CN113201487A - 成软骨细胞培养基及成软骨细胞的培养方法 - Google Patents

成软骨细胞培养基及成软骨细胞的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种成软骨细胞培养基及成软骨细胞的培养方法；其中，培养基包括1%~10%胎牛血清的DMEM培养基、终浓度为0.5~1.5g/ml的鹿角胶、终浓度为0.1~0.2g/m的氨基葡萄糖、终浓度为0.8~1.2ng/ml的TGF‑β及PBS缓冲液。培养基中的鹿角胶和氨基葡萄糖能刺激脂肪干细胞向成软骨细胞分化，且分化效率可达到72%；TGF‑β细胞因子保证细胞原有的活性，同时具有调节刺激活性、促进成软骨细胞生长。

Description

成软骨细胞培养基及成软骨细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及生物细胞培养领域，尤其涉及一种成软骨细胞培养基及成软骨细胞的培养方法。
背景技术
关节软骨损伤引起的病变，在临床上较为常见，软骨创伤极难修复，因为软骨组织没有血管和神经，也就决定了软骨不可再生。关节软骨的损伤会导致患者的关节反复疼痛和活动受限，严重影响患者的日常生活。现阶段，对于关节软骨疾病的治疗，其一是，关节冲洗、微裂缝等手术治疗；其二是，自身其他部位采集软骨组织移植到缺损部分进行修复；其三，将软骨种子细胞接种到合适的生物支架材料上形成复合物植入软骨缺损出，实现软骨组织结构和功能再生。然而，治疗软管疾病的第一种方法，只适合于短期改善患者的临床症状，长期疗效不理想；第二种方法，自身可提供采集软骨组织的部位和数量有限；第三中方法，属于软骨组织工程技术，其生物支架材料、种子细胞等的选取有限，且成软骨细胞分化效率低。
发明内容
基于上述问题，本发明所要解决的问题之一在于提供一种成软骨细胞分化效率高、不受取材限制且适用于长期改善患者软骨疾病的成软骨细胞培养基。
本发明所要解决的问题二在于提供一种使用脂肪干细胞转化成软骨细胞的培养方法。
本发明的技术方案如下：
一种成软骨细胞培养基，包括1%~10%胎牛血清的DMEM培养基、终浓度为0.5~1.5g/ml的鹿角胶、终浓度为0.1~0.2g/m的氨基葡萄糖、终浓度为0.8~1.2ng/ml 的TGF-β及PBS缓冲液。
较好地，所述成软骨细胞培养基中，还包括终浓度 1.0~2.0g/ml的脯氨酸、终浓度0.5~ 1.5g/ml的丙酮酸钠及终浓度 1.0~1.5ng/ml 的IFN-γ中的至少一种。
较好地，所述成软骨细胞培养基中，还包括终浓度 1.0~3.0g/ml的维生素E及终浓度 0.5~4.0g/ml的维生素C。
较好地，所述成软骨细胞培养基中，还包括终浓度为0.5~5μg/ml的AMD3100、终浓度为0.01~0.1ng/ml的BMP-4及终浓度为10~20μg/ml的胰岛素。
本发明还提供一种成软骨细胞的培养方法，包括如下步骤：
S1、取成软骨细胞培养基基置于培养器皿中，并往培养器皿中加入脂肪干细胞，进行细胞培养；所述成软骨细胞培养基中含终浓度为0.5~1.5g/ml的鹿角胶、终浓度为0.1~0.2g/m的氨基葡萄糖及终浓度为0.8~1.2ng/ml 的TGF-β；
S2、第3日换液，添加所述培养基继续细胞培养；
S3、第6日，清洗，取样进行细胞计数，调整细胞浓度在2.0×105/ml~3.0×105/ml；继续培养；
S4、第9日至22日，每隔2-3日换液一次，继续添加所述培养基继续细胞培养；
S5、第25日换液，再次添加添加所述培养基继续细胞培养；
S6、第28日，停止培养，所述脂肪干细胞已经完成细胞分化培养，即得到成软骨细胞。
较好地，所述培养方法中，所述脂肪干细胞为P2代脂肪干细胞。
较好地，所述培养方法的步骤S2中，第3日换液所用培养基中含有终浓度为1.0~2.0g/ml的脯氨酸、终浓度0.5~1.5g/ml的丙酮酸钠及终浓度 1.0~1.5ng/ml 的IFN-γ。
较好地，所述培养方法的步骤S4中，第9至22日换液所用培养基中含终浓度 1.1~3.0g/ml的维生素E及终浓度 0.5~4.0g/ml的维生素C。
较好地，所述培养方法的步骤S5中，换液所用培养基中含终浓度为0.5~5μg/ml的AMD3100、终浓度为0.01~0.1ng/ml的BMP-4及终浓度为10~20μg/ml的胰岛素。
较好地，所述培养方法中，所述脂肪干细胞培养是在37℃、5%CO2环境氛围下的培养箱中进行。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1、培养基中的成分鹿角胶和氨基葡萄糖能刺激脂肪干细胞向成软骨细胞分化，且分化效率可达到72%。
2、脂肪干细胞转化成软骨细胞过程中，TGF-β细胞因子保证细胞原有的活性，同时具有调节刺激活性、促进成软骨细胞生长。
3、本发明细胞培养过程中，每个阶段所添加的培养基中的组分不完全一样，这是根据成软骨细胞生长分化需要，为其提供相应的营养物质（如，脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C和维生素E等）、及进一步刺激诱导成软骨细胞分化增殖的细胞因子（如，AMD3100、BMP-4、胰岛素等）。
附图说明
图1a、1b、1c、1d表示显微镜下，实施例7中的软骨球阿利辛蓝染色后观察到的图片；其中，图1a为显微镜放大40倍图；图1b为显微镜放大100倍图；图1c为显微镜放大200倍图；图1d为显微镜放大400倍图；
图2a、2b、2c、2d表示显微镜下，对比例1中的软骨球阿利辛蓝染色后观察到的图片；图2a为显微镜放大40倍图；图2b为显微镜放大100倍图；图2c为显微镜放大200倍图；图2d为显微镜放大400倍图；
图3为以1mm2为观察视野放大100倍后，测算实施例1和对比例1中阿利辛蓝染色细胞面积随培养时间变化图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
本发明提供的一种成软骨细胞培养基，包括1%~10%胎牛血清的DMEM培养基、终浓度为0.5~1.5g/ml的鹿角胶、终浓度为0.1~0.2g/m的氨基葡萄糖、终浓度为0.8~1.2ng/ml的TGF-β及PBS缓冲液。
较好地，所述成软骨细胞培养基中，还包括终浓度 1.0~2.0g/ml的脯氨酸、终浓度0.5~ 1.5g/ml的丙酮酸钠及终浓度 1.0~1.5ng/ml 的IFN-γ中的至少一种。
较好地，所述成软骨细胞培养基中，还包括终浓度 1.0~3.0g/ml的维生素E及终浓度 0.5~4.0g/ml的维生素C。
较好地，所述成软骨细胞培养基中，还包括终浓度为0.5~5μg/ml的AMD3100、终浓度为0.01~0.1ng/ml的BMP-4及终浓度为10~20μg/ml的胰岛素。
本发明还提供一种成软骨细胞的培养方法，包括如下步骤：
S1、取成软骨细胞培养基置于培养器皿中，并往培养器皿中加入脂肪干细胞，进行细胞培养；所述成软骨细胞培养基中含终浓度为0.5~1.5g/ml的鹿角胶、终浓度为0.1~0.2g/m的氨基葡萄糖及终浓度为0.8~1.2ng/ml 的TGF-β；此处的培养器皿可以是离心管、T175培养瓶、10cm的培养皿或培养袋；
S2、第3日换液，添加所述培养基继续细胞培养；此时培养液中出现微小的软骨球；
S3、第6日，清洗，取样进行细胞计数，调整细胞浓度在2.0×105/ml~3.0×105/ml；继续培养；
S4、第9日至22日，每隔2-3日换液一次，继续添加所述培养基继续细胞培养；
S5、第25日换液，再次添加添加所述培养基继续细胞培养；
S6、第28日，停止培养，所述脂肪干细胞已经完成细胞分化培养，即得到成软骨细胞。
较好地，所述培养方法中，所述脂肪干细胞为P2代脂肪干细胞。
较好地，所述培养方法的步骤S2中，第3日换液所用培养基中含有终浓度为1.0~2.0g/ml的脯氨酸、终浓度0.5~ 1.5g/ml的丙酮酸钠及终浓度 1.0~1.5ng/ml 的IFN-γ。
较好地，所述培养方法的步骤S4中，第9至22日换液所用培养基中含终浓度 1.1~3.0g/ml的维生素E及终浓度 0.5~4.0g/ml的维生素C。
较好地，所述培养方法的步骤S5中，换液所用培养基中含终浓度为0.5~5μg/ml的AMD3100、终浓度为0.01~0.1ng/ml的BMP-4及终浓度为10~20μg/ml的胰岛素。
较好地，所述培养方法中，所述脂肪干细胞培养是在37℃、5%CO2环境氛围下的培养箱中进行。
下面采用具体实施例进行说明。
实施例1 成软骨细胞培养基配置（按照500ml定容量配置）
1、将200ml含5%胎牛血清的DMEM培养基（市购获得）加入洁净的容量瓶中；
2、往容量瓶中加入鹿角胶、氨基葡萄糖及TGF-β，且确保鹿角胶的终浓度为1.0g/ml、氨基葡萄糖的终浓度为0.15g/m、TGF-β的终浓度为1.0ng/ml ；
3、加入PBS缓冲液，使成软骨细胞培养基的容量定容为500ml；
4、不断吹打培养基，使各组分混合均匀；静置备用。
实施例2 成软骨细胞培养基配置（按照500ml定容量配置）。
1、将150ml含10%胎牛血清的DMEM培养基（市购获得）加入洁净的容量瓶中；
2、往容量瓶中加入鹿角胶、氨基葡萄糖及TGF-β，且确保鹿角胶的终浓度为1.5g/ml、氨基葡萄糖的终浓度为0.2g/m、TGF-β的终浓度为1.2ng/ml ；
3、往容量瓶中加入脯氨酸、丙酮酸钠及IFN-γ中的至少一种，且确保脯氨酸的终浓度 2.0g/ml、丙酮酸钠的终浓度1.5g/ml和/或IFN-γ的终浓度 1.5ng/ml ；
4、加入PBS缓冲液，使成软骨细胞培养基的容量定容为500ml；
5、不断吹打培养基，使各组分混合均匀；静置备用。
实施例3 成软骨细胞培养基配置（按照500ml定容量配置）。
1、将200ml含1%胎牛血清的DMEM培养基（市购获得）加入洁净的容量瓶中；
2、往容量瓶中加入鹿角胶、氨基葡萄糖及TGF-β，且确保鹿角胶的终浓度为0.5g/ml、氨基葡萄糖的终浓度为0.1g/m、TGF-β的终浓度为0.8ng/ml ；
3、往容量瓶中加入脯氨酸、丙酮酸钠及IFN-γ中的至少一种，且确保脯氨酸的终浓度 1.0g/ml、丙酮酸钠的终浓度0.5g/ml和/或IFN-γ的终浓度 1.0ng/ml ；
4、往容量瓶中加入维生素E和维生素C，且确保维生素E的终浓度 1.0~3.0g/ml及维生素C的终浓度 0.5~4.0g/ml；
5、加入PBS缓冲液，使成软骨细胞培养基的容量定容为500ml；
6、不断吹打培养基，使各组分混合均匀；静置备用。
实施例4 成软骨细胞培养基配置（按照500ml定容量配置）。
1、将200ml含5%胎牛血清的DMEM培养基（市购获得）加入洁净的容量瓶中；
2、往容量瓶中加入鹿角胶、氨基葡萄糖及TGF-β，且确保鹿角胶的终浓度为1.0g/ml、氨基葡萄糖的终浓度为0.15g/m、TGF-β的终浓度为1.0ng/ml；
3、往容量瓶中加入脯氨酸、丙酮酸钠及IFN-γ中的至少一种，且确保脯氨酸的终浓度 2.0g/ml、丙酮酸钠的终浓度1.5g/ml和/或IFN-γ的终浓度 1.5ng/ml ；
4、往容量瓶中加入维生素E和维生素C，且确保维生素E的终浓度 1.0~3.0g/ml及维生素C的终浓度 0.5~4.0g/ml；
5、往容量瓶中加入AMD3100、BMP-4及胰岛素；且AMD3100的终浓度为3μg/ml、BMP-4的终浓度为0.05ng/ml及胰岛素的终浓度为15μg/ml
6、加入PBS缓冲液，使成软骨细胞培养基的容量定容为500ml；
7、不断吹打培养基，使各组分混合均匀；静置备用。
实施例5 成软骨细胞培养基配置（按照500ml定容量配置）。
1、将200ml含5%胎牛血清的DMEM培养基（市购获得）加入洁净的容量瓶中；
2、往容量瓶中加入鹿角胶、氨基葡萄糖及TGF-β，且确保鹿角胶的终浓度为1.0g/ml、氨基葡萄糖的终浓度为0.15g/m、TGF-β的终浓度为1.0ng/ml；
3、往容量瓶中加入脯氨酸、丙酮酸钠及IFN-γ中的至少一种，且确保脯氨酸的终浓度 2.0g/ml、丙酮酸钠的终浓度1.5g/ml和/或IFN-γ的终浓度 1.5ng/ml ；
4、往容量瓶中加入维生素E和维生素C，且确保维生素E的终浓度 1.0~3.0g/ml及维生素C的终浓度 0.5~4.0g/ml；
5、往容量瓶中加入AMD3100、BMP-4及胰岛素；且AMD3100的终浓度为0.5μg/ml、BMP-4的终浓度为0.01ng/ml及胰岛素的终浓度为10μg/ml
6、加入PBS缓冲液，使成软骨细胞培养基的容量定容为500ml；
7、不断吹打培养基，使各组分混合均匀；静置备用。
实施例6 成软骨细胞培养基配置（按照500ml定容量配置）。
1、将200ml含5%胎牛血清的DMEM培养基（市购获得）加入洁净的容量瓶中；
2、往容量瓶中加入鹿角胶、氨基葡萄糖及TGF-β，且确保鹿角胶的终浓度为1.0g/ml、氨基葡萄糖的终浓度为0.15g/m、TGF-β的终浓度为1.0ng/ml；
3、往容量瓶中加入脯氨酸、丙酮酸钠及IFN-γ中的至少一种，且确保脯氨酸的终浓度 2.0g/ml、丙酮酸钠的终浓度1.5g/ml和/或IFN-γ的终浓度 1.5ng/ml ；
4、往容量瓶中加入维生素E和维生素C，且确保维生素E的终浓度 1.0~3.0g/ml及维生素C的终浓度 0.5~4.0g/ml；
5、往容量瓶中加入AMD3100、BMP-4及胰岛素；且AMD3100的终浓度为5μg/ml、BMP-4的终浓度为0.1ng/ml及胰岛素的终浓度为20μg/ml
6、加入PBS缓冲液，使成软骨细胞培养基的容量定容为500ml；
7、不断吹打培养基，使各组分混合均匀；静置备用。
实施7 脂肪干细胞转化成软骨细胞培养。
本实施例中，培养器皿采用15ml规格的离心管。
1、利用PBS缓冲液清洗脂肪组织，去除残留的血液和组织碎片；将清洗后的脂肪组织剪成小块放入10cm的培养皿中，将培养皿放入震荡箱中消化20min～60min；然后静置待其分层后，吸取上层脂肪细胞液，将脂肪细胞液置于0-5℃的箱体内培养1-2小时，密封离心分离，去除上清液，再次用PBS缓冲液清洗、离心、分离等处理多次，制成脂肪干细胞悬液。
2、取含3.0×104/ml~4.0×104/ml脂肪干细胞悬液转移至15ml离心管中，250g离心4分钟。
3、吸去上清液，加入实施例1中的0.5ml培养基，重悬离心管中的下层沉淀，以清洗脂肪干细胞，然后再次150g离心4分钟；多次重复此步骤，清洗脂肪干细胞。
4、用实施例1制得成软骨细胞培养基0.5ml重悬上一步骤所得沉淀取，150g离心5分钟。
5、将离心管盖拧松，以便于气体交换，放入37℃、5%CO2环境氛围下的培养箱中进行诱导激活培养。
6、第3日，对离心管中的培养基进行换液，添加实施例2中配置的培养基0.5ml，继续进行细胞培养。
7、第6日，清洗、取样进行细胞计数，调整细胞浓度为2.0×105/ml~3.0×105/ml；继续培养。
8、第9日至22日，每隔2-3日换液一次，往离心管中添加实施例3制得的培养基0.5ml，继续细胞培养。
9、第25日，换液，再次添加添加实施例4制得的培养基0.5ml，继续细胞培养。
10、第28日，停止培养，将培养液及细胞进行150g离心处理5分钟，吸除上清液，然后用生理盐水清洗下层沉淀；接着150g离心处理5分钟，吸除上清液，再加入生理盐水清洗下层沉淀，随后150g离心处理5分钟；反复多次后，收集离心管中下沉沉淀物，即软骨球，也就是成软骨细胞。
在细胞培养过程中，发现细胞出现聚拢现象时，轻轻振动一下培养器皿，使软骨球脱离培养器皿或培养袋而悬浮在培养液中。
每次更换培养液时，小心操作，不要洗出软骨球，且换液之后，轻轻振动一下培养器皿，使软骨球脱离培养器皿或培养袋而悬浮在培养液中。
对比例1 普通的脂肪干细胞转化成软骨细胞培养。
1、本对比例中各个步骤流程都与实施例7相同，主要区别在于培养基。本对比例1中的培养基为：无血清DMEM培养基；终浓度为10μl/ml的地塞米松、终浓度为300μl/ml的抗坏血酸、终浓度为1ml/ml的ITS添加物、终浓度为100μl/ml的丙酮酸钠及终浓度为1ml/ml的TGF-β3。
2、每次更换培养及，都是采用同一种培养基。
实施例8、阿利辛蓝染色分析。
为了方便观察和表征，分别对实施例7和对比例1中的软骨球进行阿利辛蓝染色观察。
阿利辛蓝染色观察具体实施步骤如下：
1、软骨球经石蜡包埋后切片。
2、染色步骤：
a）脱蜡和脱水；
b）阿利辛蓝染色液染色30分钟；
c）去离子水冲洗2分钟。
（1）、显微镜下观察阿利辛蓝染色效果。
显微镜：倒置显微镜；型号：XD；生成商家：宁波舜宇。
如图1a至1d所示，表示显微镜下，实施例7中的软骨球阿利辛蓝染色后观察到的图片；图1a为显微镜放大40倍图；图1b为显微镜放大100倍图；图1c为显微镜放大200倍图；图1d为显微镜放大400倍图。
如图2a至2d所示，表示显微镜下，对比例1中的软骨球阿利辛蓝染色后观察到的图片；图2a为显微镜放大40倍图；图2b为显微镜放大100倍图；图2c为显微镜放大200倍图；图2d为显微镜放大400倍图。
由图1a至1d、2a至2d所示,阿利辛蓝染色部分显示的是软骨组织中的内酸性粘多糖。由此可知，脂肪干细胞在本发明提供的成软骨细胞培养基的诱导下转化为成软骨细胞了。但是，图1a至1d观察到的图片及图2a至2d观察到的图片可以知悉，实施例7中，采用本发明培养基诱导脂肪干细胞转化成软骨细胞时，此时的软骨组织细胞为团聚成软骨球形状，这表明软骨组织中内酸性多糖含量较多，转化效果较好；而对比例1中培养基诱导脂肪干细胞转化成软骨细胞少而分散，表明软骨组织中内酸性多糖含量较少，转化效果较差。故，本发明的成软骨细胞培养基中的鹿角胶、氨基葡萄糖以及TGF-β都能刺激脂肪干细胞向成软骨细胞分化，且可以保证细胞原有的活性，同时具有调节刺激活性、促进成软骨细胞生长。
（2）、显微镜下观察阿利辛蓝染色面积
针对成软骨细胞生长与分化，在显微镜下、以1mm2为观察视野放大100倍后，测算阿利辛蓝染色细胞面积，以表示成软骨细胞的生长、分化数量。通过计算阿利辛蓝染色细胞面积来测算成软骨细胞生长分化率；染色部分代表成软骨细胞，未染色部分表示脂肪干细胞。测算结果如表1和图3。
表1 阿利辛蓝染色细胞面积统计表
Figure 520805DEST_PATH_IMAGE001
由表1和图3可知，培养时间相同条件下，对成软骨细胞染色面积测算，同时间点上，实施例1中测算出来的细胞染色面积均大于对比例1中测算出来的细胞染色面积，表明实施例1中的成软骨细胞培养基在脂肪干细胞转化成软骨细胞方面具有较好的诱导、刺激作用。第28天停止培养后，实施例1可以达到72.05mm2，几乎比对比例1高出30.3mm2，实施例1中细胞染色面积比对比例1中细胞染色面积高出72.57%；而阿利辛蓝染色细胞面积大小，体现了脂肪干细胞转化成软骨细胞增殖分化的数量多少，染色面积越大，软骨细胞增殖分化的数量也就越多。由此可知，培养基中的鹿角胶、氨基葡萄糖、AMD3100、BMP-4、胰岛素等组分组合后能刺激脂肪干细胞向成软骨细胞分化，且分化效率相对对比例1而言，可高达72%。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种成软骨细胞培养基，其特征在于，包括1%~10%胎牛血清的DMEM培养基、终浓度为0.5~1.5g/ml的鹿角胶、终浓度为0.1~0.2g/m的氨基葡萄糖、终浓度为0.8~1.2ng/ml 的TGF-β及PBS缓冲液。
2.根据权利要求1所述的成软骨细胞培养基，其特征在于，还包括终浓度 1.0~2.0g/ml的脯氨酸、终浓度0.5~ 1.5g/ml的丙酮酸钠及终浓度 1.0~1.5ng/ml 的IFN-γ中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的成软骨细胞培养基，其特征在于，还包括终浓度 1.0~3.0g/ml的维生素E及终浓度 0.5~4.0g/ml的维生素C。
4.根据权利要求3所述的成软骨细胞培养基，其特征在于， 还包括终浓度为0.5~5μg/ml的AMD3100、终浓度为0.01~0.1ng/ml的BMP-4及终浓度为10~20μg/ml的胰岛素。
5.一种成软骨细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取成软骨细胞培养基置于培养器皿中，并往培养器皿中加入脂肪干细胞，进行细胞培养；所述成软骨细胞培养基中含终浓度为0.5~1.5g/ml的鹿角胶、终浓度为0.1~0.2g/m的氨基葡萄糖及终浓度为0.8~1.2ng/ml 的TGF-β；
S2、第3日换液，添加所述培养基继续细胞培养；
S3、第6日，清洗，取样进行细胞计数，调整细胞浓度在2.0×105/ml~3.0×105/ml；继续培养；
S4、第9至22日换液，继续添加所述培养基继续细胞培养；
S5、第25日换液，再次添加所述培养基继续细胞培养；
S6、第28日，停止培养，所述脂肪干细胞已经完成细胞分化培养，即得到成软骨细胞。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述脂肪干细胞为P2代脂肪干细胞。
7.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤S2中，换液所用培养基中含有终浓度为1.0~2.0g/ml的脯氨酸、终浓度0.5~ 1.5g/ml的丙酮酸钠及终浓度 1.0~1.5ng/ml的IFN-γ。
8.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤S4中，换液所用培养基中含终浓度 1.1~3.0g/ml的维生素E及终浓度 0.5~4.0g/ml的维生素C。
9.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，步骤S5中，换液所用培养基中含终浓度为0.5~5μg/ml的AMD3100、终浓度为0.01~0.1ng/ml的BMP-4及终浓度为10~20μg/ml的胰岛素。
10.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述脂肪干细胞培养是在37℃、5%CO2环境氛围下的培养箱中进行。
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