CN104480066B

CN104480066B - 一种软骨细胞培养基及软骨细胞培养方法

Info

Publication number: CN104480066B
Application number: CN201410842786.1A
Authority: CN
Inventors: 邱彩娥; 田智泉; 朱君; 郭静
Original assignee: SHAANXI RUISHENG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHAANXI RUISHENG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2018-03-30
Anticipated expiration: 2034-12-30
Also published as: CN104480066A

Abstract

本发明涉及一种软骨细胞培养基及软骨细胞培养方法。能够降低软骨细胞的去分化，提高软骨细胞的增殖能力。本发明实施例提供的软骨细胞培养基包括：基础培养基、浓度为5‑20％的血清、浓度为1‑20ng/ml的血小板源性生长因子和浓度为(1‑5)*10^‑5M/Lβ‑巯基乙醇。

Description

一种软骨细胞培养基及软骨细胞培养方法

技术领域

本发明涉及软骨细胞培养领域，尤其涉及一种软骨细胞培养基及软骨细胞培养方法。

背景技术

关节软骨主要是由软骨细胞和细胞外基质组成的无血管组织，主要依靠关节的运动和挤压吸收营养物质，所以软骨损伤后自我修复能力比较弱，其损伤后的修复移植一直以来是医学界的难题之一。近年来，随着组织工程技术的发展，自体软骨移植在软骨损伤的临床治疗在国内外都有应用。临床研究对患者组织取材有限，并且也因为软骨细胞是终末分化细胞，体外增殖能力有限且易去分化，所以对体外软骨细胞的培养和扩增成为目前要解决的关键。

为了对体外软骨细胞进行培养和扩增，出现了多种培养软骨细胞的软骨细胞培养基。例如，现有技术提供的一种传统软骨细胞培养基的配方为：培养基+10％自体血清+60μg/ml Vc。

但是，发明人发现，利用该软骨细胞培养基在培养软骨细胞的过程中，软骨细胞去分化趋势严重，软骨细胞的增殖能力差，极大的限制了软骨细胞的应用。

发明内容

本发明的主要目的在于，提供一种软骨细胞培养基及软骨细胞培养方法，能够降低软骨细胞的去分化，提高软骨细胞的增殖能力。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明实施例提供一种软骨细胞培养基，包括：基础培养基、浓度为5-20％的血清、浓度为1-20ng/ml的血小板源性生长因子和浓度为(1-5)*10-5M/Lβ-巯基乙醇。

优选的，所述软骨细胞培养基还包括浓度为1-15 ng/ml的骨形成蛋白BMP-2或者其类似物。

优选的，所述软骨细胞培养基还包括浓度为5-100ng/ml的碱性成纤维生长因子bFGF和浓度为3-30ng/ml的转化生长因子TGF-β。

优选的，所述软骨细胞培养基还包括浓度为20-200μg/ml的维生素C。

优选的，所述软骨细胞培养基还包括浓度为2-20μg/ml的胰岛素和浓度为1-20ng/ml的胰岛素生长因子IGF-1。

优选的，所述血清为胎牛血清或者自体血清。

优选的，所述软骨细胞培养基还包括浓度为(0.5-5)*10-6M/L的地塞米松。

优选的，所述软骨细胞培养基还包括浓度为1％的丙酮酸钠和2-20ng/ml的白细胞介素(IL-1)。

优选的，所述基础培养基为DMEM或者DF12。

另一方面，本发明实施例提供一种软骨细胞培养方法，通过使用第一方面所述的软骨细胞培养基，培养预先制备的原代人软骨细胞，获取传代3-5次的软骨细胞。

优选的，软骨细胞的培养方法还包括：制备原代人软骨细胞，具体为：

将人关节软骨组织用0.05-1％II型胶原酶消化；

将完成消化的细胞用培养液稀释后，离心收集细胞；

用培养液离心洗涤，获取原代人软骨细胞。

本发明实施例提供的一种软骨细胞培养基包括：基础培养基、浓度为5-20％的血清、浓度为1-20ng/ml的血小板源性生长因子和浓度为(1-5)*10-5M/Lβ-巯基乙醇。该软骨细胞培养基用于培养软骨细胞，能够改善软骨细胞的培养状态，降低软骨细胞去分化趋势，提高软骨细胞的增殖能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1-a为使用相应的A-G培养基培养的软骨细胞传代一次的光学显微照片；

图1-b为使用相应的A-G培养基培养的软骨细胞传代两次的光学显微照片；

图1-c为使用相应的A-G培养基培养的软骨细胞传代三次的光学显微照片；

图2为对软骨细胞培养基A-G培养的第三代细胞进行甲苯胺蓝染色的光学显微照片；

图3为对软骨细胞培养基A-G培养的第三代细胞进行Ⅱ型胶原免疫组化分析的光学显微照片。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例所涉及的材料均可以通过商业途径或通过申请人获取。

一方面，本发明实施例提供一种软骨细胞培养基，包括：基础培养基、浓度为5-20％的血清、浓度为1-20ng/ml的血小板源性生长因子和浓度为(1-5)*10-5M/Lβ-巯基乙醇。

本发明实施例提供的软骨细胞培养基用于培养软骨细胞，能够改善软骨细胞的培养状态，降低软骨细胞去分化趋势，提高软骨细胞的增殖能力。

其中，所述基础培养基可以为通过商业途径获得的基础培养基，例如，可以为DMEM或者DF12，DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，DF12为F12培养基和DMEM以1：1比例混合形成的一种培养基，F12含有较丰富的成分，这两种培养基能够为软骨细胞生长提供多种营养成分。

该基础培养基可以为各种形态，例如，可以为液体形态或者干粉形态，针对不同形式形态的基础培养基可以采用不同的处理方法配置获取软骨细胞培养基。

例如，当基础培养基为干粉形态时，配置获取软骨细胞培养基的方法可以为：先将干粉形态的基础培养基加入无菌超纯水充分溶解，定容；再用0.22微米滤膜过滤得到无菌的澄清溶液；然后根据软骨细胞培养基的配方添加其他组分，最终采用酸碱调节试剂调节pH值至7.0-7.5即可。

再例如，当基础培养基为液体形态时，配置获取软骨细胞培养基的方法可以为：取适量液体形态的基础培养基；根据软骨细胞培养基的配方添加其他组分，再采用酸碱调节试剂调节pH值符合配方要求至7.0-7.5即可。

其中，在此对所选择的酸碱调节试剂不做限制。优选的，可以为10％NaOH或者10％HCl。

其中，所述血清可以为动物血清、胎牛血清、人血清、自体血清等。优选的，为了保证软骨细胞的培养效果，可以将血清在无菌状态下进行灭活、杀菌消毒处理。优选的，为了避免经异种或异体血清培养的软骨细胞存在试剂残留导致移植后发生排异反应及血清制品微生物污染问题，该血清可以选择自体血清。自体血清的制备方法可以为：

血样分离得到血清；将所得血清用0.22微米过滤器进行过滤两次；再将获得的血清在56℃水浴灭活热原至少30min；得到所需自体血清。

其中，所述血小板源性生长因子是一种使软骨细胞集落性生长的物质，能够提高软骨细胞活性，促进细胞增殖；β-巯基乙醇经试验证明具有抗氧化作用，能够在培养过程中防止自由基对细胞产生氧化。添加这两种因子组合得到的软骨细胞培养基能够提高软骨细胞的增殖能力。

其中，优选的，所述软骨细胞培养基还包括浓度为1-15ng/ml的骨形成蛋白BMP-2或者其类似物，BMP-2或者其类似物能够促进原代细胞成熟和分化作用，和其他因子有协同作用，促进细胞增殖。其中，BMP-2的类似物可以为BMP-4。

优选的，软骨细胞培养基还包括浓度为5-100ng/ml的碱性成纤维生长因子bFGF和浓度为3-30ng/ml的转化生长因子TGF-β。碱性成纤维生长因子是软骨细胞有丝分裂原，转化生长因子具有促进原代软骨细胞成熟，维持软骨表型的作用。

优选的，软骨细胞培养基还包括浓度为20-150μg/ml的维生素C。维生素C能够促进软骨细胞增殖和细胞外基质分泌，保护细胞免受自由基的伤害。

优选的，软骨细胞培养基还包括浓度为2-20μg/ml的胰岛素和浓度为1-20ng/ml的胰岛素样生长因子IGF-1。胰岛素和胰岛素样生长因子都能够促进软骨细胞增殖。

优选的，所述软骨细胞培养基还包括浓度为(0.5-5)*10-6M/L的地塞米松。地塞米松可以抑制软骨细胞过度增殖，能够促进细胞分泌蛋白多糖。

优选的，所述软骨细胞培养基还包括浓度为1％的丙酮酸钠和2-20ng/ml的白细胞介素(IL-1)。其中，丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，用于细胞代谢；白细胞介素(IL-1)在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导细胞活化、增殖与分化方面起重要作用。

另一方面，本发明实施例提供一种软骨细胞培养方法，通过使用上述实施例所述的软骨细胞培养基，培养预先制备的原代人软骨细胞，获取传代3-5次的软骨细胞。

本发明实施例提供的软骨细胞的培养方法，使用的软骨细胞培养基包括：基础培养基、浓度为5-20％的血清、浓度为1-20ng/ml的血小板源性生长因子和浓度为(1-5)*10-5M/Lβ-巯基乙醇，能够改善软骨细胞的培养状态，降低软骨细胞去分化趋势，提高软骨细胞的增殖能力。

其中，所用原代人软骨细胞可以通过商业途径获得，也可以通过以下方法制备：

1、无菌获得200-300mg的人关节软骨组织，并用0.05-1％II型胶原酶消化；

其中，为了避免外来器械对细胞培养室造成污染，以及软骨组织直接照射紫外对软骨细胞的活性大分子物质造成破坏，影响软骨细胞培养基的培养效果，优选的，在进入万级洁净区之前，对装有软骨组织的组织包装箱进行紫外照射消毒杀菌，并且在进入细胞培养室前脱外包，将装有软骨组织的离心管喷涂酒精消毒后在百级超净台取出软骨组织。

其中，为了提高对软骨组织的消化效率，优选的，可以对组织进行清洗，分选以除去不必要的杂质，如软骨上附带的肌肉组织等，并剪切成1mm3大小的软骨组织小块。

2、将完成消化的细胞离心，收集细胞；

具体的，离心的方法可以为：将完成消化的细胞和细胞消化液收集于离心管中，用培养液(DMEM+5％胎牛血清FBS)稀释消化液两倍后，以1200r/min进行离心8min。

3、对第一次离心获得的沉淀重悬，离心洗涤一次，获得原代人软骨细胞。

具体实施方式

以下，将参照本发明的实施例、对照例以及试验例详述本发明。这些实施例仅是为了具体说明本发明而提出的示例，本领域技术人员可以知道的是本发明的范围不受这些实施例、对照例以及试验例的限制。

对照例：

为了方便起见，将对照例的软骨细胞培养基称为G配方。

G配方的配制：

向基础培养基粉末DMEM加入无菌超纯水，溶解定容，充分溶解后，用0.22微米的滤膜进行过滤，封装。再向基础培养液中添加10％自体血清和60μg/ml Vc。

实施例1

为了方便起见，将实施例1的软骨细胞培养基称为A配方。

A配方的配制：

向基础培养基干粉DMEM加入无菌超纯水，溶解定容，充分溶解后，用0.22微米的滤膜进行过滤，封装，再向基础培养液中添加10％自体血清和60μg/ml Vc，和因子组合获得A配方。A配方如表1所示：

表1

实施例2

为了方便起见，将实施例2的软骨细胞培养基称为B配方。

B配方的配制：

向基础培养基干粉DF12加入无菌超纯水，溶解定容，充分溶解后，用0.22微米的滤膜进行过滤，封装，再向基础培养液中添加5％自体血清和20μg/ml Vc，和因子组合获得B配方。B配方如表2所示：

表2

实施例3

为了方便起见，将实施例3的软骨细胞培养基称为C配方。

C配方的配制：

向基础培养基干粉DMEM加入无菌超纯水，溶解定容，充分溶解后，用0.22微米的滤膜进行过滤，封装，再向基础培养液中添加20％自体血清和150μg/ml Vc，和因子组合获得C配方。C配方如表3所示：

表3

实施例4

为了方便起见，将实施例4的软骨细胞培养基称为D配方。

D配方的配制：

向基础培养基干粉DMEM加入无菌超纯水，溶解定容，充分溶解后，用0.22微米的滤膜进行过滤，封装，再向基础培养液中添加10％胎牛血清和60μg/ml Vc，和因子组合获得D配方。D配方如表4所示：

表4

实施例5

为了方便起见，将实施例5的软骨细胞培养基称为E配方。

E配方的配制：

向基础培养基干粉DF12加入无菌超纯水，溶解定容，充分溶解后，用0.22微米的滤膜进行过滤，封装，再向基础培养液中添加5％胎牛血清和20μg/ml Vc，和因子组合获得E配方。E配方如表5所示：

表5

实施例6

为了方便起见，将实施例6的软骨细胞培养基称为F配方。

F配方的配制：

向基础培养基干粉DMEM加入无菌超纯水，溶解定容，充分溶解后，用0.22微米的滤膜进行过滤，封装，再向基础培养液中添加20％胎牛血清和100μg/ml Vc，和因子组合获得F配方。F配方如表6所示：

表6

在接下来的试验例中能够得出，通过本发明实施例1-6的所述软骨细胞培养基A-F与对照例提供的软骨细胞培养基G对软骨细胞进行培养，发现本发明实施例1-6提供的软骨细胞培养基A-F能够降低软骨细胞去分化趋势，提高细胞增殖能力。

实验例：

为客观地评价软骨细胞培养基A－F培养软骨细胞的增殖能力，观察软骨细胞的生长状态，在与现有技术提供的软骨细胞培养基G进行培养相同的软骨细胞的条件下进行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫组化分析对比实验。

1、试验样品

实施例1－6中的软骨细胞培养基A－F与对照例中的软骨细胞培养基G用于培养人原代软骨细胞。当人软骨细胞汇合至80％左右时，连续传代3次或5次得到试验样品。

需要说明的是，在传代过程中，除了培养基不同外，其他培养条件都相同，如温度，细胞密度等。优选的，以相同的接种密度5000个/cm²将细胞接种到35mm培养皿中，置于37℃5％CO₂培养箱中培养。

在此，对所述培养皿的体积、形状等不做限定，可以根据需要采用不同形状、体积的培养皿。

2、测试分析方法：

计数各组细胞每代的细胞总量；

观察细胞生长状态；

对各组中的第三代细胞进行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫组化分析。

3、实验结果：

在分别用软骨细胞培养基A－G对相同的软骨细胞在相同的培养条件下进行计数统计发现，采用软骨细胞培养基A－F培养的细胞增殖数量明显高于采用软骨细胞培养基G培养的细胞；同时，我们还发现：采用本发明实施例所述的软骨细胞培养基A、B、C培养的细胞扩增能力高于本发明实施例所述的软骨细胞培养基D、E、F培养的细胞增殖能力，软骨细胞状态保持更好。

参见图1－a、图1－b和图1－c，为细胞培养过程中的拍摄的软骨细胞生长状态的光学显微照片，其中，图1－a中A－G分别为使用相应的A－G培养基培养的软骨细胞传代一次的光学显微照片，图1－b中A－G分别为使用相应的A－G培养基培养的软骨细胞传代两次的光学显微照片，图1－c中A－G分别为使用相应的A－G培养基培养的软骨细胞传代三次的光学显微照片。

参见图1－a、图1－b和图1－c的培养结果显示：采用软骨细胞A－F培养的细胞密度明显高于采用软骨细胞培养基G培养的细胞密度，且A－F组软骨细胞成多角形、立体感较强，贴壁能力较好，生长状态良好；而G组细胞呈平铺状，立体感差，贴壁能力较差，并且G组细胞随传代过程的进行，细胞呈梭形，成纤维化和去分化趋势严重，说明采用本发明所述软骨细胞培养基A－F培养的软骨细胞的细胞状态明显优于软骨细胞培养基G培养的软骨细胞的细胞状态。进一步的，我们发现，采用软骨细胞培养基A、B、C培养的软骨细胞的细胞状态相对于软骨细胞培养基D、E、F培养的软骨细胞的细胞状态更优。

参见图2，为对软骨细胞培养基A－G培养的第三代细胞进行甲苯胺蓝染色的光学显微照片，其中，图2中A－G分别为使用相应的A－G培养基培养的软骨细胞传代三次用甲苯胺蓝染色的光学显微照片，从图中可以看出，被染色的细胞核呈紫色，细胞质呈蓝色。

参见图3，为对软骨细胞培养基A－G培养的第三代细胞进行Ⅱ型胶原免疫组化分析的光学显微照片，其中，图3中A－G分别为使用相应的A－G培养基培养的软骨细胞传代三次进行Ⅱ型胶原免疫组化分析的光学显微照片，从图中可以看出，进行Ⅱ型胶原免疫组化后的细胞质被染成黄色，Ⅱ型胶原阳性率越高，其颜色越深。

结合图2与图3可得出：软骨细胞培养基A－F培养得软骨细胞的Ⅱ型胶原阳性率明显高于软骨细胞培养基G培养得软骨细胞的Ⅱ型胶原阳性率；同时，我们还发现：采用软骨细胞培养基A、B、C培养的软骨细胞的Ⅱ型胶原阳性率相对于软骨细胞培养基D、E、F培养的软骨细胞的Ⅱ型胶原阳性率更高。

综合上述试验结论，我们在组织来源限制的情况下对人软骨细胞传代培养，本发明中软骨细胞培养基A－F培养的细胞，其体外增殖能力有较明显的提高，并且软骨细胞表型维持也优于G组。本发明软骨细胞培养基A－F满足软骨细胞治疗中对细胞的需求。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种软骨细胞培养基，其特征在于，包括：基础培养基DMEM、浓度为5％的血清、浓度为1ng/ml的PDGF-BB和浓度为1×10^-5mol/L的β-巯基乙醇、浓度为1ng/ml的骨形成蛋白-2(BMP-2)、浓度为5ng/ml的碱性成纤维生长因子bFGF、浓度为3ng/ml的转化生长因子TGF-β和浓度为20μg/ml的维生素C。

2.根据权利要求1所述的软骨细胞培养基，其特征在于，所述软骨细胞培养基还包括浓度为1％的丙酮酸钠和2ng/ml的白细胞介素-1(IL-1)。

3.根据权利要求1-2任一项所述的软骨细胞培养基，其特征在于，所述血清为胎牛血清或者自体血清。

4.一种软骨细胞培养基，其特征在于，包括：基础培养基、浓度为20％的血清、浓度为20ng/ml的PDGF-BB和浓度为5×10^-5mol/L的β-巯基乙醇、浓度为20-100ng/ml的碱性成纤维生长因子bFGF、浓度为1％的丙酮酸钠、浓度为20ng/ml的白细胞介素-1(IL-1)、浓度为20ng/ml的胰岛素生长因子-1(IGF-1)、浓度为5×10^-6mol/L的地塞米松和浓度为100-150μg/ml的维生素C。

5.根据权利要求4所述的软骨细胞培养基，其特征在于，所述血清为胎牛血清或者自体血清。

6.一种软骨细胞培养基，其特征在于，包括：基础培养基、浓度为10％的血清、浓度为3ng/ml的PDGF-BB和浓度为2×10^-5mol/L的β-巯基乙醇、浓度为2ng/ml的骨形成蛋白-2(BMP-2)、浓度为1％的丙酮酸钠、浓度为3ng/ml的白细胞介素-1(IL-1)、浓度为5ng/ml的胰岛素生长因子-1(IGF-1)、浓度为1×10^-6mol/L的地塞米松和浓度为60μg/ml的维生素C。

7.根据权利要求6所述的软骨细胞培养基，其特征在于，所述软骨细胞培养基还包括浓度为15ng/ml的碱性成纤维生长因子bFGF、浓度为10ng/ml的转化生长因子TGF-β。

8.根据权利要求6所述的软骨细胞培养基，其特征在于，所述血清为胎牛血清或者自体血清。

9.一种软骨细胞培养方法，其特征在于，包括：

通过使用权利要求1-8任一项所述的软骨细胞培养基，培养预先制备的原代人软骨细胞，获取传代3-5次的软骨细胞。

10.根据权利要求9所述的软骨细胞培养方法，其特征在于，还包括：制备原代人软骨细胞，具体为：

将人关节软骨组织用0.05-1％II型胶原酶消化；

将完成消化的细胞用培养液稀释后，离心收集细胞；

用培养液离心洗涤，获取原代人软骨细胞。