CN104888275B

CN104888275B - 一种软骨细胞膜片的构建方法

Info

Publication number: CN104888275B
Application number: CN201510214692.4A
Authority: CN
Inventors: 邱彩娥; 田智泉
Original assignee: SHAANXI RUISHENG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHAANXI RUISHENG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2035-04-29
Also published as: CN104888275A

Abstract

本发明涉及一种软骨细胞膜片的构建方法，能够模拟体内生长环境，在提高软骨细胞的增殖能力同时改善与维持软骨细胞表型，提高软骨细胞体内应用的稳定性与安全性。本发明实施例提供的一种软骨细胞膜片的构建方法，包括：将软骨细胞接种于培养孔板中，用刺激软骨细胞基质分泌的培养基培养所述软骨细胞3‑5周，期间每2‑3天更换培养基一次；所述培养基刺激所述软骨细胞分泌软骨细胞外基质，所述软骨细胞外基质包裹所述软骨细胞，获得所述软骨细胞膜片，其中，所述软骨细胞外基质包括Ⅱ型胶原和糖胺聚糖。

Description

一种软骨细胞膜片的构建方法

技术领域

本发明涉及软骨细胞培养领域，尤其涉及一种软骨细胞膜片的构建方法。

背景技术

关节软骨主要是由软骨细胞和细胞外基质组成的无血管组织，主要依靠关节的运动和挤压吸收营养物质，所以软骨损伤后自我修复能力比较弱，临床研究对患者组织取材有限，并且也因为软骨细胞是终末分化细胞，体外增殖能力有限且易去分化，去分化是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。所以改善与维持软骨细胞表型在软骨细胞的临床应用中起着举足轻重的作用。

目前，为了延迟软骨细胞的去分化，维持软骨细胞表型，需要模拟软骨细胞体内生长环境对所述软骨细胞进行培养，但是，随着软骨细胞的增殖都会出现软骨细胞的去分化趋势，与体内生长环境相比，体外培养软骨细胞受外界环境影响较大，对软骨细胞的体外应用造成极大的限制，大量研究表明，骨髓细胞等各种细胞都能够在体外进行细胞膜片构建，模拟体内细胞生长环境对所述骨髓细胞进行培养，然而，不依赖生物材料的软骨细胞膜片的体外构建方法还鲜有报道。

发明内容

本发明的主要目的在于，提供一种软骨细胞膜片的构建方法，能够模拟体内生长环境，在提高软骨细胞的增殖能力的同时改善与维持软骨细胞表型，提高软骨细胞体内应用的稳定性与安全性。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明实施例提供一种软骨细胞膜片的构建方法，包括：

将软骨细胞接种于培养孔板中，用刺激软骨细胞基质分泌的培养基培养所述软骨细胞3-5周，期间每2-3天更换培养基一次；所述培养基刺激所述软骨细胞分泌软骨细胞外基质，所述软骨细胞外基质包裹所述软骨细胞，获得所述软骨细胞膜片，其中，所述软骨细胞外基质包括Ⅱ型胶原和糖胺聚糖。

优选的，所述软骨细胞的接种密度为10⁴-10⁵/cm²。

进一步优选的，所述软骨细胞为人传代软骨细胞。

其中，获取人传代软骨细胞包括以下步骤：

将分离软骨组织获得的人原代软骨细胞进行传代，在将上一次传代的人传代软骨细胞汇合至80％后，用上一次传代的人传代软骨细胞进行下一次传代，直至传代n次，其中，n大于等于2且小于等于4；

将第n次传代的人传代软骨细胞汇合至80％后，用胰酶消化第n次传代的人传代软骨细胞；

将经过消化的第n次传代的人传代软骨细胞离心，收集所述第n次传代的人传代软骨细胞。

进一步地，所述人原代软骨细胞是由包括以下步骤的方法制备得到：

将人关节软骨组织用0.05-1％II型胶原酶消化；

将经过消化的细胞用培养液稀释后，离心收集细胞；

用培养液离心洗涤，获取人原代软骨细胞。

其中，所述刺激软骨细胞基质分泌的培养基包括：基础培养基、骨形成蛋白BMP-2或者其类似物、多西环素和地塞米松。

优选的，所述骨形成蛋白BMP-2在所述培养基中的浓度为2-10ng/ml，所述多西环素在所述培养基中的浓度为0.1-5μmol/ml，所述地塞米松在所述培养基中的浓度为0.2-2μg/ml。

可选的，所述刺激软骨细胞基质分泌的培养基还包括占所述培养基总体积1-5％的化学成份确定的脂，所述化学成分确定的脂类选自胆固醇、维生素E、亚油酸与油酸中的至少一种。

进一步可选的，所述刺激软骨细胞基质分泌的培养基还包括50-100μg/ml的维生素C、3-20ng/ml的碱性成纤维生长因子bFGF和3-15ng/ml的转化生长因子TGF-β。

优选的，所述刺激软骨细胞基质分泌的培养基还包括2-8μg/ml的胰岛素或者5-20ng/ml的胰岛素生长因子IGF-1。

本发明实施例提供的一种软骨细胞膜片的构建方法，将所述软骨细胞接种于培养孔板中，用刺激软骨细胞外基质分泌的培养基培养所述软骨细胞，所述软骨细胞分泌软骨细胞外基质，所述软骨细胞外基质包裹所述软骨细胞形成所述软骨细胞膜片，能够模拟软骨细胞的体内生长环境，在自体分泌的基质中增殖、分化，在提高软骨细胞增殖能力同时改善与维持软骨细胞表型，不引入外源性生物材料，能够提高软骨细胞体内应用的稳定性与安全性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为光学显微镜拍摄的软骨细胞膜片A-G中的软骨细胞生长状态的光学显微照片；

图2为对软骨细胞膜片A-G切片后进行甲苯胺蓝染色的光学显微照片；

图3为对软骨细胞膜片A-G切片后进行Ⅱ型胶原免疫组化分析的光学显微照片。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例所涉及的材料均可以通过商业途径或通过申请人获取。

一方面，本发明实施例提供一种软骨细胞膜片的构建方法，包括：

其中，所述细胞外基质是由软骨细胞合成并分泌到胞外、分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要包含Ⅱ型胶原或者蛋白聚糖等。这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。在这些细胞外基质中，胶原在细胞外基质中形成半晶体的纤维，给细胞提供抗张力和弹性，并在细胞的迁移和发育中起作用，是构成细胞外基质的骨架。在这些胶原中，所述软骨细胞主要分泌的是II型胶原，所述II型胶原含有丰富的羟脯氨酸，丝状的胶原蛋白纤维与弹性蛋白及多糖蛋白相互交织形成网状结构，能够产生一定的机械强度，对软骨损伤具有良好的修复作用。

本发明实施例提供的软骨细胞膜片的构建方法，将所述软骨细胞接种于培养孔板中，用刺激软骨细胞外基质分泌的培养基培养所述软骨细胞，所述软骨细胞分泌软骨细胞外基质，所述软骨细胞外基质包裹所述软骨细胞，使得所述软骨细胞在近似于体内培养的环境下培养，所述软骨细胞在自体分泌的基质中增殖、分化，获取所述软骨细胞膜片，所述软骨细胞膜片具有较好的韧性，能够最大程度保留细胞外基质和细胞间黏附蛋白，减少细胞流失、在将所述软骨细胞膜片植入自体软骨组织缺损部位进行修复时，能够避免外源性生物材料的应用，提高所述软骨细胞的植活率，提高软骨细胞体内应用的稳定性与安全性。

其中，对所述软骨细胞的接种密度不做限定，只要使得软骨细胞能够自体分泌软骨细胞外基质，所述软骨细胞外基质包裹所述软骨细胞得到所述软骨细胞膜片即可，为了得到更接近于天然软骨细胞的软骨细胞膜片，优选的，所述软骨细胞的接种密度为10⁴-10⁵/cm²。

其中，对所述软骨细胞的来源也不做限定，例如，所述软骨细胞可以来源于灵长类动物的软骨组织，也可以来源于兔子、胎牛等动物的软骨组织。

对获取软骨细胞的所述软骨组织也不做限定，例如，所述软骨组织耳廓软骨、肋软骨、关节软骨、椎间软骨或者气管软骨等。

优选的，所述软骨细胞取自人关节软骨细胞。

进一步优选的，所述软骨细胞为人传代软骨细胞。

其中，所述人传代软骨细胞可以通过商业途径获得，也可以通过制备进行获取，优选的，所述获取人传代软骨细胞包括以下步骤：

其中，为了避免所述人传代软骨细胞在操作过程中被感染与损坏，影响整个软骨细胞膜片的构建，所述上述获取过程均为无菌操作条件下进行。

所述人原代软骨细胞可以通过商业途径获得，也可以通过以下方法获取：

1、无菌获得200-300mg的人关节软骨组织，并用0.05-1％II型胶原酶消化；

其中，为了避免外来器械对细胞培养室造成污染，以及软骨组织直接照射紫外对软骨细胞的活性大分子物质造成破坏，影响软骨细胞培养基的培养效果，优选的，在进入万级洁净区之前，对装有软骨组织的组织包装箱进行紫外照射消毒杀菌，并且在进入细胞培养室前脱外包，将装有软骨组织的离心管喷涂酒精消毒后在百级超净台取出软骨组织。

其中，为了提高软骨组织的纯净度和对软骨组织的消化效率，优选的，可以对组织进行清洗，分选以除去不必要的杂质，如软骨上附带的肌肉组织等，并剪切成1mm³大小的软骨组织小块。

2、将经过消化的细胞离心，收集细胞；

具体的，离心的方法可以为：将完成消化的细胞和细胞消化液收集于离心管中，用培养液(DMEM+5％胎牛血清FBS)稀释消化液两倍后，以1200r/min进行离心8min。

3、对第一次离心获得的沉淀重悬，离心洗涤一次，获得人原代软骨细胞。

其中，需要说明的是，所述软骨细胞分泌细胞外基质以形成软骨细胞膜片，在所述软骨细胞膜片构建过程中，对所述软骨细胞培养基不做限定，只要所采用的培养基能够刺激所述软骨细胞分泌软骨细胞外基质，并且所述软骨细胞外基质包裹所述软骨细胞，能够得到具有一定厚度与机械强度的细胞膜片即可。优选的，所述刺激软骨细胞基质分泌的培养基包括：基础培养基、骨形成蛋白BMP-2或者其类似物、多西环素和地塞米松。

其中，所述骨形成蛋白BMP-2或者其类似物能够促进软骨细胞成熟和分化，和其他因子有协同作用，促进软骨细胞增殖；其中，BMP-2的类似物可以为BMP-4；所述多西环素经试验证明具有抗菌作用，是一种基质金属蛋白酶抑剂，能够抑制基质金属蛋白酶对细胞外基质的降解，延缓细胞外基质被降解；所述地塞米松可以抑制软骨细胞过度增殖，能够促进细胞分泌蛋白多糖，延缓细胞外基质被降解；添加这几种因子组合得到的软骨细胞培养基能够刺激所述软骨细胞分泌软骨细胞外基质，所述软骨细胞外基质包裹所述软骨细胞，能够得到具有三维结构的软骨细胞膜片。

其中，所述基础培养基可以为通过商业途径获得的基础培养基，例如，可以为DMEM或者DF12，DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，DF12为F12培养基和DMEM以1：1比例混合形成的一种培养基，F12含有较丰富的成分，这两种培养基能够为软骨细胞生长提供多种营养成分。

该基础培养基可以为各种形态，例如，可以为液体形态或者干粉形态，针对不同形式形态的基础培养基可以采用不同的处理方法配置获取软骨细胞培养基。

例如，当基础培养基为干粉形态时，配制获取软骨细胞培养基的方法可以为：先将干粉形态的基础培养基加入无菌超纯水充分溶解，定容；再用0.22微米滤膜过滤得到无菌的澄清溶液；然后根据软骨细胞培养基的配方添加其他组分，最终采用酸碱调节试剂调节pH值至7.0-7.5即可。

再例如，当基础培养基为液体形态时，配制获取软骨细胞培养基的方法可以为：取适量液体形态的基础培养基；根据软骨细胞培养基的配方添加其他组分，再采用酸碱调节试剂调节pH值符合配方要求至7.0-7.5即可。

其中，在此对所选择的酸碱调节试剂不做限制。优选的，可以为10％NaOH或者10％HCl。

其中，对所述骨形成蛋白BMP-2、多西环素和地塞米松的含量不做限定，只要能够实现刺激所述软骨细胞分泌软骨细胞外基质即可。优选的，所述骨形成蛋白BMP-2在所述培养基中的浓度为2-10ng/ml，所述多西环素在所述培养基中的浓度为0.1-5μmol/ml，所述地塞米松在所述培养基中的浓度为0.2-2μg/ml。

其中，优选的，所述刺激软骨细胞基质分泌的培养基还包括占所述培养基总体积1-5％的化学成份确定的脂，所述化学成分确定的脂类选自胆固醇、维生素E、亚油酸与油酸中的至少一种。所述化学成分确定的脂能够参与细胞膜的合成，促进细胞增殖。

其中，胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料；维生素E具有抗氧化保护机体细胞免受自由基的毒害的作用；亚油酸是构成人体组织细胞的主要成分；油酸是动物组织中重要的营养素。这几种化学成分确定的脂能够参与细胞膜合成，参与细胞信号的传导，维持软骨细胞表型。

其中，优选的，所述刺激软骨细胞基质分泌的培养基还包括50-100μg/ml的维生素C、3-20ng/ml的碱性成纤维生长因子bFGF和3-15ng/ml的转化生长因子TGF-β。所述维生素C能够促进软骨细胞增殖和细胞外基质分泌，保护细胞免受自由基的伤害；所述碱性成纤维生长因子是软骨细胞有丝分裂原，能够促进软骨细胞增殖，维持软骨细胞表型；所述转化生长因子具有促进原代软骨细胞成熟，促进细胞基质分泌，维持软骨细胞表型的作用。

优选的，所述培养基还包括浓度为2-20μg/ml的胰岛素或者浓度为1-20ng/ml的胰岛素生长因子IGF-1，所述胰岛素和胰岛素样生长因子都能够促进细胞基质分泌，能够提高软骨细胞的活性，同时软骨细胞分泌软骨细胞外基质，不会引入外源物质，进而提高所述软骨细胞体内应用的稳定性与安全性。

其中，所述培养基还包括占所述培养基总体积5％-20％的血清。

所述血清可以为动物血清、胎牛血清、人血清、自体血清等。优选的，为了保证软骨细胞的培养效果，可以将血清在无菌状态下进行灭活、杀菌消毒处理。优选的，为了避免经异种或异体血清培养的软骨细胞存在试剂残留导致移植后发生排异反应及血清制品微生物污染问题，该血清可以选择自体血清。自体血清的制备方法可以为：

血样分离得到血清；将所得血清用0.22微米过滤器进行过滤两次；再将获得的血清在56℃水浴灭活热原至少30min；得到所需自体血清。

具体实施方式

以下，将参照本发明的实施例、对照例以及试验例详述本发明。这些实施例仅是为了具体说明本发明而提出的示例，本领域技术人员可以知道的是本发明的范围不受这些实施例、对照例以及试验例的限制。

对照例：

为了方便起见，将对照例所得的软骨细胞膜片记为G膜片，将对照例所采用的软骨细胞培养基记为G配方。

G配方的配制：

向基础培养基粉末DMEM加入无菌超纯水，溶解定容，充分溶解后，用0.22微米的滤膜进行过滤，封装，再向基础培养液中添加10％自体血清和60μg/ml Vc。

G膜片的制备：

将自体原代软骨细胞进行传代，在将第一次传代的人传代软骨细胞汇合至80％后，用第一次传代的人传代软骨细胞进行第二次传代，将第二次传代的传代软骨细胞汇合至80％，获得传代2次的传代软骨细胞，将所述传代2次的传代软骨细胞以10⁴/cm²的密度接种于培养孔板中，用所述G配方的培养基进行培养，每2天更换培养基一次，培养3周到5周，获得所述G膜片。

实施例1

为了方便起见，将实施例1所得的软骨细胞膜片记为A膜片，将实施例1所采用的软骨细胞培养基记为A配方。

A配方的配制：

向基础培养基干粉DMEM加入无菌超纯水，溶解定容，充分溶解后，用0.22微米的滤膜进行过滤，封装，再向基础培养液中添加5％自体血清和50μg/ml Vc，和因子组合获得A配方，如表1所示：

表1

A膜片的构建：

将自体原代软骨细胞进行传代，在将第一次传代的人传代软骨细胞汇合至80％后，用第一次传代的人传代软骨细胞进行第二次传代，将第二次传代的传代软骨细胞汇合至80％，获得传代2次的传代软骨细胞，将所述传代2次的传代软骨细胞以10⁴/cm²的密度接种于培养孔板中，用所述A配方的培养基进行培养，每2天更换培养基一次，培养3周到5周，获得所述片。

实施例2

为了方便起见，将实施例2所得的软骨细胞膜片记为B膜片，将实施例2所采用的软骨细胞培养基记为B配方。

B配方的配制：

向基础培养基干粉DF12加入无菌超纯水，溶解定容，充分溶解后，用0.22微米的滤膜进行过滤，封装，再向基础培养液中添加10％自体血清和60μg/ml Vc，和因子组合获得B配方，如表2所示：

表2

名称	含量
		基础培养基DF12	适量
自体血清	10％
		维生素C	60μg/ml
维生素E	3％
		地塞米松	1μg/ml
多西环素	1μmol/ml
		骨形成蛋白(BMP-2)	5ng/ml
转化生长因子(TGF-β)	15ng/ml

B膜片的构建：

将自体原代软骨细胞进行传代，在将上一次传代的人传代软骨细胞汇合至80％后，用上一次传代的人传代软骨细胞进行下一次传代，直至传代4次，将第四次传代的传代软骨细胞汇合至80％，获得传代4次的传代软骨细胞，将所述传代4次的传代软骨细胞以10⁵/cm²的密度接种于培养孔板中，用所述B配方的培养基进行培养，每3天更换培养基一次，培养3周到5周，获得所述B膜片。

实施例3

为了方便起见，将实施例3所得的软骨细胞膜片记为C膜片，将实施例3所采用的软骨细胞培养基记为C配方。

C配方的配制：

向基础培养基干粉DMEM加入无菌超纯水，溶解定容，充分溶解后，用0.22微米的滤膜进行过滤，封装，再向基础培养液中添加20％自体血清和100μg/ml Vc，和因子组合获得C配方，如表3所示：

表3

C膜片的构建：

将自体原代软骨细胞进行传代，在将上一次传代的人传代软骨细胞汇合至80％后，用上一次传代的人传代软骨细胞进行下一次传代，直至传代3次，将第三次传代的传代软骨细胞汇合至80％，获得传代3次的传代软骨细胞，将所述传代3次的传代软骨细胞以5×10⁴/cm²的密度接种于培养孔板中，用所述C配方的培养基进行培养，每2.5天更换培养基一次，培养3周到5周，获得所述C膜片。

实施例4

为了方便起见，将实施例4所得的软骨细胞膜片记为D膜片，将实施例4所采用的软骨细胞培养基记为D配方。

D配方的配制：

向基础培养基干粉DMEM加入无菌超纯水，溶解定容，充分溶解后，用0.22微米的滤膜进行过滤，封装，再向基础培养液中添加5％胎牛血清和50μg/ml Vc，和因子组合获得D配方，如表4所示：

表4

D膜片的构建：

所述D膜片的构建方法与所述A膜片的构建方法完全相同，在此不再赘述。

实施例5

为了方便起见，将实施例5所得的软骨细胞膜片记为E膜片，将实施例5所采用的软骨细胞培养基记为E配方。

E配方的配制：

向基础培养基干粉DF12加入无菌超纯水，溶解定容，充分溶解后，用0.22微米的滤膜进行过滤，封装，再向基础培养液中添加10％胎牛血清和60μg/ml Vc，和因子组合获得E配方，如表5所示：

表5

名称	含量
		基础培养基DF12	适量
胎牛血清	10％
		维生素C	60μg/ml
维生素E	3％
		多西环素	1μmol/ml
骨形成蛋白(BMP-2)	5ng/ml

地塞米松	1μg/ml
		转化生长因子(TGF-β)	15ng/ml

E膜片的构建：

所述E膜片的构建方法与所述B膜片的构建方法完全相同，在此不再赘述。

实施例6

为了方便起见，将实施例6所得的软骨细胞膜片记为F膜片，将实施例6所采用的软骨细胞培养基记为F配方。

F配方的配制：

向基础培养基干粉DMEM加入无菌超纯水，溶解定容，充分溶解后，用0.22微米的滤膜进行过滤，封装，再向基础培养液中添加20％胎牛血清和100μg/ml Vc，和因子组合获得F配方，如表6所示：

表6

F膜片的构建：

所述E膜片的构建方法与所述C膜片的构建方法完全相同，在此不再赘述。

在接下来的试验例中能够得出，通过本发明实施例1-6的所述刺激软骨细胞基质分泌的培养基A-F与对照例提供的软骨细胞培养基G对软骨细胞进行培养以得到所述软骨细胞膜片，发现本发明实施例1-6提供的软骨细胞培养基A-F能够刺激软骨细胞分泌细胞外基质，所述自体细胞外基质包裹所述软骨细胞获得软骨细胞膜片A-F，所得软骨细胞膜片A-F的韧性较好，在提高软骨细胞增殖能力的同时改善与维持软骨细胞表型，而将所述软骨细胞膜片A-F植入自体软骨细胞修复时，能够提高软骨细胞体外应用的稳定性与安全性。

实验例：

为客观地评价刺激软骨细胞基质分泌的培养基A-F培养的所述软骨细胞的增殖能力，所述刺激软骨细胞基质分泌的培养基A-F在培养软骨细胞时能否改善与维持软骨细胞表型，以及所获得的软骨细胞膜片A-F体外应用的技术效果，在以下的试验中分别对所述刺激软骨细胞基质分泌的培养基A-F与现有技术提供的软骨细胞培养基G培养相同的软骨细胞获得软骨细胞膜片A-G进行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫组化分析对比实验。

1、试验样品

实施例1-6中的刺激软骨细胞基质分泌的培养基A-F与对照例中的软骨细胞培养基G培养自体传代软骨细胞获得的软骨细胞膜片A-G。

需要说明的是，在培养过程中，除了培养基不同外，其他培养条件都相同，如温度，细胞密度，培养时间等都相同。

2、测试分析方法：

计数各组软骨细胞膜片A-G的细胞总量；

光学显微镜观察软骨细胞膜片A-G中的细胞生长状态；

对各组中的软骨细胞膜片A-G切片，进行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫组化分析。

3、实验结果：

在试验操作中，通过镊子夹取所述软骨细胞膜片A-G进行肉眼观察，发现：本发明实施例所得的软骨细胞膜片A-F的韧性明显优于所述软骨细胞膜片G，且所述软骨细胞膜片A-F的厚度大于所述软骨细胞膜片G。

分别对所述各组软骨细胞膜片中的软骨细胞进行计数统计发现，采用刺激软骨细胞基质分泌的培养基A-F培养的软骨细胞增殖数量明显高于采用软骨细胞培养基G培养的细胞；同时，我们还发现：采用本发明实施例所述的刺激软骨细胞基质分泌的培养基A、B、C培养的细胞扩增能力高于本发明实施例所述的刺激软骨细胞基质分泌的培养基D、E、F培养的细胞增殖能力，软骨细胞状态保持更好。

参见图1为光学显微镜拍摄的软骨细胞膜片A-G中的软骨细胞生长状态的光学显微照片，结果显示：采用刺激软骨细胞基质分泌培养基A-F培养的软骨细胞密度明显高于采用软骨细胞培养基G培养的细胞密度，且A-F组软骨细胞成多角形、立体感较强，贴壁能力较好，生长状态良好；而G组细胞呈平铺状，立体感差，贴壁能力较差，并且G组细胞随传代过程的进行，细胞呈梭形，成纤维化和去分化趋势严重，说明采用本发明所述刺激软骨细胞基质分泌的培养基A-F培养的软骨细胞的细胞状态明显优于软骨细胞培养基G培养的软骨细胞的细胞状态。进一步的，我们发现，采用刺激软骨细胞基质分泌的培养基A、B、C培养的软骨细胞的细胞状态相对于刺激软骨细胞基质分泌的培养基D、E、F培养的软骨细胞的细胞状态更优。

参见图2，为对软骨细胞膜片A-G进行甲苯胺蓝染色的光学显微照片，结果显示：被染色的细胞核呈紫色，细胞质呈蓝色。

参见图3，为对软骨细胞膜片A-G进行Ⅱ型胶原免疫组化分析的光学显微照片，结果显示：进行Ⅱ型胶原免疫组化检测后，其细胞外基质和细胞膜被染成黄色，说明有Ⅱ型胶原表达。Ⅱ型胶原阳性率越高，其颜色越深。

结合图2与图3可得出：刺激软骨细胞基质分泌的培养基A-F培养的软骨细胞的Ⅱ型胶原阳性率明显高于软骨细胞培养基G培养得软骨细胞的Ⅱ型胶原阳性率；同时,我们还发现：采用刺激软骨细胞基质分泌的培养基A、B、C培养的软骨细胞的Ⅱ型胶原阳性率相对于刺激软骨细胞基质分泌的培养基D、E、F培养的软骨细胞的Ⅱ型胶原阳性率更高。

综合上述试验结论，我们在组织来源限制的情况下对人传代软骨构建软骨细胞膜片，本发明中刺激软骨细胞基质分泌的培养基A-F培养的细胞，其体外增殖能力有较明显的提高，并且软骨细胞表型维持也优于G组。本发明所得的软骨细胞膜片A-F满足软骨细胞治疗中对软骨细胞的需求，并且所得软骨细胞膜片A-F具有较好的韧性，为软骨细胞自体分泌的基质包裹所述软骨细胞而得到，近似于天然软骨细胞膜片，将所述软骨细胞膜片A-F植入自体软骨细胞修复时，II型胶原阳性率高，模拟所述软骨细胞的生长环境，能够提高软骨细胞体外应用的稳定性与安全性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种软骨细胞膜片的构建方法，其特征在于，包括：

将软骨细胞接种于培养孔板中，用刺激软骨细胞基质分泌的培养基培养所述软骨细胞3-5周，期间每2-3天更换培养基一次；所述培养基刺激所述软骨细胞分泌软骨细胞外基质，所述软骨细胞外基质包裹所述软骨细胞，获得所述软骨细胞膜片，其中，所述软骨细胞外基质包括Ⅱ型胶原和糖胺聚糖；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述软骨细胞的接种密度为10⁴-10⁵/cm²。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述软骨细胞为人传代软骨细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，获取人传代软骨细胞包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述人原代软骨细胞是由包括以下步骤的方法制备得到：

将人关节软骨组织用0.05-1％II型胶原酶消化；

将经过消化的细胞用培养液稀释后，离心收集细胞；

用培养液离心洗涤，获取人原代软骨细胞。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述骨形成蛋白BMP-2在所述培养基中的浓度为2-10ng/ml，所述多西环素在所述培养基中的浓度为0.1-5μmol/ml，所述地塞米松在所述培养基中的浓度为0.2-2μg/ml。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述刺激软骨细胞基质分泌的培养基还包括占所述培养基总体积1-5％的化学成份确定的脂，所述化学成分确定的脂类选自胆固醇、维生素E、亚油酸与油酸中的至少一种。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述刺激软骨细胞基质分泌的培养基还包括50-100μg/ml的维生素C、3-20ng/ml的碱性成纤维生长因子bFGF和3-15ng/ml的转化生长因子TGF-β。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述刺激软骨细胞基质分泌的培养基还包括2-8μg/ml的胰岛素或者5-20ng/ml的胰岛素生长因子IGF-1。