CN104623197A - 一种左归丸纳米微球缓释系统及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种左归丸纳米微球缓释系统及其制备方法。一种左归丸纳米微球缓释系统，该缓释系统包括左归丸提取物和聚氰基丙烯酸正丁酯纳米载体，所述的左归丸提取物和聚氰基丙烯酸正丁酯纳米载体的质量比为1：0.1~10。本发明由于采用了上述的技术方案，以聚氰基丙烯酸正丁酯为原料，利用改良的乳液聚合法制备的左归丸纳米微球缓释系统。我们所用的左归丸纳米微球缓释系统具有持续性、高效性和可控性等优点，能持续、高效的稳定释放左归丸有效成分，促进软骨细胞增殖、分化，且具有天然无毒性、高效性等优点。

Description

一种左归丸纳米微球缓释系统及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种左归丸纳米微球缓释系统及其制备方法。

背景技术

目前临床上对于关节软骨损伤主要以手术治疗为主，包括：关节镜修复术、微骨折术、软骨下骨钻孔术、自体软骨移植术和自体软骨细胞移植术等。但是这些治疗方法临床疗效不够理想，且存在许多不足之处。其中关节镜修复术短期疗效较明显，但仅能延缓软骨磨损进程，无法促进软骨缺损修复，无法最终阻止关节炎的发生。微骨折术和软骨下骨钻孔术旨在使软骨下骨骨髓腔内的干细胞渗透到软骨损伤部位，启动软骨修复机制。但是由于缺乏精确有效的定位和调控，且修复后形成的是以纤维软骨为主的混合组织，因此临床效果并不理想。自体软骨移植术和自体软骨细胞移植术目前临床较为常用，但存在着取材来源有限，供区感染、失血、伤口难愈合，患者需遭受额外痛苦且不易接受等诸多问题。由于对关节软骨损伤缺乏有效的临床治疗方法，许多患者最后都进一步发展成为骨性关节炎，而作为临床治疗骨性关节炎唯一有效的人工关节置换术，其费用高昂，创伤大，并发症多，使用寿命有限，患者需遭受极大的身心痛苦和沉重的经济负担。由于此类关节疾病发病率高，致残性高，严重损害了患者的身体健康，危害巨大，因此被世界卫生组织定义为“第一致残疾病”。

组织工程技术的出现，为关节软骨损伤的治疗提供了一种全新的思路和方法。其基本原理是应用细胞生物学、生物材料和工程学的原理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的结构、功能的生物活性替代物。由于软骨组织中细胞成分单一，结构简单，只含有软骨细胞，因此组织工程技术非常适用于软骨缺损修复的研究。

软骨组织工程的研究内容主要包括三个方面：支架材料、种子细胞和细胞因子。目前软骨组织工程研究中常用的细胞因子包括：IGF-Ⅰ、TGF、BMP等，但都存在着诸多不足：价格昂贵，稳定性不好，体内半衰期短，生物膜透过性差，且在游离状态下极易失活，从而限制了其有效性的发挥。

纳米微球缓释系统（Nanoparticles Sustained Release System, NSRS）基本原理是利用高分子纳米材料包封药物形成球状实体，通过高分子纳米材料的缓慢降解而逐步释放药物，从而达到缓释的目的，具有持续性、高效性和可控性等优点。

相比较细胞因子而言，中医药在软骨组织工程研究中的应用具有无可比拟的优势：①中药材具有高生物安全性、无细胞毒性。②中药来源丰富且价格相对低廉，具有广泛推广和应用的条件。③中药复方含有多种生物活性物质，能多方位、高效的促进软骨细胞增殖、分化，稳定性好，有效性强。

左归丸出自明代名家张景岳的《景岳全书·新方八阵》,药物组成：熟地八两、山药炒四两、枸杞四两、山茱萸四两、川牛膝三两、菟丝子四两、鹿角胶四两、龟版胶四两,具有滋阴补肾,填精补髓之功。《素问》曰“形不足者,温之以气,精不足者,补之以味”,受此影响，张景岳提出“善补阴者,必于阳中求阴,则阴得阳升而泉源不竭”的观点,并创立了“阳中求阴”的代表方左归丸。方中在熟地、山茱萸、山药、枸杞子三阴并补的基础上配伍龟、鹿二胶血肉有情之品,以填精补髓,滋生真阴，同时配伍菟丝子温阳益阴,及鹿角胶“阳中求阴”,使肾中阴精的产生有阳气作为化生动力而源源不绝。中医认为肾主骨、生髓，故目前临床常用左归丸治疗骨骼系统方面的疾病。现代大量实验研究证明，左归丸的补肾精作用能够改善疏松的骨质、延缓骨钙流失，还能够促进软骨细胞的增殖、分化和修复。

中国发明专利申请（申请号：201310526829.0 申请日：2013-10-30）公开了一种左归丸的制备方法，由熟地黄200g、菟丝子100g、牛膝75g、龟板胶100g、鹿角胶100g、山药100g、山茱萸100g、枸杞子100g作为原料药制成，采用超临界萃取制备而成，使得含量有很大提高，服用量减少，本发明还提供了左归丸在制备抑制小鼠肺癌Lewis细胞增殖药物中的应用。

中国发明专利申请（申请号：200510027556.0 申请日：2005-07-06）公开的方法是分别将山茱萸、牛膝经醇提后,将药渣与熟地、山药、枸杞、菟丝子等合并水提,然后干燥成浸膏,再与已经粉碎成细粉的鹿角胶和龟甲胶细粉一步法制颗粒并包衣。

上述的方法制备的左归丸不具有缓释效果，在持续性和可控性等方面不具有优势。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的一个目的是提供一种左归丸纳米微球缓释系统，该系统具有持续性、高效性和可控性等优点，能持续、高效的稳定释放左归丸有效成分，促进软骨细胞增殖、分化。本发明的另外一个目的是提供上述的左归丸纳米微球缓释系统的制备方法。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种左归丸纳米微球缓释系统，该缓释系统包括左归丸提取物和聚氰基丙烯酸正丁酯纳米载体，所述的左归丸提取物和聚氰基丙烯酸正丁酯纳米载体的质量比为1：0.1~10。

作为优选，所述的左归丸提取物和聚氰基丙烯酸正丁酯纳米载体的质量比为1：0.1~5。

作为优选，所述的左归丸提取物制备的生药按重量份数计由以下的组分构成：

熟地   20~30    山药10~15    枸杞子10~15

山萸肉10~15    牛膝5~12     菟丝子10~15

龟板胶10~15    鹿角胶10~15。

作为最优选，所述的左归丸提取物制备的生药按重量份数计由以下的组分构成：

熟地   24    山药12    枸杞子12

山萸肉12    牛膝9     菟丝子12

龟板胶12    鹿角胶12。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种制备上述的左归丸纳米微球缓释系统的方法，该方法包括以下的步骤：

1）取左归丸干粉，溶于1.0 ~3.0mol/L盐酸胍溶液中，在0～5℃冰浴中，磁力搅拌下，缓慢加人含0.2~0.6%吐温-80和0.01~0.03%焦亚硫酸钠的双蒸水中；

2）用0.8~1.2 mol/L的HCl调节溶液pH值至3.5，不断搅拌下逐滴加入氰基丙烯酸正丁酯单体，继续搅拌反应30~50 min，得到乳白色的胶体混悬液：

3）2~6℃下用双蒸水透析30~55 h，用0.40~0.50μm的膜过滤后，真空冷冻干燥制成冻干粉，密封2~6℃保存。

作为优选，所述的左归丸干粉的制备如下：取生药置于去离子水浸泡3~5 h，煮沸后文火煎0.4~0.6h过滤，第2次加蒸馏水煮沸后煎0.4~0.6h过滤，混合2次滤液，浓缩后缓慢加热至干，得到左归丸干粉，密封2~6℃备用。

本发明由于采用了上述的技术方案，以聚氰基丙烯酸正丁酯为原料，利用改良的乳液聚合法制备的左归丸纳米微球缓释系统。我们所用的左归丸纳米微球缓释系统具有持续性、高效性和可控性等优点，能持续、高效的稳定释放左归丸有效成分，促进软骨细胞增殖、分化，且具有天然无毒性、高效性等优点。

附图说明

图1为本发明左归丸纳米微球缓释系统的微球扫描电镜图；微球呈圆球状，形态良好，直径大小为50-70μm，表面较光滑。

图2为微球中左归丸的体外累积释放度。

具体实施方式

实施例1  左归丸干粉的制备

按《景岳全书》剂量比例配方：熟地24 g，山药12 g，枸杞子12 g，山萸肉12 g，牛膝9 g，菟丝子12 g，龟板胶12 g，鹿角胶12 g，生药总量105克。置于500ml烧杯中加去离子水150 ml浸泡4 h，煮沸后文火煎0.5 h过滤，第2次加蒸馏水50 ml煮沸后煎0.5 h过滤，混合2次滤液，浓缩至约30 ml，转入50ml无嘴高脚烧杯中，电热板缓慢加热至干，得到左归丸干粉，密封4℃备用。

实施例2左归丸聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球的制备

取左归丸干粉20 mg，溶于10 ml 2.0 mol/L盐酸胍溶液中，在0～5℃冰浴中，磁力搅拌下，缓慢加人含0.4%吐温-80和0.02%焦亚硫酸钠的双蒸水20 ml中，用1.0 mol/L的HCl调节溶液pH值至3.5，不断搅拌下逐滴加入氰基丙烯酸正丁酯单体2.4 mL，继续搅拌反应40 min，得到乳白色的胶体混悬液。4℃下用双蒸水透析48 h，用0.45 μm的膜过滤后，真空冷冻干燥制成冻干粉，密封4℃保存。

实施例3左归丸聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球的制备

取左归丸干粉2 mg，溶于10 ml 2.0 mol/L盐酸胍溶液中，在0～5℃冰浴中，磁力搅拌下，缓慢加人含0.4%吐温-80和0.02%焦亚硫酸钠的双蒸水20 ml中，用1.0 mol/L的HCl调节溶液pH值至3.5，不断搅拌下逐滴加入氰基丙烯酸正丁酯单体2.4 mL，继续搅拌反应40 min，得到乳白色的胶体混悬液。4℃下用双蒸水透析48 h，用0.45 μm的膜过滤后，真空冷冻干燥制成冻干粉，密封4℃保存。

实施例4左归丸聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微球的制备

取左归丸干粉100 mg，溶于50 ml 2.0 mol/L盐酸胍溶液中，在0～5℃冰浴中，磁力搅拌下，缓慢加人含0.4%吐温-80和0.02%焦亚硫酸钠的双蒸水100 ml中，用1.0 mol/L的HCl调节溶液pH值至3.5，不断搅拌下逐滴加入氰基丙烯酸正丁酯单体5.6 mL，继续搅拌反应40 min，得到乳白色的胶体混悬液。4℃下用双蒸水透析48 h，用0.45 μm的膜过滤后，真空冷冻干燥制成冻干粉，密封4℃保存。

实施例5左归丸纳米微球缓释系统的包封率测定：

称取20mg实施例2制备的微球，溶解于2ml二氯甲烷中后，再加入1ml PBS溶液(pH 7.4)，持续高速搅拌5min，室温下放置20min后冻存，使用ELISA法测定样品OD值，根据标准曲线方程计算左归丸的浓度及含量，再使用下列公式计算微球的载药量和包封率。共检测3次，结果取平均值。

载药量=( 左归丸质量/总质量)×100%

包封率= (微球中左归丸质量/ 左归丸总质量)×100%

结果：微球的载药量和包封率平均值为0.0721%，包封率平均值为83.2%。

实施例6 左归丸纳米微球缓释系统的体外释放实验

称取适量实施例2制备的微球溶于含有2ml PBS缓冲液(pH 7.4)的玻璃试管中，将试管放置在37℃恒温水浴箱内。每隔24小时取出300μl样品溶液并加入等量新鲜的PBS缓冲液(pH 7.4)。测定IGF-1浓度并计算累积释放度，如图2所示。

Claims (6)

1.一种左归丸纳米微球缓释系统，其特征在于：该缓释系统包括左归丸提取物和聚氰基丙烯酸正丁酯纳米载体，所述的左归丸提取物和聚氰基丙烯酸正丁酯纳米载体的质量比为1：0.1~10。

2.根据权利要求1所述的一种左归丸纳米微球缓释系统，其特征在于：所述的左归丸提取物和聚氰基丙烯酸正丁酯纳米载体的质量比为1：0.1~5。

3.根据权利要求1或2所述的一种左归丸纳米微球缓释系统，其特征在于：左归丸提取物制备的生药按重量份数计由以下的组分构成：

熟地   20~30    山药10~15    枸杞子10~15

山萸肉10~15    牛膝5~12     菟丝子10~15

龟板胶10~15    鹿角胶10~15。

4.根据权利要求3所述的一种左归丸纳米微球缓释系统，其特征在于：左归丸提取物制备的生药按重量份数计由以下的组分构成：

熟地   24    山药12    枸杞子12

山萸肉12    牛膝9     菟丝子12

龟板胶12    鹿角胶12。

5.一种制备权利要求1~4任意一项权利要求所述的左归丸纳米微球缓释系统的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1）取左归丸干粉，溶于1.0 ~3.0mol/L盐酸胍溶液中，在0～5℃冰浴中，磁力搅拌下，缓慢加人含0.2~0.6%吐温-80和0.01~0.03%焦亚硫酸钠的双蒸水中；

2）用0.8~1.2 mol/L的HCl调节溶液pH值至3.5，不断搅拌下逐滴加入氰基丙烯酸正丁酯单体，继续搅拌反应30~50 min，得到乳白色的胶体混悬液：

3）2~6℃下用双蒸水透析30~55 h，用0.40~0.50μm的膜过滤后，真空冷冻干燥制成冻干粉，密封2~6℃保存。

6.根据权利要求5所述的一种左归丸纳米微球缓释系统的制备方法，其特征在于左归丸干粉的制备如下：取生药置于去离子水浸泡3~5 h，煮沸后文火煎0.4~0.6h过滤，第2次加蒸馏水煮沸后煎0.4~0.6h过滤，混合2次滤液，浓缩后缓慢加热至干，得到左归丸干粉，密封2~6℃备用。