CN106947736A - 一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基 - Google Patents

一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，包括UltraCULTURE无血清培养基、L‑谷氨酰胺、bFGF、Ultroser G、青霉素和链霉素。本发明提出的一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，避免了血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，有利于体外培养人类脂肪间充质干细胞，保持干细胞的特性。

Description

一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及了一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基。
背景技术
人脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞，与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能，具有治疗疾病、使器官再生、甚至延年益寿的潜力。如何保证脂肪间充质干细胞的培养和传代，是研发脂肪干细胞各项功能的前提。
细胞培养基是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。细胞培养基分为天然培养基和合成培养基，绝大多数人工合成培养基使用时需添加血清。
无血清培养基，就是自细胞环境中不添加血清，但是在某些应用中需要添加生长因子或血清替代品，即血清的主要成分：粘附因子、生长因子、必需的营养物质和激素等。无血清培养基能减少血清带来的不利因素，使细胞培养的条件更稳定。因此，无血清培养基和无血清培养成为当今细胞培养领域的一大趋势。
无血清培养基的市场巨大、潜力无限，但是由于国产品质量和信誉问题，使得多年来国内一直购买进口的无血清培养基，如何能够打破这种局面，占有市场，是急需解决的一大问题。
中国专利，申请公告号CN 102732477 A，公开了一种人脂肪干细胞无血清基础培养基，由高糖型DMEM基础培养基、人血清白蛋白、转铁蛋白、牛磺酸、还原型谷胱甘肽、铜蓝蛋白、L-抗坏血酸-2-硫酸酯、α-生育酚琥珀酸单酯、亚油酸、α-酮戊二酸和硒组成；该无血清基础培养基因能免除常规含血清培养基中动物血清给人体健康带来的潜在威胁，其培养的脂肪干细胞更适于临床应用。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，避免了血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，有利于体外培养人类脂肪间充质干细胞，保持干细胞的特性。
一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，包括UltraCULTURE无血清培养基、L-谷氨酰胺、bFGF、血清替代品、抗生素。
优选的，所述血清替代品为Ultroser G。
优选的，所述抗生素包括青霉素和链霉素。
优选的，所述青霉素的浓度为0.01-0.05mg/mL，所述链霉素的浓度为0.05-0.15mg/mL。
优选的，所述L-谷氨酰胺的浓度为0.01-0.03mol/L。
优选的，所述bFGF的浓度为0.005-0.009ng/mL。
优选的，所述Ultroser G与UltraCULTURE无血清培养基的体积比为(1-5)∶50。
一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基可应用于培养人脂肪间充质干细胞。
UltraCULTURE通用型无血清培养基中，蛋白的含量为3mg/ml，不含L-谷氨酰胺。
bFGF为碱性成纤维细胞生长因子，是一种促细胞分裂的肝素结合蛋白，可诱导多种细胞的增殖与分化，能延长培养液中多种中枢和外周神经元的存活。
Ultroser G可作为血清替代品，包含生物细胞生长所必须的物质，包括生长因子、粘附因子、荷尔蒙、结合蛋白、维生素、微量矿物元素等，它的生物活性是血清的5倍。Ultroser G组分的一致性，批次的稳定性，使实验结果的可重复性提高。Ultroser G一般做成冻干粉的形式，具有较长的保质期，可以批量采购，降低成本。该血清替代品兼容市场主流细胞培养基，同时提高细胞培养品质。
无血清培养基中L-谷氨酰胺是细胞生长的必须氨基酸，为培养的脂肪干细胞提供重要的能量来源，脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，降解率随保存温度而变，L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性，所以L-谷氨酰胺的量要控制在最适的浓度。添加青霉素和链霉素可以防止样本在采集的过程中污染以及运输过程中细菌的滋生。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果在于：
本发明提出的一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，无血清培养基中加入能够促进细胞生长的成分和含量都可以确定和控制，保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性；无血清培养基中还添加了添加青霉素和链霉素，防止样本在采集的过程中污染以及运输过程中细菌的滋生。本发明提出的无血清培养基，避免了血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，有利于体外培养人类脂肪间充质干细胞，保持干细胞的特性。
附图说明
图1为市售无血清培养基培养人脂肪间充质干细胞的扫描电镜图；
图2为实施例3所得的无血清基培养人脂肪间充质干细胞的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，选用UltraCULTURE无血清培养基500ml、Ultroser G为30mL，然后按照如下终浓度要求称量各组分：
L-谷氨酰胺的浓度为0.01mol/L；
青霉素的浓度为0.02mg/mL；
链霉素的浓度为0.15mg/mL；
bFGF的浓度为0.009ng/mL。
一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基的制备方法：在无菌安全柜内，将Ultroser G溶于UltraCULTURE无血清培养基中；然后依次加入L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素；待溶液混合均匀后加入bFGF；最后用0.22um滤器过滤备用。
实施例2
一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，选用UltraCULTURE无血清培养基500ml、Ultroser G为20mL，然后按照如下终浓度要求称量各组分：
L-谷氨酰胺的浓度为0.03mol/L；
青霉素的浓度为0.01mg/mL；
链霉素的浓度为0.05mg/mL；
bFGF的浓度为0.007ng/mL。
制备方法同实施例1。
实施例3
一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，选用UltraCULTURE无血清培养基500ml、Ultroser G为10mL，然后按照如下终浓度要求称量各组分：
L-谷氨酰胺的浓度为0.02mol/L；
青霉素的浓度为0.03mg/mL；
链霉素的浓度为0.10mg/mL；
bFGF的浓度为0.008ng/mL。
制备方法同实施例1。
实施例4
一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，选用UltraCULTURE无血清培养基500ml、Ultroser G为50mL，然后按照如下终浓度要求称量各组分：
L-谷氨酰胺的浓度为0.01mol/L；
青霉素的浓度为0.05mg/mL；
链霉素的浓度为0.08mg/mL；
bFGF的浓度为0.005ng/mL。
制备方法同实施例1。
实施例5
一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，选用UltraCULTURE无血清培养基500ml、Ultroser G为40mL，然后按照如下终浓度要求称量各组分：
L-谷氨酰胺的浓度为0.03mol/L；
青霉素的浓度为0.04mg/mL；
链霉素的浓度为0.13mg/mL；
bFGF的浓度为0.006ng/mL。
制备方法同实施例1。
一、细胞增殖能力测试
实验方法：用Cell Counting Kit(CCK-8)试剂盒比较实施例1-5培养基培养后的细胞增殖能力；
1)在96孔板中接种细胞悬液(100uL/孔)，向培养板中加入不同配方培养基，放在培养箱中预培养24h(37℃，5％CO2)；
2)向每孔加入10uL CCK-8溶液；
3)将培养板放在培养箱内孵育3小时；
4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
实验结果：
表一 吸光值结果
组别 对照组 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5
吸光值 0.526 0.703 0.712 0.721 0.732 0.709
注：对照组为市售无血清培养基。
实验结论：实施例1-5的吸光度值均高于对照组，吸光度值越高，细胞浓度越大，说明使用该本发明中的无血清完全培养基培养细胞，能够使细胞具备较强的增殖能力。
二、扫描电镜结果分析
根据图1和2可得到以下结论：
本发明所制得的无血清完全培养基与市售无血清培养基相比，更利于体外培养人类脂肪间充质干细胞，其细胞数量较多且生长状态优良。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，其特征在于，包括UltraCULTURE无血清培养基、L-谷氨酰胺、bFGF、血清替代品、抗生素。
2.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，其特征在于，所述血清替代品为Ultroser G。
3.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，其特征在于，所述抗生素包括青霉素和链霉素。
4.根据权利要求3所述的一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，其特征在于，所述青霉素的浓度为0.01-0.05mg/mL，所述链霉素的浓度为0.05-0.15mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，其特征在于，所述L-谷氨酰胺的浓度为0.01-0.03mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，其特征在于，所述bFGF的浓度为0.005-0.009ng/mL。
7.根据权利要求1或2所述的一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基，其特征在于，所述Ultroser G与UltraCULTURE无血清培养基的体积比为(1-5)∶50。
8.根据权利要求1-6任一项所述的一种人脂肪间充质干细胞无血清完全培养基可应用于培养人脂肪间充质干细胞。
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