng/ml，L-谷氨酰胺为3mmol/ml；

表1

培养基的各组分来源及用量如表2所示。

表2

品名	厂家
		DMEM/F12	Gibco公司
血清替代物(Ultroser G)	PALL公司
		维生素C	Sigma公司
干细胞生长因子(SCGF)	Sigma公司
		人血小板源性生长因子(PDGF～BB)	sigma公司
L-谷氨酰胺	Gibco公司
		胎牛血清	Gibco公司

在细胞培养过程中观察细胞生长情况，结果如下。

A组，细胞培养48h后95％以上细胞呈梭形，细胞进入增殖期，第3天细胞开始对数生长，5～6天左右细胞达到80％以上的融合度。如图2A所示，显微镜下观察极少有内皮细胞。细胞1：3传代后2天可达80％融合度。如图1所示，流式检测结果显示阳性指标：CD73、CD90、CD105，阳性率≥95％，阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≤2％，如图2a所示，10代以内细胞的表型和形态未有明显变化。

B组，细胞培养48h后85％左右细胞贴壁呈梭形，细胞第4天开始进入对数生长期，6天左右细胞达到80％左右融合度，如图4B可见少量细胞分化呈扁平型(箭头所指)。细胞1：3传代后2～3天细胞可达80％融合度，如图3所示，流式检测结果显示阳性指标：CD73、CD90阳性率≥90％、CD105≈80％，阴性指标CD34、HLA-DR，阴性率≤5％。如图4b所示，10代以内细胞的表型和形态未有明显变化。

C组，细胞培养48h后75％以上细胞呈梭形，细胞增殖相对较慢，第5～6天进入对数增长期，8天左右细胞达到80％以上的融合度，如图6C所示，显微镜下观察极少有内皮细胞。细胞传代1：3传代后3天可达80％融合度，如图5所示，流式检测结果显示阳性指标：阳性指标CD73阳性率约75％、CD105、CD90大于90％，阴性指标CD34、HLA-DR，阴性率约5％。,如图6c所示，10代以内细胞的表型和形态未有明显变化。

D组，细胞培养24h后85％以上细胞呈梭形，显微镜下观察极少有内皮细胞，如图8D所示，6天左右细胞达到80％以上的融合度。细胞传代1：3传代后2天可达80％融合度，如图7所示，流式检测结果显示阳性指标：阳性指标CD73、CD90、CD105，阳性率≥90％，阴性指标CD34、HLA-DR，阴性率≤5％。如图8d所示，10代以内细胞的表型和形态未有明显变化。

E组，细胞在24h才开始贴壁铺展，少量细胞呈梭形，镜下可观察到扁平内皮细胞，如图10E所示，8～10天左右细胞可达到80％融合度。细胞1：3传代后3～4天细胞可达80％左右融合度，如图9所示，流式检测结果显示CD73、CD90，阳性率≈90％CD105≈50％，阴性指标：CD34，HLA-DR，阴性率≈10％。如图10e所示，8代以后细胞的形态由梭形开始变的扁平，细胞增殖明显变慢。

实验结果显示采用本发明的干细胞无血清培养基用于培养脂肪源的间充质干细胞具有细胞周期短，增殖能力强，细胞均一性好，纯度高，有效的抑制干细胞的分化和内皮细胞的贴壁生长，保证干细胞的纯度和干性，另外该培养基不含胎牛血清等动物源成分，通过该培养基获得的干细胞适合于临床应用

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims

1.干细胞无血清培养基，其特征在于，由基础培养基和添加物组成，所述基础培养基为DMEM/F12，所述添加物为：血清替代物5％(v/v)、维生素C 50ug/ml、干细胞生长因子2ng/ml、人血小板源生长因子20ng/ml和L-谷氨酰胺2mmol/ml，所述血清替代物为Ultroser G。

2.根据权利要求1所述的干细胞无血清培养基，其特征在于，用于培养脂肪间充质干细胞。