CN110300798A - 从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从来源于脐带血单核细胞的逆分化干细胞分化诱导软骨细胞的方法。将通过本发明的方法制备的软骨细胞体移植于生物体内的软骨损伤部位时，可通过分化的软骨细胞有效示出软骨再生，相对于移植通过添加重组生长因子来分化诱导的软骨细胞的情况，其可具有更有效的软骨再生能力，因此可有用地用于软骨再生的组织工程治疗方法。

Description

从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法
技术领域
本申请主张2017年1月19日申请的韩国专利申请第10-2017-0009015号及2017年1月19日申请的韩国专利申请第10-2017-0009019号的优先权，上述说明书的全部内容是本申请的参考文献。
本发明涉及对个性化再生医学科提供新的策略的用于分化软骨细胞的组合物制备方法、由此分化的软骨细胞及用于分化上述软骨细胞的组合物或包含软骨分化细胞的用于预防或治疗软骨相关疾病的药学组合物。
背景技术
软骨(cartilage)是由软骨细胞和软骨基质组成的骨组织，是指大致形成关节的一部分的组织。软骨大部分由富含软骨细胞和大量的细胞外基质(ECM；extracellularmatrix)的各种胶原蛋白、蛋白多糖及柔韧的纤维组成。由此，软骨具有高弹性和非常低的摩擦系数，起到防止骨骺摩擦的缓冲作用，并起到可使在几乎没有摩擦的状态下帮助关节移动的作用。此外，起到构成诸如呼吸器官或耳轮等需要弹性或者诸如软肋骨、耻骨结缔软骨等需要抗压力的部位的骨组织的作用。
尤其，关节软骨由作为以分布于软骨基质和软骨基质之间的方式特殊分化的细胞软骨细胞组成。软骨细胞起到构成关节软骨并保持其的作用。软骨母细胞中发生细胞分裂，但一旦生长停止，软骨细胞就被困在称为热孔(lacuna)的小空间，在正常的环境下不再分裂。
因此，软骨一旦受损就很难再生。并且，软骨是无血管组织，不存在用于提供营养的血管，干细胞的迁移受到限制，组织的再生能力降低。因此，为了软骨的再生，正进行多种再生医学研究用于提高软骨的再生能力，如诱导软骨细胞的分化。为此，使用最多的技术是利用细胞的细胞治疗技术。然而，存在根据细胞株的种类增殖效率不同而可受到限制的缺点。为此，最近，已知从患者自行分离的成体干细胞如来源于脂肪细胞的干细胞或间充质干细胞(MSC)，在体外(in vitro)诱导分化成软骨细胞来使用于细胞治疗方法。
但是，即使在这种细胞治疗方法中，在体外培养早期软骨细胞及成体干细胞时会很快失去软骨细胞的特征，因此，移植体内后仍然存在持续使用有限的限制。并且，从成体干细胞分化软骨细胞的分化能力可通过成体干细胞的分离源所具有的病理学特征来改变其特征，因此，在适用于实际再生医学时具有许多变量的方面其副作用令人担忧。
为此，已经尝试使用人诱导多能干细胞(hiPSCs)作为组织再生医学的细胞治疗剂的研究。hiPSC具有可分化成多种系统的分化能力，其特征在于，能够用于组织再生医学而不受组织限制(非专利文献001)。因此，即使是从干细胞分化诱导时的分化能力低的组织，当使用hiPSC时也可期待较高的再生效果。
在用于从hiPSC诱导分化成软骨细胞而使用的生长因子中，最近，使用骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)或转化生长因子(transforming growth factor，TGF)等(非专利文献002)。已知骨形成蛋白本身主要在骨或软骨的形成中可起到主要作用，已知还对软骨细胞的生存及增殖产生影响。其中，据报告，骨形成蛋白2(human bonemorphogenetic protein 2)的缺乏可能抑制软骨内骨的发达(非专利文献003)。
已知TGFβ蛋白通过参与细胞的增殖、分化及凋亡等过程，在各种组织中用作调节骨组织的因子。据报告，TGFβ蛋白分为三种同型蛋白质，如TGFβ1、TGFβ2及TGFβ3，通过它们之间的作用可诱导软骨形成(非专利文献004、非专利文献005)。据报告，其中，尤其可利用TGFβ1或TGFβ3诱导软骨形成，其中，TGFβ3具有更高的分化能力(非专利文献006)。在诱导干细胞分化成所需组织细胞的过程中，使用干细胞重组人生长因子可能是一个重要因素。但是，这需要在分化过程中频繁添加生长因子，此时存在产生高费用的缺点。
为了克服这种缺点，已尝试在干细胞的分化过程中，在未向培养基中添加生长因子的状态下，通过基因传递诱导生长因子的过表达来诱导分化成所需组织细胞。关于向软骨细胞的分化，据报告，当在来源于滑膜(synovial)的间充质干细胞中将TGFβ1基因传递到病毒载体时，细胞的增殖增加且软骨分化速度可能加快(非专利文献007)。并且，当在小鼠间充质干细胞(MSC)及来源于脐带血的MSC中过表达SOX9时，向软骨细胞的分化增加(非专利文献008、非专利文献009)，II型胶原蛋白的表达也可增加(非专利文献010)。
关于用于这种细胞治疗的基因传递技术，非病毒性基因传递技术作为安全的方法备受瞩目。商业性的DNA载体治理包含来源于细菌的序列，因为可诱导对细菌性蛋白的免疫反应。为此，可使用小环载体，小环载体是指通过去除编码抗生素抗性基因、细菌性结构蛋白的基因及转录单位基因而具有相对小尺寸的载体。小环载体的优点在于，尺寸小且可避免免疫反应，并且其特征在于，在体外(in vitro)及体内(in vivo)能够以高水平表达外部基因，因此可在所有临床基因治疗研究中具有使用优势而备受瞩目(非专利文献011)。由此，可实现安全且有效的基因传递，当将基因修饰的干细胞适用于治疗时可增强治疗效果(非专利文献012)。
并且，在从干细胞诱导分化成软骨细胞的现有的方法中，通过形成来源于逆分化干细胞的拟胚体，由此通过诱导连续性的软骨细胞的分化的过程来诱导软骨细胞的分化。为了在此过程中提高分化效率，在明胶培养基培养拟胚体来获得拟胚体衍生的生长细胞(outgrowthcell，OG细胞)，对以此为单个细胞进行分化并获得分化的软骨细胞的方法进行了研究。然而，为了将从干细胞分化诱导的软骨细胞用作再生医学中的细胞治疗剂，需要进一步提高分化效率，因此，持续进行对更有效地制备软骨细胞的方法的开发的研究。
为此，本发明人开发研究从干细胞诱导分化成软骨细胞体(chondrogenicpellet)并将其有效地适用于软骨再生治疗的方法。其结果，首先制备表达作为生长因子的BMP2及TGFβ3的小环载体，当将其向干细胞转导并分化诱导成软骨细胞时，确认可有效分化成软骨细胞体。分化的软骨细胞可显著表达软骨细胞的标记基因，当移植于生物体时，确认在软骨缺损部位可显著性地示出软骨再生效果。
并且，通过培养iPSC来获得拟胚体，由此制备拟胚体衍生的生长细胞(outgrowthcell，OG细胞)后，通过离心分离将拟胚体衍生的生长细胞按尺寸进行分类时，可确认越是小尺寸的拟胚体衍生的生长细胞，向软骨细胞体的分化效果越高，从而完成了本发明。
并且，因此，需要一种可以用最小的细胞系覆盖人类的大部分的代替性系统。当使用于许多患者时，该代替性系统应具有低同种异体排斥风险。成功的器官及造血干细胞移植的历史巩固了HLA基因的重要性，这与个体的免疫独立性直接相关。2005年推荐用于减少需要从HLA-纯合的个体分离ESC并储存的细胞系。此储存系统仅需要与来自供体的一种HLA-A、-B及DRB1单倍型纯合的细胞。这三种基因子集对于减少HLA位置及排斥可能性是最重要的。此策略适用于iPSC储存的落实。
为此，本发明人使用天主教造血干细胞库的数据可最大限度地对覆盖韩国人(南韩)人口的纯合HLA-A、-B及DRB1类型进行分类。为了生产临床水平的iPSC，从供体获得CBMC和PBMC，并根据药品生产质量管理规范对其进行重新编程。基于此，本发明包括为了调查和临床而由韩国政府支持进行的韩国第一纯合iPS细胞系的报告。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献001：Kim Y，Rim YA，Yi H，Park N，Park SH，Ju JH；The GenerationofHuman Induced Pluripotent Stem Cells from Blood Cells；An EfficientProtocolUsing Serial Plating of Reprogrammed Cells by Centrifugation.StemCells Int 2016，2016；1329459.
非专利文献002：Nam Y，Rim YA，Jung SM，Ju JH；Cord blood cell-derivediPSCsas a new candidate for chondrogenic differentiation and cartilageregeneration.StemCell Res Ther 2017，8；16.
非专利文献003：Shu B，Zhang M，Xie R，Wang M，Jin H，Hou W，Tang D，HarrisSE，Mishina Y，O'Keefe RJ，et al；BMP2，but not BMP4，is crucial forchondrocyteproliferation and maturation during endochondral bonedevelopment.J Cell Sci 2011，124；3428-3440.
非专利文献004：Tuli R，Tuli S，Nandi S，Huang X，Manner PA，Hozack WJ，Danielson KG，Hall DJ，Tuan RS；Transforming growth factor-beta-mediatedchondrogenesis of human mesenchymal progenitor cells involves N-cadherin andmitogen-activated protein kinase and Wnt signaling cross-talk.JBiol Chem 2003，278；41227-41236.
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非专利文献007：Kim YI，Ryu JS，Yeo JE，Choi YJ，Kim YS，Ko K，Koh YG；Overexpression of TGF-beta1 enhances chondrogenic differentiation andproliferationof human synovium-derived stem cells.Biochem Biophys Res Commun2014，450；1593-1599.
非专利文献008：Tsuchiya H，Kitoh H，Sugiura F，Ishiguro N；Chondrogenesisenhanced by overexpression of sox9 gene in mouse bone marrow-derivedmesenchymal stem cells.Biochem Biophys Res Commun 2003，301；338-343.
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非专利文献011：Gill DR，Pringle IA，Hyde SC；Progress and prospects；thedesignand production of plasmid vectors.Gene Ther 2009，16；165-171.
非专利文献012：Bandara N，Gurusinghe S，Chen H，Chen S，Wang LX，Lim SY，Strappe P；Minicircle DNA-mediated endothelial nitric oxide synthase genetransferenhances angiogenic responses of bone marrow-derived mesenchymal stemcells.StemCell Res Ther 2016，7；48.
发明内容
技术问题
如上所述，软骨难以再生，因此需要有效的再生治疗方法。因此，本发明的目的在于，提供从干细胞分化诱导的软骨细胞及其制备方法。
并且，本发明的另一目的在于，提供包含上述分化诱导的软骨细胞作为有效成分的用于预防或治疗软骨缺损疾病的药学组合物的用途。
解决问题的方案
为了实现上述目的，作为第一技术方案，本发明提供通过下述步骤i)至步骤v)进行的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法：
步骤i)，通过培养逆分化干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)来形成(generation)拟胚体(embryoid body，EB)；
步骤ii)，通过在明胶涂层培养基中培养在上述步骤i)中形成的拟胚体来获得拟胚体衍生的生长细胞(outgrowth cell，OG)；
步骤iii)，将在上述步骤ii)中获得的拟胚体衍生的生长细胞转导于(transduction)包含用于编码BMP2的碱基序列的小环载体或包含用于编码TGFβ3的碱基序列的小环载体中的一种或两种之中；
步骤iv)，将在上述步骤iii)中转导的拟胚体衍生的生长细胞分化诱导成软骨细胞；以及
步骤v)，获得在上述步骤iv)中分化诱导的软骨细胞。
并且，本发明提供通过下述步骤i)至步骤vi)进行的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法：
步骤i)，通过培养逆分化干细胞来形成拟胚体；
步骤ii)，通过在明胶涂层培养基中培养在上述步骤i)中形成的拟胚体来获得拟胚体衍生的生长细胞；
步骤iii)，将在上述步骤ii)中获得的拟胚体衍生的生长细胞转导于包含用于编码BMP2的碱基序列的小环载体中；
步骤iv)，将在上述步骤ii)中获得的拟胚体衍生的生长细胞转导于包含用于编码TGFβ3的碱基序列的小环载体中；
步骤v)，将在上述步骤iii)中转导的拟胚体衍生的生长细胞以及在上述步骤iv)中转导的拟胚体衍生的生长细胞混合培养来分化诱导成软骨细胞；以及
步骤vi)，获得在上述步骤v)中分化诱导的软骨细胞。
在本发明优选的一实施例中，包含上述用于编码BMP2的碱基序列的小环载体可以为如下的非病毒性载体：(a)包含由CMV启动子、序列1的碱基序列组成的BMP2基因以及包含SV40聚腺苷酸化序列的基因表达盒；(b)包含位于上述(a)的基因表达盒外部的噬菌体λ的att附着序列；以及(c)不包含复制起始点及抗生素抗性基因。
在本发明再一优选的一实施例中，包含上述用于编码TGFβ3的碱基序列的小环载体可以为如下的非病毒性载体：(a)包含由CMV启动子、序列号为2的碱基序列组成的TGFβ3基因以及包含SV40聚腺苷酸化序列的基因表达盒；(b)包含位于上述(a)的基因表达盒的噬菌体λ的att附着序列；以及(c)不包含复制起始点及抗生素抗性基因。
并且，在本发明另一优选的一实施例中，从上述软骨细胞分化诱导的步骤是可在不包含重组生长因子的培养基中培养3天至30天来执行。
并且，作为第二技术方案，本发明提供包括下述步骤i)至步骤v)的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法：
步骤i)，通过培养逆分化干细胞(induced plurientent stem cells，iPSCs)来获得拟胚体；
步骤ii)通过附着培养在上述步骤i)中获得的拟胚体来获得拟胚体衍生的生长细胞(outgrowth cell，OG细胞)；
步骤iii)，将在上述步骤ii)中获得的拟胚体衍生的生长细胞离心分离来按尺寸分离细胞，并筛选小尺寸的细胞；
步骤iv)，将在上述步骤iii)中筛选的小尺寸的细胞分化诱导成软骨细胞；以及
步骤v)，获得在上述步骤iv)中分化诱导的软骨细胞。
在本发明优选的一实施例中，上述步骤i)的逆分化干细胞可以是通过重编程脐带血单核细胞(cord blood mononuclear cell)来获得的。
在本发明优选的一实施例中，上述步骤ii)的附着培养可以是在明胶涂层板培养细胞。
在本发明优选的一实施例中，上述步骤iii)的离心分离分及筛选可通过下述步骤a)至步骤c)来执行：
步骤a)，在300rpm至800rpm的条件下将包含拟胚体衍生的生长细胞的培养基离心分离3秒钟至10秒钟，并将沉淀的细胞分成大尺寸的细胞(heavy cell)；
步骤b)，在800rpm至1200rpm的条件下将上述步骤a)的离心分离后的上清液离心分离3秒钟至10秒钟，并将沉淀的细胞分成中间尺寸的细胞(medium cell)；以及
步骤c)，在1200rpm至2000rpm的条件下将上述步骤b)的离心分离后的上清液离心分离3秒钟至10秒钟，并将沉淀的细胞分成小尺寸的细胞(light cell)。
在本发明优选的一实施例中，上述步骤iv)的分化诱导可在包含人骨形成蛋白2(human bone morphogenetic protein 2)及TGFβ3(humantransforming growth factorbeta 3)的培养基中执行，其中可进一步添加IGF2抑制剂。
并且，作为本发明的第三技术方案，本发明提供包括下述步骤的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法：
步骤i)，从来源于脐带血单核细胞的逆分化干细胞(CBMC-hiPSC)形成并获得拟胚体；
步骤ii)，从上述步骤i)的拟胚体形成并获得拟胚体衍生的生长细胞；以及
步骤iii)，通过培养上述步骤ii)的拟胚体衍生的生长细胞来获得软骨细胞体。
在本发明优选的一实施例中，上述步骤i)的CBMC-hiPSC可通过重编程脐带血单核细胞来获得。
在本发明优选的再一实施例中，上述步骤ii)的拟胚体衍生的生长细胞可以是将拟胚体接种于明胶培养基来形成的。
在本发明优选的另一实施例中，可在每1cm2的上述明胶培养基接种50～70个拟胚体。
在本发明优选的还有一实施例中，上述步骤i)的来源于脐带血单核细胞的逆分化干细胞可以是HLA纯合体(homozygote)。
在本发明优选的又一实施例中，上述HLA纯合体的类型可以是韩国人的HLA纯合体的类型。
在本发明优选的又一实施例中，上述韩国人的HLA纯合体的类型可以为选自由HLA-A*33、HLA-B*44及HLA-DRB1*13组成的组中的一种。
并且，本发明提供通过上述方法制备的软骨细胞。
在本发明优选的一实施例中，上述用于分化软骨细胞的组合物可以为选自由ACAN、COL2A1、COMP及SOX9组成的组中的一种以上的基因表达增加的。
在本发明优选的再一实施例中，上述用于分化软骨细胞的组合物可以是COL1A1或COL10的基因表达水平低于COL2A1的基因表达水平的。
并且，本发明提供包含上述软骨细胞作为有效成分的用于预防或治疗软骨损伤疾病的药学组合物。
在本发明优选的一实施例中，上述软骨损伤疾病可以是退行性关节炎、类风湿性关节炎、骨折、足底筋膜炎、肱骨外科炎、钙化性肌腱炎、骨折的不愈合或创伤导致的关节损伤。
发明的效果
因此，本发明提供通过转导用于编码作为生长因子的BMP2及TGFβ3的小环载体的从逆分化干细胞(induced plurientent stem cells，iPSCs)分化的软骨细胞体(chondrogenic pellet)。上述软骨细胞体显著表达软骨细胞的标记基因，同时相对于添加重组生长因子的培养基中分化诱导的软骨细胞，能够以能高水平表达软骨细胞的标记基因。
并且，本发明提供将由iPSC制备的拟胚体衍生的生长细胞(outgrowth cell，OG细胞)以单个细胞单位进行分类后，通过离心分离按尺寸分类，其中，选择小尺寸的拟胚体衍生的生长细胞诱导分化成软骨细胞体(chondrogenic pellet)的软骨细胞的制备方法。当按本发明的方法筛选小尺寸的拟胚体衍生的生长细胞诱导分化成软骨细胞时，相对于来源于大尺寸的拟胚体衍生的生长细胞的软骨细胞体，软骨细胞标记的表达水平显著高，可形成组织学上稳定的软骨细胞体结构。
根据本发明的方法制备的软骨细胞体显著表达软骨细胞的标记基因，相对于在添加重组生长因子的培养基中分化诱导的软骨细胞，能够以更高水平表达软骨细胞的标记基因。
当将上述软骨细胞体移植于生物体内的软骨损伤部位时，可通过分化的软骨细胞来示出软骨的再生效果，与移植通过添加重组生长因子来分化诱导的软骨细胞的情况相比，其可具有更有效地软骨再生能力，可有用地用于软骨再生的工程治疗方法。
并且，根据本发明制备的软骨细胞体是从来源于CBMC的iPSC分化诱导的，上述软骨细胞体为HLA纯合体，适于软骨移植的类型的软骨细胞标记基因的表达水平高，因此可有用地使用于软骨相关疾病的预防、改善或治疗。
附图说明
图1为有关三个CBMC-hiPSC系特性的结果。
图1的(a)部分为生成的CBMC-hiPSC系形态学结果。
图1的(b)部分为示出用碱性磷酸酶染色CBMC-hiPSC的结果。
图1的(c)部分为在CBMC-hiPSC系中多能性标记的相对表达结果。
图1的(d)部分为示出生成的CBMC-hiPSC系的免疫荧光染色的图像结果。
图2利用CBMC-hiPSCs的软骨细胞体生成结果。
图2的(a)部分为软骨细胞体生成图形。
图2的(b)部分为CBMC-hiPSC的形态学结果。
图2的(c)部分为生成的拟胚体的形态学结果。
图2的(d)部分为来源于附着于明胶涂层培养皿的拟胚体的生长细胞的图像结果。
图2的(e)部分为示出软骨细胞体的图像的结果。
图3为以从CBMC-hiPSC生成的软骨细胞体的遗传特性，示出10天、20天及30天期间软骨细胞体中COL2A1、ACAN、COMP及SOX9的表达水平的结果(*，+p<0.05，**，++p<0.01，***，+++p<0.001)。
图4为来源于CBMC-hiPSC的软骨细胞体的组织学分析结果，示出在10天、20天及30天利用番红O(safranin O)、阿辛蓝(alcian blue)及甲苯胺蓝(toluidine blue)染色的细胞体图像的结果。
图5为来源于BMC-hiPSC的软骨细胞体的免疫组织学分析结果。
图5的(a)部分为示出利用对2型胶原蛋白及聚蛋白多糖(aggrecan)抗体染色的在各种时间点获得的细胞体的图像的结果。
图5的(b)部分为示出利用对1型胶原蛋白的抗体染色的细胞体图像的结果。
图6为输出对来源于CBMC-hiPSCs和MSCs的软骨细胞体的基因标记的额外分析结果(*，+p<0.05，**，++p<0.01，***，+++p<0.001)。
图6的(a)部分为在各种时间点示出作为纤维化软骨代表基因的COL1A1和作为肥大标记的COL10的表达水平的结果。
图6的(b)部分为在10天、20天及30天示出COL2A1及COL1A1的比例的结果。
图6的(c)部分为示出在第30天来源于BMSC及CBMC-hiPSC的软骨细胞体中ACAN、COMP、COL2A1、SOX9、COL1A1及COL10的相对表达的结果。
图7为示出在本发明的来源于CBMC的分化成iPSC的软骨细胞和基于现有技术的从来源于外周血细胞(peripheral blood cell，PBMC)的iPSC分化的软骨细胞中，作为软骨形成相关因子的ACAN及CLO2A1的表达水平的比较结果。
图8为确认药品生产质量管理规范(good manufacturing practice；GMP)级纯合人类白细胞抗原(HLA)诱导多能干细胞的结果。
图8的(A)部分为所有GMP级iPSC生成过程的示意图(筛选人类白细胞抗原(HLA)类型并将所选HLA类型的细胞转移至GMP设施后，在设施中将细胞重编程为iPSC，并通过多种分析法后建立细胞株用于表征)。
图8的(B)部分为生成的纯合IPSCs的免疫荧光法的染色结果。
图8的(C)部分为确认通过逆转录聚合酶链反应的多能性标记的结果。
图8的(D)部分为碱性磷酸酶染色图像及阳性iPSC(positive iPSC)集落的集落数量结果。
图8的(E)部分为生成的iPSC的正常核型结果。
图8的(F)部分为分化成3胚叶的iPSC的免疫荧光法染色结果。
图9a及图9b为示出用于编码本发明的人生长因子的小环载体的制备及确认。
图9a为示出用于BMP2及TGFβ3的表达的小环载体的制备过程的示意图。
图9b为确认包含BMP编码基因的小环载体(mcBAMP2)以及包含TGFβ3编码基因的小环载体(mcTGFβ3)的大小的结果。
图10为示出向HEK293T细胞转导(transduction)的mcBAMP2或mcTGFβ3的表达效率的确认。
图10的(a)部分为确认在HEK293T细胞中通过mcBAMP2或mcTGFβ3的转导的RFP(红色荧光蛋白)表达程度荧光显微镜照片。
图10的(b)部分为确认转导mcBAMP2或mcTGFβ3的细胞的比例的结果。
图10的(c)部分为在转导mcBAMP2或mcTGFβ3的HEK293T细胞中对BAMP2的相对表达水平进行比较的结果。
图10的(d)部分为在转导mcBAMP2或mcTGFβ3的HEK293T细胞中对TGFβ3的相对表达水平进行比较的结果。
图11为示出在本发明中从iPSC分化诱导的软骨细胞体。
图11的(a)部分为从iPSC向软骨细胞体分化诱导的过程的示意图。
图11的(b)部分至图11的(e)部分为示出在分化诱导过程中的iPSC集落(图11的(b)部分)、拟胚体(图11的(c)部分)、拟胚体附着培养于明胶容器的拟胚体衍生的生长细胞(图11的(d)部分)以及转导之前的拟胚体衍生的生长细胞(图11的(e)部分)的形态。
图11的(f)部分至图11的(h)部分为在转导有小环载体的拟胚体衍生的生长细胞中用于确认RFP表达的荧光显微镜照片。
图12为示出本发明的利用小环载体转导的拟胚体衍生的生长细胞中间充质干细胞相关因子的确认。
图12的(a)部分为示出利用小环载体转导的拟胚体衍生的生长细胞的比例。
图12的(b)部分至图12的(f)部分为确认利用小环载体转导的拟胚体衍生的生长细胞中间充质干细胞标记基因的表达水平的结果。
图12的(g)部分至图12的(i)部分为对利用小环载体转导的拟胚体衍生的生长细胞进行茜素红染色(图12的(g)部分)，油红O染色(图12的(h)部分)及阿辛蓝染色(图12的(i)部分)的结果。
图13为确认通过转导小环载体来分化诱导的软骨细胞体的特征的结果。
图13的(a)部分为转导mcBAMP2或mcTGFβ3后5天后的细胞形态。
图13的(b)部分至图13的(e)部分为确认转导mcBAMP2或mcTGFβ3后，开始分化诱导5天后(图13的(b)部分)、10天后(图13的(c)部分)，20天后(图13的(d)部分)及30天后(图13的(e)部分)的RFP表达水平的结果。GFP(绿色荧光蛋白)结果用于确认在三维培养的细胞体中自发荧光强度。
图14为示出确认通过转导小环载体来分化的软骨细胞体中的软骨细胞标记基因的表达水平的结果。
图15为确认通过转导本发明小环载体来分化的软骨细胞体的特征的结果。
图15的(a)部分至图15的(c)部分为对软骨细胞体进行阿辛蓝染色(图15的(a)部分)、番红O染色(图15的(b)部分)及甲苯胺蓝染色(图15的(c)部分)的结果。
图15的(d)部分及图15的(e)部分为确认在软骨细胞体中表达的胶原蛋白的生成程度的结果。
图16为确认通过小环载体转导来分化诱导的软骨细胞体的生物体内软骨再生能力的结果。
图16的(a)部分为示出用于确认生物体内软骨再生能力而向软骨缺损模型小鼠移植软骨细胞体的过程的示意图。
图16的(b)部分至图16的(d)部分为将通过小环载体转导来分化诱导的软骨细胞体移植4周后，利用阿辛蓝(图16的(b)部分)、甲苯胺蓝(图16的(c)部分)及番红O(图16的(d)部分)染色来确认缺损部位的结果。
图16的(e)部分为利用ICRS分数确认通过移植转导小环载体的软骨细胞来确认软骨再生程度的结果。
图17为简要从逆分化干细胞制备软骨细胞体的本发明的方法的示意图。
图18为示出按大小分离的拟胚体衍生的生长细胞中分化诱导标记的确认。
图18的(a)部分及图18的(b)部分为观察大尺寸的拟胚体衍生的生长细胞、中间尺寸的拟胚体衍生的生长细胞及小尺寸的拟胚体衍生的生长细胞的分离后及附着培养时的细胞形态的结果。
图18的(c)部分至图18的(e)部分为确认大尺寸的拟胚体衍生的生长细胞、中间尺寸的拟胚体衍生的生长细胞及小尺寸的拟胚体衍生的生长细胞中SOX9及COL10的基因表达水平的结果。
图18的(f)部分及图18的(g)部分为确认大尺寸的拟胚体衍生的生长细胞、中间尺寸的拟胚体衍生的生长细胞及小尺寸的拟胚体衍生的生长细胞中SOX9及COL10的蛋白表达水平的结果。
图19为示出来源于拟胚体衍生的生长细胞的软骨细胞体的特征的确认。
图19的(a)部分为示出将按大小分离的拟胚体衍生的生长细胞培养于软骨分化培养基并诱导分化的软骨细胞体的形态。
图19的(b)部分为获得上述软骨细胞体并通过组织学染色来确认软骨细胞体的骨形成性能的结果。
图20为确认按拟胚体衍生的生长细胞大小的软骨细胞体的标记表达水平的差异的结果。
图21为在处理作为确认IGF2抑制剂的克罗美塞丁(chromeceptin)的环境下，培养细胞大尺寸的拟胚体衍生的生长细胞后的拟胚体衍生的生长细胞增殖程度的结果。
图22为通过处理克罗美塞丁(chromeceptin)来从细胞大尺寸的拟胚体衍生的生长细胞诱导分化成软骨细胞体时，确认基于此的软骨分化标记的表达水平的结果。
图23为确认IGF2抑制剂处理培养基中分化诱导的软骨细胞体的软骨细胞标记的结果。此时，使用于实验的拟胚体衍生的生长细胞是通过离心分离的大尺寸的细胞，作为正常对照组使用了在未处理克罗美塞丁(chromeceptin)的环境下诱导分化成软骨细胞体的试样。
图23的(a)部分为示出通过处理2mM的克罗美塞丁(chromeceptin)来诱导分化的软骨细胞体的形态。
图23的(b)部分为确认在由此分化的软骨细胞体中COL2A1及SOX9的基因表达水平的结果。
具体实施方式
最佳实施方式
以下，详细说明本发明。
在再生医学领域中，通过细胞治疗技术诱导软骨细胞的分化的技术广泛用于软骨再生，但是，根据移植于体内的软骨细胞所具有的分化能力及组织形成能力的特征，治疗效果可能不同。为此，需要用于诱导来源于逆分化干细胞的软骨细胞的分化技术，并且为了改善分化效率及分化的软骨细胞的组织形成能力的目的的研究仍在继续。
因此，本发明提供通过下述步骤i)至步骤v)进行的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法：
步骤i)，通过培养逆分化干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)来形成(generation)拟胚体；
步骤ii)，通过在明胶涂层培养基中培养在上述步骤i)中形成的拟胚体来获得拟胚体衍生的生长细胞(outgrowth cell，OG)；
步骤iii)，将在上述步骤ii)中获得的拟胚体衍生的生长细胞转导于(transduction)包含用于编码BMP2的碱基序列的小环载体或包含用于编码TGFβ3的碱基序列的小环载体中的一种或两种之中；
步骤iv)，将在上述步骤iii)中转导的拟胚体衍生的生长细胞分化诱导成软骨细胞；以及
步骤v)，获得在上述步骤iv)中分化诱导的软骨细胞。
并且，本发明提供通过下述步骤i)至步骤vi)进行的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法：
步骤i)，通过培养iPSC来形成拟胚体；
步骤ii)，通过在明胶涂层培养基中培养在上述步骤i)中形成的拟胚体来获得拟胚体衍生的生长细胞；
步骤iii)，将在上述步骤ii)中获得的拟胚体衍生的生长细胞转导于包含用于编码BMP2的碱基序列的小环载体中；
步骤iv)，将在上述步骤ii)中获得的拟胚体衍生的生长细胞转导于包含用于编码TGFβ3的碱基序列的小环载体中；
步骤v)，将在上述步骤iii)中转导的拟胚体衍生的生长细胞以及在上述步骤iv)中转导的拟胚体衍生的生长细胞混合培养来分化诱导成软骨细胞；以及
步骤vi)，获得在上述步骤v)中分化诱导的软骨细胞。
并且，本发明提供通过上述方法制备的软骨细胞体。
在本发明的软骨细胞的制备方法中，上述步骤i)的iPSC可以是从来源于患者的细胞诱导的，使用市售的也无妨。但是，在将本发明的软骨细胞移植于软骨缺损部位时，在增加生物相容性的过程中，更优选地，上述iPSC从来源于患者的细胞诱导。
在本发明的软骨细胞的制备方法中，优选地，在上述步骤ii)中获得的拟胚体衍生的生长细胞通过以单个细胞单元分离来获得，但并不限定于此。为了以单个细胞单元获得，可通过细胞过滤器等来分离拟胚体，优选地，在本发明的制备方法中获得的单个细胞的拟胚体衍生的生长细胞与间充质干细胞具有形态类似的纤维状。
在本发明的软骨细胞的制备方法中，利用小环载体转导的拟胚体衍生的生长细胞在软骨分化培养基中培养3天至30天，优选地诱导分化成软骨细胞体。具体地，更优选地上述分化诱导是培养5天至20天，但并不限定于此。在上述分化诱导中，优选地，在软骨分化培养基中不需要额外添加重组生长因子。
因此，在本发明中提供的通过转导用于编码生长因子BMP2及TGFβ3的小环载体来从逆分化干细胞(iPSC)分化的软骨细胞体显著表达软骨细胞的标记基因，同时与添加重组生长因子的培养基中分化诱导的软骨细胞相比，能够以更高水平表达软骨细胞的标记基因。
将上述软骨细胞体移植于生物体内的软骨损伤部位时，可通过分化的软骨细胞有效示出软骨的再生效果，这表明与移植通过添加重组生长因子来分化诱导的软骨细胞的情况相比，可具有有效的软骨再生效果，因此可有用地用于软骨再生的组织工程治疗方法中。
因此，本发明提供包括下述步骤i)至步骤v)的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法：
步骤i)，通过培养逆分化干细胞(induced plurientent stem cells，iPSCs)来获得拟胚体；
步骤ii)，通过附着培养在上述步骤i)中获得的拟胚体来获得拟胚体衍生的生长细胞(outgrowthcell，OG细胞)；
步骤iii)，通过离心分离在上述步骤ii)中获得的拟胚体衍生的生长细胞来按尺寸分离细胞，并筛选小尺寸的细胞；
步骤iv)，将在上述步骤iii)中筛选的小尺寸的细胞分化诱导成软骨细胞；以及
步骤v)，获得在上述步骤iv)中分化诱导的软骨细胞。
并且，本发明提供通过上述方法获得的软骨细胞。
并且，在本发明的软骨细胞的制备方法中，上述步骤iii)的“离心分离”是鉴于筛选细胞的小尺寸的拟胚体衍生的生长细胞(OG细胞)而进行的。为此，优选地，在上述步骤ii)中获得的拟胚体衍生的生长细胞使用通过去除细胞团来以单个细胞单位分离的细胞。像这样，当以单个细胞单位分离时，预计每个细胞可通过按大小显著分离。为了在以聚集形式培养的拟胚体形态中分离成单个细胞单位，可根据常规的方法进行分离，如使用细胞过滤器。
在本发明的软骨细胞的制备方法中，优选地上述步骤iii)的“离心分离”及“筛选”经下述步骤a)至步骤c)来进行。
步骤a)，在300rpm至800rpm的条件下将包含拟胚体衍生的生长细胞的培养基离心分离3秒钟至10秒钟，并将沉淀的细胞分成大尺寸的细胞(heavy cell)；
步骤b)，在800rpm至1200rpm的条件下将上述步骤a)的离心分离后的上清液离心分离3秒钟至10秒钟，并将沉淀的细胞分成中间尺寸的细胞(medium cell)；以及
步骤c)，在1200rpm至2000rpm的条件下将上述步骤b)步骤离心分离后的上清液离心分离3秒钟至10秒钟，并将沉淀的细胞分成小尺寸的细胞(light cell)。
具体地，作为上述“离心分离”的条件，优选为在步骤a)中在500rpm的条件下进行5秒钟，优选为在步骤b)中在1100rpm的条件下进行5秒钟，更优选地为在步骤c)中在1500rpm的条件下进行5秒钟，但并不限定于此。在本发明的方法中，鉴于通过筛选细胞小尺寸的拟胚体衍生的生长细胞来诱导分化成软骨细胞，省略上述步骤a)，仅执行步骤b)后，可改为利用离心分离后的上清液并通过上述步骤c)分离成小尺寸的细胞的步骤，但并不限定于此，本发明的方法可应用任何方法，只要是可理解为可通过本领域的普通技术人员仅筛选细胞小尺寸的细胞的范围的方法即可。
在本发明的方法中，上述步骤i)的“逆分化干细胞”可以是从来源于患者的细胞诱导的，使用市售的也无妨。但是，在将本发明的软骨细胞移植于软骨缺损部位时，鉴于增加生物相容性，更优选地，上述iPSC使用从来源于患者的细胞诱导的。具体地，最优选地，上述iPSC使用通过重编程患者的脐带血单核细胞(cord blood mononuclear cell)来获得的，但并不限定于此。
在本发明的方法中，上述步骤ii)的“附着培养”可以是在明胶涂层板培养细胞。
在本发明的方法中，优选地，上述步骤iv)的“分化诱导”可在包含人骨形成蛋白2(human bone morphogenetic protein 2)及转化生长因子β3(humantransforming growthfactor beta 3)的培养基中进行，但并不限定于此，可以选择性地添加或减少公知为可从干细胞诱导分化成软骨细胞的因子的分化诱导因子。并且，上述培养基可进一步包含IGF2抑制剂，代表性地，上述IGF2抑制剂可列举克罗美塞丁(chromeceptin)。
在通过本发明的方法按大小筛选小尺寸的拟胚体衍生的生长细胞并诱导分化成软骨细胞时，相对于来源于大尺寸的细胞的软骨细胞体，不仅软骨细胞标记的表达水平显著高，而且可形成组织学上稳定的软骨细胞体结构。因此，相对于现有的方法，根据本发明的方法仅筛选小尺寸的细胞并诱导分化及制备软骨细胞的方法，不仅从干细胞诱导分化成软骨细胞的分化效率得以改善，而且分化的软骨细胞的质量可得以提高，在再生医学中可有用地用于软骨损伤疾病的治疗中。
并且，本发明提供通过本发明的方法制备的软骨细胞。
并且，本发明提供包含上述软骨细胞作为有效成分的用于预防或治疗软骨损伤疾病的药学组合物。
在本发明的药学组合物中，优选地，上述软骨损伤疾病为选自由退行性关节炎、类风湿性关节炎、骨折、足底筋膜炎、肱骨外科炎、钙化性肌腱炎、骨折的不愈合及创伤导致的关节损伤组成的组中的一种以上，但并不限定于此，是可由软骨的缺损或损伤引起的软骨部位的疾病，只要是公知于本领域的疾病，即可不受限制地对应于此。
在本发明的组合物的治疗上有效的量可根据各种因素而不同，例如，给药方法、受试部位、患者的状态等。因此，当使用于人体时，给药量应同时考虑安全性和效率性来确定适当量。可以从通过动物实验确定的有效量估计使用于人类的量。确定有效量时需要考虑的事项，例如，记载于Hardman and Limbird，eds.，Goodman and Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics，10th ed.(2001)，Pergamon Press；及E.W.Martin ed.，Remington's PharmaceuticalSciences，18th ed.(1990)，MackPublishing Co.中。
本发明的组合物还可包含通常使用于生物制剂的载体、稀释剂、赋形剂或它们的两种以上的组合。在药剂学上可接受的载体不受特别限制，只要该组合物适合于体内传递即可，例如，可使用记载于Merck Index，13th ed.，Merck&Co.Inc.的化合物、食盐水、灭菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇及混合这些成分中的一种以上成分，根据需要可添加常规的添加剂，如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂。进一步地，可利用本领域的适当方法或者记载于Remington's Pharmaceutical Science (MackPublishing Company，Easton PA，18th，1990)的方法，根据各疾病或根据成分来优选地制剂化。
本发明的具体实施方式
以下，通过实施例进一步详细说明本发明。
对于本领域的普通技术人员而言，这些实施例仅用于例示本发明，而不应解释成本发明的范围限定于这些实施例，这是显而易见的。
实验方法
以下，将描述针对本发明的实施例执行的具体实验方法。以下实验方法是用于实施本发明实施例的一些方法，可以由本领域普通技术人员选择性地改变。
1)CBMC的分离
CBMCs获自首尔圣母医院的脐带血库。利用磷酸缓冲盐水(PBS)稀释脐带血，并通过发克浓度梯度(Ficoll gradient)在850xg下离心分离30分钟。收集、清洗并冷冻干燥CBMC。在使用之前解冻冷冻CBMC，并重悬于补充有CC110细胞因子混合物(STEMCELL)的无血清培养基(StemSpan)(STEMCELL Technological，Vancouver，British Columbia，Canada)中。在重编程之前，在5％的CO2、37℃的温度的条件下将细胞保持5天。
2)血液样品及道德规范
首尔圣母医院天主教大学的机构审查委员会(The institutional ReviewBoard(IRB)of the Catholic University of Korea)承认了本研究。
3)利用仙台病毒(sendai virus)的重编程(reprogramming)
重编程(reprogramming)是指在哺乳动物发育过程表观遗传标记(epigeneticmarks)发生变化的过程。通常，逆分化干细胞重编程是指在体细胞人工过表达对重编程所需的因子来诱导多能干细胞的技术。上述过表达基因的方法有病毒、质粒载体、mRNA、蛋白质等。
将CBMC以3×105的浓度涂抹(seeding)于24-孔板(well plate)。使用CytoTune-iPS仙台重新编程试剂盒诱导重编程。感染以每3×105细胞感染单位7.5的多重感染进行。添加病毒成分后，将细胞在1160xg、35℃的温度的条件下离心分离30分钟后，在5％的CO2、37℃的温度的条件下培养。第二天，将细胞转移到利用玻连蛋白(vitronectin；LifeTechnologies)涂敷的12-孔板并在1160xg、35℃的温度的条件下离心分离1分钟来使其沉淀。离心分离后，以1：1的比例添加TeSR-E8培养基(STEMCELL)。重编程的细胞在TeSR-E8培养基中维持和扩增，每天更换培养基。
4)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)的染色
为了在染色之前获取足够大的集落，以2×103的浓度接种于涂敷玻连蛋白的6孔板(well plate)中，并膨胀5天至7天。未分化iPSC集落的染色使用碱性磷酸酶检测试剂盒(alkaline phosphatase detectionkit；Millipore，Billerica，MA，USA)进行。利用包含0.05％的吐温20(Tween-20)的PBS清洗细胞，并利用4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)固定2分钟。以2：1：1的比例混合固红紫(Fast Red Violet)、萘酚AS-BI磷酸盐缓冲液(Naphthol AS-BI phosphate solution)及水来制备染色试剂。利用PBST清洗细胞2次。在室温(RT)下将染色溶液混合物处理15分钟。温育后，利用PBST清洗细胞，并用PBS覆盖以防止干燥。利用显微镜测定染色的集落。
5)免疫细胞化学染色
为了在染色之前获取足够大的iPSC集落，以2×103的浓度接种于涂敷玻连蛋白的6孔板中。为了每天诱导iPSC集落，将培养基的细胞扩增5～7天。扩增后，利用PBS清洗iPSCs，并利用4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)固定。使用0.1％的tritonX-100(BIOSESANG)将细胞穿透10分钟。浸润后，使用含2％的牛血清白蛋白(BSA；Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA)的PBS(PBA)在室温下封闭细胞30分钟。将一抗以下列稀释率稀释于PBA；OCT4(1/100；Santa Cruz，CA，USA)，KLF4(1/250；Abcam，Cambridge，UK)，SOX2(1/100；BioLegend，San Diego，CA，USA)，TRA-1-60(1/100；Millipore)，TRA-1-81(1/100；Millipore)及SSEA4(1/200；Millipore)。将一抗在室温下培养2小时。使用PBA稀释AlexaFluor 594-(1/400；Life Technologies)及488-缀合二抗(1/400；Life Technologies)，在避光室温下培养1小时。清洗细胞并使用ProLong Antifade封固试剂(Thermo FisherScientific，Waltham，MA，USA)进行封固。利用免疫荧光显微镜检测染色的集落。
6)利用CBMC-iPSC试样的聚合酶(polymerase)链式连锁反应
获得5×105的iPSCs，并在-20℃的温度下冷冻干燥。使用Trizol(LifeTechnologies)提取总mRNA(Total mRNA)，并使用Revert Aid TM First StrandcDNA SynthesisKit(Thermo Fisher Scientific)合成cDNA。利用合成的cDNA进行逆转录酶聚合反应。引物序列如下述表1所示。
表1
用于实时RT-PCR的潜在标记的引物序列
7)核型分析(Karyotyping)
将细胞培养至80％左右。向各孔中添加染色体分辨率添加剂(Genial GeneticSolutions，Runcorn，UK)。培养后将处理30分钟。获得细胞，并利用预热的储存液进行处理。并利用以1：3的比例混合乙酸和甲醇溶液的混合物固定。为了使用胰蛋白酶吉姆萨显带法(trypsin-Giemsa banding technique)的染色体分析而准备滑片。
8)按iPSC的功能的识别(Functional identification of iPSCs)
购买人的多能干细胞功能确认试剂盒(R&D，Minneapolis，MN，USA)，对3个胚叶的分化能力进行评价。在实验前一天，将Cultrex Path Clear BME(R&D)按照制造商的指示涂敷于培养皿中。在各拟胚体层准备特异性培养基，并单独培养细胞。分化后，使用PBS清洗细胞，并利用4％的多聚甲醛固定。0.3％的Triton X-100及1％的PBA渗透并封闭45分钟。稀释针对Otx2(1/10，外胚叶)、Brachyury(1/10中胚叶)及Sox17(1/10，内胚叶)的抗体。悬浮于PBA并在室温下培养3小时。
清洗一抗后，用PBA稀释Alexa Fluor 568驴抗氯二抗(1；200；R&D)，并培养1小时。使用PBA清洗细胞，在室温下将DAPI溶液处理10分钟。清洗细胞并用PBS覆盖。使用荧光显微镜确认染色结果。
9)来源于拟胚体生长细胞诱导(EB-derived outgrowth cell induction)
扩增CBMC-hiPSC并制备2×106细胞。将细胞重悬于Aggrewell培养基(STEMCELL)，并涂抹在100mm的培养皿。在5％的CO2、37℃的温度的条件下将细胞培养1天。第二天，将培养基换为TeSR-E8培养基，膨胀细胞并保持6天。膨胀过程后获得拟胚体，重悬于含20％的胎牛血清白蛋白(FBS)的DMEM，放置于明胶涂层的培养皿并诱导生长细胞。在软骨分化之前，在5％的CO2、37℃的温度的条件下保持细胞1周。
10)利用来源于拟胚体生长细胞的软骨分化(Chondrogenic differentiationusingEB-derived outgrowth cells)
清洗来源于拟胚体的生长细胞并从培养皿中分离。通过40μm的细胞过滤器(Thermo Fisher Scientific)来去除细胞团。计数单个生长细胞，并且每个细胞体制备3×105个细胞。将3×105个生长细胞在软骨分化培养基(DMEM，20％的敲除血清替代品(knockout serum replacement)、1×非必需氨基酸(non-essential amino acids)、1mM的L-谷氨酰胺(L-glutamine)、1％的丙酮酸钠(sodium pyruvate)、1％的ITS+预混物(ITS+Premix)、10-7M的地塞米松(dexamethasone)、50μm的抗坏血酸(ascorbic acid)、40μg/mL的L-脯氨酸(L-proline)，补充50ng/mL的人骨形成蛋白2(supplemented with 50ng/mLhuman bone morphogenetic protein 2)及10ng/mL的人转化生长因子β3(humantransforming growth factor beta 3))中培养，并转移至锥形管(conical tube)。在750xg的条件下将细胞离心分离5分钟。将生成的细胞体保持30天，并每天更换培养液。BMSC用作阳性对照组。
11)软骨形成细胞体的组织学分析
将细胞体在室温下利用4％的多聚甲醛固定2小时。将一层纱布置于盒并将细胞体转移到纱布。依次用乙醇溶液进行脱水。利用划分等级的乙醇和二甲苯(zylene，韩国安山DUKSAN纯化学)混合物去除脱水溶液并将石蜡渗透过夜。第二天，将细胞体固定于石蜡块，利用切片机获得7μm的切片。将滑片在60℃的温度下干燥2小时。用2个循环的二甲苯(zylene)对切片进行脱蜡。用依次减少的乙醇系列再次水化切片，并用自来水清洗5分钟。
将切片在1％的阿辛蓝溶液中培养30分钟以用于阿辛蓝(alcian blue)染色。随后，清洗滑片，用核固红(nuclearfast red)进行对照染色1分钟。番红O(Safranin O)染色以在魏格特氏铁苏木精(weigert's iron hematoxylin)中培养滑片10分钟的方式进行。清洗滑片，并在0.1％的番红(Safranin O)溶液中培养5分钟。
将切片在甲苯胺蓝溶液中培养4分钟以用于甲苯胺染色。经染色工序后，清洗切片，并使其通过依次增加的乙醇系列。2个循环的二甲苯去除乙醇，使用VectaMountTMPermanentMountingMedium(VectorLaboratories)固定滑片。利用显微镜确认染色。
12)免疫组织化学
将切片在60℃的温度下干燥2小时，并利用2个循环的二甲苯进行脱蜡。用依次减少的乙醇系列再次水化切片，并用自来水清洗5分钟。将抗原暴露(unmasking)在柠檬酸盐缓冲液中培养15分钟并冷却20分钟来诱导。将冷却切片利用脱离子水(DW)清洗2次。通过将切片在利用DW稀释的3％的过氧化氢中培养10分钟来阻断内源性过氧化物酶的活性。将切利用DW清洗1次后，并使用含0.1％的吐温20(TBST)的Tris缓冲盐水(TBS)进行进一步清洗。将切片在室温下利用含1％的BSA的TBS封闭20分钟。将利用封闭溶液稀释的一抗加入切片并在4℃的温度下培养过夜。以如下比例稀释一抗：1型胶原蛋白(1/100，Abcam)、2型胶原蛋白(1/100，Abcam)及聚蛋白多糖(1/100，GeneTex，Irvine，CA，USA)。用无抗体的相同的量的封闭溶液处理阴性对照组滑片。第二天，将切片在TBST中分别清洗3次，每次3分钟，并将二抗(1/200)在室温下培养40分钟。利用TBST及ABC试剂清洗切片并培养30分钟。利用TBST将滑片清洗3次，并应用DAB溶液(Vector Laboratories)1分钟。用DW清洗切片至洗去颜色。将梅尔氏苏木精(Mayer's hematoxylin)应用于切片1分钟以进行反染色。清洗切片并使其通过依次增加的乙醇系列。利用2个循环的二甲苯去除乙醇，使用VectaMountTM PermanentMounting Medium(Vector Laboratories)固定滑片。利用明视野显微镜确认染色。
13)软骨形成细胞体的聚合酶(Polymerase)反应
在各个时间点获得10个软骨细胞体并冷冻干燥于-80℃的温度下。利用液氮快速冷冻样品并用小瓷杵进行粉碎。将基础细胞体样品与Trizol一起培养用于mRNA提取。由提取的mRNA合成cDNA，利用对连锁细胞特异性标记的引物进行聚合酶链式反应。RT-PCR的引物序列如表2所示。实时聚合酶链式反应的引物序列如下述表3所示。通过3次实验(triplicate experiments)获得的平均循环的阈值用于计算基因表达以平均GAPDH作为内部对照。
表2
为了软骨性标记地扩增的使用于RT-PCR反应的引物序列
表3
为了软骨性标记的扩增使用于实时PCR反应的引物序列
实施例1.利用分离的CBMC的人诱导多能干细胞的生成
使用包含Yamanaka因子的仙台病毒促进了CBMC的重编程。Yamanaka因子是可诱导多分化能的基因。转导一段时间后，CBMC-hiPSC形成与拟胚体干细胞类似的集落(图1的(a)部分)。利用具有相同细胞形态的细胞系纯化CBMC-hiPSC。相同的CBMC-hiPSC用于额外的特征分析。确定的CBMC-hiPSC利用碱性磷酸盐进行染色(图1的(b)部分)。还测定包含OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、KLF4及c-MYC的多分化能标记(图1的(c)部分)。母体CBMC用作阴性对照组。OCT4、SOX2、NANOG、LIN28的表达在CBMC-hiPSC中增加。但是，在CBMC-hiPSC中KLF4和c-MYC的表达少于CBMC。典型的细胞表面标记(SSEA4、OCT4、SOX2、KLF4、TRA-1-80及TRA-1-60)通过免疫化学分析确认(图1的(d)部分)。分化的所有细胞系都表达了成为多分化能标准的标记。确认CBMC-hiPSC经重编程过程后，还保持正常核型切还分化成多种胚叶细胞。这些数据意味着CBMC-hiPSC成功生成并具有多分化能。
实施例2.分化成CBMC-iPSCs的软骨细胞
为了确认CBMC-iPSC的软骨再生能力，通过培养拟胚体及诱导生长细胞来进行了软骨分化。软骨分化细胞体生成过程的简单计划如图2的(a)部分所示。准备了CBMC-iPSCs集落以用于软骨分化(图2的(b)部分)。CBMC-iPSCs扩增并聚集成拟胚体(图2的(c)部分)。将拟胚体扩张数天后转移到明胶涂层培养皿中诱导成生长细胞(图2的(d)部分)。扩增生长细胞并分离成单个细胞用于软骨细胞分化。利用2×106的iPSc获得许多软骨细胞体。在分化30天后，使用拟胚体生长细胞形成软骨细胞体。生成的软骨形成颗粒呈三维椭圆形状。通过上述内容，CBMC-hiPSCs可分化成软骨细胞，确认可通过ECM集聚来形成软骨形状。
实施例3.确认软骨形成细胞体的软骨基因表达
通过之前的过程，从CBMC-hiPSC成功地生成了软骨形成细胞体。并且，分化的细胞合成ECM成分，并具有软骨样特征。ECM构成蛋白质如聚蛋白多糖(ACAN)、2型胶原蛋白(COL2A1)及软骨低聚物基质蛋白(COMP)的表达分别在10天、20天及30天进行确认。其结果确认ACAN、COL2A1及COMP的表达增加(图3)。已知性别决定区Y框蛋白9(Sex-determiningregion Y-box 9，Sox9)为调节早期软骨分化标记及ECM蛋白的基因表达的转录因子。在20天之后Sox9的表达增加。即，确认了生成的软骨细胞体的基因特性。对应于软骨样形态，确认了主要ECM成分蛋白的基因表达的增加。
实施例4.软骨形成细胞体的组织学特征
根据确认所增加的软骨形成标记表达，通过组织学分析对从CBMC-hiPSCs生成的软骨细胞体的蛋白水平进行评价(图4)。番红O、阿辛蓝(alcian blue)及甲苯胺蓝(toluidine blue)染色是用于在软骨中检测ECM而使用的染色方法。上述染色结果，确认在分化的早期阶段(第10天)，在细胞体的内部也观察到ECM的积累。骨穴(Lacunae)是关节软骨的主要特征之一。10天后观察到如空的骨穴的容量。但是，大小随分化的进行反而减小。在分化第30天，累积在ECM的容量，关节软骨(articularcartilage)中似乎看起来像骨穴。在第30天，几乎与染色的强度类似。
软骨的质量取决于ECM蛋白的主要类型。因此，确认特定蛋白很重要。已知聚蛋白多糖(aggrecan)及2型胶原蛋白为构成ECM的主成分。2型胶原蛋白是示出透明软骨的主要胶原蛋白类型。将针对于2型胶原蛋白及聚蛋白多糖的抗体染色在软骨分化细胞体中(图5的(a)部分)。相对于MSC对照组，2型胶原蛋白的染色强度更高于来源于CBMC-hiPSC的软骨细胞体。对应于之前的染色结果，聚蛋白多糖及2型胶原蛋白第30天时大部分在细胞体内部检测到。纤维软骨的主要特征在于，1型胶原蛋白的表达高。确认上述软骨细胞体不具有纤维软骨的优秀的特征(图5的(b)部分)。相对于MSC对照组的鼠，1型胶原蛋白的表达相对高。但是，表达保持一定水平，在分化期间没有显著增加。在CBMC-hiPSCs中生成的软骨细胞体的特征在于，分化30天后具有与来源于MSC的细胞体类似的质量。从CBMC-hiPSCs分化的软骨细胞可生产ECM成分蛋白质。来源于CBMC-hiPSC的软骨细胞体的2型胶原蛋白的表达高于1型胶原蛋白。总之，确认CBMC-hiPSCs可生成与透明软骨的特征类似的软骨样特征。
实施例5.来源于CBMC-hiPSCs及MSCs的软骨细胞体的基因标记分析
胶原蛋白是构成ECM的最丰富的的蛋白质。有许多不同类型的胶原蛋白，但是1型、2型及10型胶原蛋白主要与软骨相关。在之前的实验中，通过组织学分析确认1型胶原蛋白及2型胶原蛋白生物表达(图5的(a)部分及图5的(b)部分)。基于上述结果，分析1型胶原蛋白(COL1A1)基因的表达(图6的(a)部分)。还分析了作为从肥大软骨中表达的公知为显性蛋白的蛋白质的10型胶原蛋白(COL10)的基因表达。利用组织化学染色确认1型胶原蛋白的稳定表达。但是，COL1A1的表达在每个时间点下降。COL10的表达在分化过程不变。如上所述，2型胶原蛋白的比例可改变软骨细胞体的结果特性。使用以往的基因表达数据，评估COL2A1的基因对COL1A1表达比例(图6的(b)部分)。总增加率表示透明软骨基因对纤维软骨基因的表达高。利用实时PCR比较来源于CBMC-hiPSC的软骨细胞体与第30天在BMSC中生成的软骨细胞体(图6的(c)部分)。两个样品之间ACAN表达没有统计学意义。相对于源于BMSC的细胞体，COL2A1及SOX9的表达在从CBMC-hiPSC分化的软骨细胞体中显著高。但是，COMP在MSC控制细胞体中表达也更高。作为纤维性标记的COL1A1的表达在MSC控制细胞体中也更高。但是，来源于CBMC-hiPSC的软骨细胞体中肥大的标记COL10的表达显著低。这些结果强调CBMC-hiPSC作为未来应用中软骨再生的潜在细胞源的潜力。
实施例6.确认从来源于CBMC的iPSC分化的软骨细胞的分化能力增加效果
本发明人为了确认本发明的软骨细胞分化方法中可改善分化能力，通过使用来源于外周血细胞(PBMC)的iPSC和本发明的来源于CBMC的iPSC来诱导软骨细胞分化。分化后获得各个软骨细胞，由此确认与软骨形成相关的ACAN及COL2A1的表达水平。
其结果，如图7所示，确认相对于在来源于PMBC的软骨细胞，在来源于CBMC的软骨细胞中ACAN及AOL2A1的表达水平增加约6倍至10倍，由此确认本发明的来源于CBMC的软骨细胞中软骨生成效率增加。
实施例7.确认制备的iPSC是否为纯合体
为了确认制备的CMC-hiPSC是否为纯合体(homozygote)，针对于3个来源于CMC的iPSC的细胞株，分析Human Leukocyte Antigen(HLA)的等位基因型。其结果，如下述表4至表6所示，确认本发明的方法制备的CMC-hiPSC为纯合体。
由此，可通过利用本发明的CMC-iPSC并以chondro beads的形态使用分化的软骨细胞来制备软骨组织，可提高移植率。
表4
HLA检查(SBT)结果
表5
HLA检查(SBT)结果
表6
HLA检查(SBT)结果
为了生成iPSC，选择了可占韩国人的口比例最高的纯合体类型。但是，由于隐私保护法，韩国人的HLA类型被视为机密。为此，在这项研究中分析了存储在天主教造血干细胞库中的合法捐赠的CBMC的HLA类型信息。如下述表7所示，获得了前20位有关HLA类型的信息。HLA-A*33、HLA-B*44及HLA-DRB1*13占总CBMC库的约23.97％，是最常见的纯合体HLA类型。第二种最常见的类型是HLA-A*33、HLA-B*58、HLA-DRB1*13，记录了估计人口的11.16％。在前5位类型中HLA类型的适用范围小于5％。在3种HLA类型中，相对于其他2种类型，HLA-A相对集中。在所选的20种HLA类型中，25％具有*33的HLA-A类型，40％具有*02类型。
基于分类的HLA类型信息，在天主教造血干细胞库中选择9个纯合体细胞用于重组。而且，获得了四个具有纯合体HLA类型的PBMC样品作为礼物。如下述表8所示，13个细胞样品中的3个具有HLA-A*33、HLA-B*44及HLA-DRB1*13的HLA类型。将获得的细胞转移至天主教细胞治疗研究所的GMP设施进行重编程。在用Yamanaka因子(Yamanaka factors)处理后，分离出没有缺陷的样品并通过各种分析方法表征。基于细胞附着确定存活率。通过PCR和免疫荧光确认多功能性。通过碱性磷酸酶染色确认细胞的未分化状态。进行核型分析和短串联重复测定(short tandem repeat assay)以确认正常的遗传背景。最后，通过分化成每个胚胎层确认这些的多个转移，并进行感染测试。在此过程之后，只有通过所有质量控制测试的细胞会存储在GMP设施中(图8的(A)部分)。
在几次亚克隆程序后，所有细胞株都显示出适当形式的iPSC。纯合体HLA-iPSCs显示多能标记物的阳性表达(图8的(B)部分及8的(D)部分)。在传代培养期间所有细胞保持未分化(图8的(C)部分)。在细胞株中确认正常核型(图8的(E)部分)。并且，生成的细胞在试管中分化成3个所有胚胎层(图8的(F)部分及8的(G)部分)。图8中显示的数据代表CMC-hiPSC-001细胞株的数据。
纯合体HLA-iPSCs的生成为个性化再生医学的发展开辟了新的机会。通过减少所需的时间、金钱和人力，纯合HLA-iPSC可以治疗具有最少细胞供应源的许多患者。HLA型根据等位基因的频率，可以由iPSC资源库选择和保留候选HLA纯合细胞类型。但是，由于不常发现纯合体细胞，因此估计占人口中最大百分比的iPSC的最小或适当数量非常重要。
结果，我们通过代替性方法在韩国人群中确定了纯合HLA类型的频率。我们首次连接到天主教细胞治疗中心的HLA型CBMC库。通过CBMC库确认存在库中的23.9％的HLA-纯合CBMC具有HLA-A*33、HLA-B44及HLA-DRB1*13的表型。通过产生的数据筛选并获得纯合的单细胞，并将细胞重编程以获得iPSC。生产了HLA-A*33、HLA-B44和HLA-DRB1*13的3个纯合HLA-hiPSC。13个生产的HLA-iPSC系具有高的多分化能力和正常的核型，并通过了几次污染测试。这是韩国人在韩国政府支持下建立韩国人的纯合HLA-iPSC库的首次成就。纯合HLA-iPSC将为成功的再生医学和临床干细胞治疗开辟新的机会。
表7
表8
实施例8.制备用于编码人生长因子的小环载体
8-1.制备用于表达BMP2或TGFβ3的小环载体
在本发明中，为了诱导BMP2及TGFβ3的表达，通过如图9a所示的过程制备了小环载体。
具体地，人BMP2及TGFβ3基因是通过优化密码子并分别使用序列1和序列2的碱基序列合成了cDNA序列。将合成的cDNA序列作为空载体(mock vector)插入空质粒(CMV-MCS-EF1-RFP-SV40-PolyA；制造商；System Biosciences，Mountain View，CA，USA)。当插入时，将BMP2和/或TGFβ3序列插入存在于CMV启动子下游的多克隆位点(multiple cloningsite)内BamHI及XbaI之间的序列中，从而制备包含生长因子基因的亲本载体。将含有BMP2或TGFβ3的各个亲本载体(ppBMP2，ppTGFβ3)分别转化到ZYCY10P3S2T E.coli细胞。转化的细胞分离成单菌落单位，将其接种于2ml含有500μg/ml卡那霉素的LB培养基中，并30℃的温度下早期培养2小时。然后，将200ml的TB培养基(terrific broth，TB)加入1L培养瓶中，接种100μl早期培养的培养基并在30℃的温度下以30～200rpm振荡的同时培养15小时。培养后，向培养瓶中加入包含4％的1N的NaOH及20％的L-阿拉伯糖200μl的LB培养基200ml，以将亲本质粒转化为小圆载体。将添加培养基的培养瓶再次在30℃的温度与200rpm的条件下培养5小时。培养结束后，获得细胞并使用NucleoBond Xtra质粒纯化试剂盒(Macherey-Nagel，Duren，Germany)提取质粒DNA。用XbaI和BamHI双重切割提取的DNA，以确认制备的小环的大小和插入的BMP2或TGFβ3基因。将插入BMP2和TGFβ3的各个载体命名为mcBMP2及mcTGFβ3。为了制备阴性对照组，通过利用未插入BMP2及TGFβ3的母体质粒(ppMock)以与相同的方法制备小环载体(mcMock)。
其结果，如图9b所示，mcBMP2的大小为约7.3kb，当用限制酶双重切割时，确认以约1.1kb的BMP2基因和约5kb的小环的2个带示出。与此同时，mcTGFβ3的大小为约7.5kb，当用限制酶双重切割时，确认以约1.3kb的TGFβ3基因和约5kb的的小环的2个带示出。
8-2.确认mcBMP2及mcTGFβ3的转导(transduction)效率
为了确认mcBMP2及mcTGFβ3向细胞内转导时是否可以显著表达活性，测定了共存于mcBMP2及mcTGFβ3内的RFP的表达程度。
具体地，将上述实施例8-1中制备的mcBMP2或mcTGFβ3与各个脂质体(lipofectamine)在Opti-MEM培养基(Thermo Fisher Scientific)中混合20分钟。然后，将混合的DNA-脂质体混合物加入HEK293T细胞培养培养基中，并在37℃的温度、5％的CO2的培养箱中培养6小时。培养后，通过相差显微镜对细胞进行形态学(morphology)确认后，用荧光显微镜观察HEK293T细胞内RFP表达水平。并且，通过确认以培养细胞的培养基为对象通过bradford分析(bradford assay)确认蛋白质表达水平，来确定用mcBMP2或mcTGFβ3转化的HEK293T细胞中表达的蛋白质水平。为了定量分析，以1.0为基准相对比较重组BMP2蛋白(rhBMP2)或重组TGFβ3蛋白溶液的吸光度。
其结果，如图10所示，相对于用mcBMP2及mcTGFβ3转导的HEK293T细胞，在用mcMock转导的细胞中具有最高水平的RFP表达水平，显示mcMock的转导效率最高(图10的(a)部分及图10的(b)部分)。并且，当确认细胞培养基中表达的分泌蛋白的水平时，用mcBMP2转染的HEK293T细胞的上清液的吸光度具有显著高水平，确认具有约0.1mg/ml的表达水平(图10的(c)部分)。与此相比，mcTGFβ3的表达具有相对较低的水平，但是与mcMock的培养上清液相比，确认随着用mcTGFβ3转导可具有显著水平的蛋白质表达水平(图10的(d)部分)。
实施例9.诱导利用mcBMP2及mcTGFβ3的来源于人iPSC的软骨细胞分化
从来源于人iPSC(人诱导多能干细胞)分化成软骨细胞的方法，根据图11的(a)部分示出的示意图的过程来进行。对于相同的实验组所有实验重复三次。
步骤i)，iPSC准备步骤：从脐带血单核细胞(cord blood mononuclear cell，PBMC)获得iPSC的方法根据以往的逆分化诱导方法(非专利文献001)通过重编程(reprogramming)方法获得。将获得的iPSC在涂敷玻连蛋白(vitronectin)的容器(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA，USA)中培养，培养基使用E8培养基(STEMCELLTechnologies)，以每天更换一次为周期进行培养。准备的iPSC的形态如图11的(b)部分所示。
步骤ii)，从iPSC形成(generation)拟胚体的步骤：将准备的iPSC从容器底部分离(detach)并计数至2×106个细胞并接种在新平板上。培养基使用以1：1混合的TeSR-E8培养基及Aggrewell培养基(STEMCELL Technologies)。将接种于混合培养基的iPSC细胞在温度为37℃的5％的CO2培养箱中培养24小时。然后，去除培养基并更换新鲜的E8培养基来培养3天后，再次将培养基更换为E7培养基，通过进一步培养3天来获得拟胚体(图11的(c)部分)。
步骤iii)，从拟胚体诱导(induction)拟胚体衍生的生长细胞(outgrowth cell，OG细胞)的步骤：然后，将拟胚体转移到涂敷明胶的容器。为此，培养容器用0.1％的明胶涂敷容器底面30分钟并完全干燥。将获得的拟胚体悬浮于OG诱导培养基中。OG诱导培养基使用了包含20％的胎牛血清(FBS，Thermo Fisher Scientific)及10％的青霉素/链霉素(Thermo Fisher Scientific)的DMEM(ThermoFisher Scientific)培养基。以50拟胚体/cm2至70拟胚体/cm2的密度将拟胚体接种于明胶涂层容器中，并在温度为37℃的5％的CO2的培养箱中培养3天，从而培养诱导成向树枝一样突出的细胞(拟胚体衍生的生长细胞，outgrowth cell，OG细胞)。诱导的拟胚体衍生的生长细胞的细胞形态如图11的(d)部分所示。
步骤iv)，用小环载体转导拟胚体衍生的生长细胞的步骤：然后，分离拟胚体衍生的生长细胞并利用40μm的细胞过滤器(BDTechnologies，FranklinLakes，NJ，USA)去除剩下的拟胚体块(EB clump)来获得单个细胞单位的拟胚体衍生的生长细胞(图11的(e)部分)。拟胚体衍生的生长细胞具有与间充质干细胞类似的形态的纤维状形态。以1×104细胞/cm2至5×104细胞/cm2的密度将获得的拟胚体衍生的生长细胞再次接种于新的明胶涂层容器中，并向上述实施例8-1中制备的小环载体转导。在转导前一天，将培养基更换为部包含学清剂抗生素的DMEM培养基并培养过夜，然后使用脂质体2000试剂(Thermo FisherScientific)用mcMock、mcBMP2或mcTGFβ3转导。通过利用荧光显微镜确认细胞内RFP的表达水平，来确认转导小环载体的细胞是否转导(图11的(f)部分至图11的(h)部分)。在用mcMock转导的拟胚体衍生的生长细胞中具有高水平的RFP表达水平，与HEK293T细胞中的RFP表达模式类似，在用mcBMP2或mcTGFβ3转导的拟胚体衍生的生长细胞中RFP表达水平相对低于mcMock。
步骤v)，将用小环载体转导的拟胚体衍生的生长细胞分化诱导成软骨细胞体的步骤：将培养过夜转导的拟胚体衍生的生长细胞准备在在15ml锥形管中并在软骨分化培养基中培养，使每个细胞体具有3×105个细胞。软骨分化培养基(CDM)使用了包含20％的敲除血清替代物(knockout serum replacement)、1×必需氨基酸、1mM的L-谷氨酰胺、1％的丙酮酸钠(sodium pyruvate)、1％的ITS+预混物、10-7M的地塞米松、50mM的抗坏血酸及40μg/ml的L-脯氨酸的DMEM培养基的组成。向上述CDM中不添加BMP2及TGFβ3等重组生长因子。将拟胚体衍生的生长细胞悬浮于CDM培养基后，在750xg下离心分离5分钟来沉淀后，培养30天并分化成软骨细胞体。培养基以每隔3天进行更换。最终培养结束后，获得了分化的软骨细胞体。使用前获得的软骨细胞体冷冻保管于-80℃的温度下。
实施例10.利用小环载体分化诱导的细胞的特征分析
10-1.从iPSC诱导的拟胚体衍生的生长细胞的特征分析
为了确认通过从EB诱导(induction)拟胚体衍生的生长细胞的上述步骤iii)中培养的拟胚体衍生的生长细胞的特征，确认了间充质干细胞(MSC)标记的表达水平。
获得通过在上述实施例8的步骤iii)诱导的拟胚体衍生的生长细胞，悬浮于Trizol(Thermo Fisher Scientific公司)并破碎细胞，提取mRNA。以提取的mRNA为模板，利用RevertAidTM First Strand cDNA合成试剂盒(ThermoFisher Scientific)合成cDNA。再以合成的cDNA为模板对作为MSC标记基因的CD44、CD73、CD90、CD105及CD45进行PCR，确认各个基因的表达水平。针对于相同的基因通过重复3次来定量分析后，以相同细胞中GAPDH表达水平为基准，校正每个基因表达水平的值。与拟胚体衍生的生长细胞一起，以iPSC对象确认相同基因表达水平。
首先，当确认向拟胚体衍生的生长细胞中转导小环载体时的效率时，确认向拟胚体衍生的生长细胞中转导的小环载体的效率与HEK293T细胞类似(图12的(a)部分)。并且，确认MSC标记基因的表达的结果，在拟胚体衍生的生长细胞中CD44、CD73及CD105的表达水平显著，相对于MSC相对低，但是相对于人诱导多能干细胞细胞显著高(图12的(b)部分、图12的(c)部分及图12的(e)部分)。与此相比，确认CD90在拟胚体衍生的生长细胞中以相对高于MSC的水平表达(图12的(d)部分)。并且，在作为在MSC中以阴性表达的标记而公知的CD45的情况下，确认在MSC及拟胚体衍生的生长细胞中以低水平表达(图12的(f)部分)。
并且，同时还确认了MSC的分化可能性。已知MSC可分化成脂肪细胞、软骨细胞及骨架细胞三个系统。本发明人为了确认从iPSC诱导的拟胚体衍生的生长细胞系统分化能力，进行了茜素红(Alizarin red)染色、油红O染色(oil red O)及阿辛蓝(alcian blue)染色。
其结果，如图12的(g)部分至图12的(i)部分所示，确认拟胚体衍生的生长细胞可分化成软骨细胞系统(图12的(g)部分)，具有不仅可分化成脂肪细胞系统(图12的(h)部分)而且还可分化成软骨细胞体的多分化能力(图12的(i)部分)。
10-2.确认利用mcBMP2及mcTGFβ3分化诱导的细胞中生长因子蛋白质表达效率
为了确认在上述实施例8的步骤v)中分化诱导的软骨细胞体中小环载体的表达效率，确认在分化诱导过程的细胞中的RFP及GFP的表达。将转导mcBMP2的OG(mcBMP2-OG)及转导mcTGFβ3的OG(mcTGFβ3-OG)，以及以1：1的比例混合mcBMP2-OG及mcTGFβ3-OG接种于培养基(mcBOTH-OG)来共同培养，并分化诱导成软骨细胞。在软骨细胞分化培养基中开始分化诱导转导小环载体的拟胚体衍生的生长细胞后，在第5天、第10天、第20天及第30天通过离心分离沉淀细胞体，形成凝聚体后，确认凝聚体的细胞形态、细胞中RFP表达及GFP的表达水平。
其结果，如图13所示，首先，确认凝聚的细胞量mcTGFβ3-OG的量略低于其他实验组(图13的(a)部分)。从分化诱导开始后20天开始，与mcBMP2-OG和mcBOTH-OG相比，mcTGFβ3-OG的细胞凝聚体的大小增加，细胞的增殖速度显著高于其他实验组(图13的(d)部分)。
当确认RFP的表达水平时，所有实验组中，确认从分化诱导开始5天后起软骨细胞体中的RFP表达水平增加(图13的(b)部分)。随后，在第10天，确认继续保持凝聚的细胞的形态(图13的(c)部分)。在mcBMP2-OG、mcTGFβ3-OG及mcBOTH-OG的所有实验组中，RFP的表达直到分化诱导开始后20天为止趋于持续增加(图13的(d)部分)。从30天之后趋于减少(图13的(e)部分)。在转导mcMock的拟胚体衍生的生长细胞对照组(NA)的情况下，RFP表达在分化开始之后持续增加，并确认能保持到30天后。
10-3.确认利用mcBMP2及mcTGFβ3分化诱导的软骨细胞体的分化效率
随后，为了分析分化的软骨细胞体的特征，确认了作为软骨细胞中标记基因的SOX9、ACAN、COL2A1、COL1A1及COL10A1的表达水平。与此同时，通过确认作为骨形成标记的RUNX2的表达水平，确认软骨细胞体的软骨细胞体造骨形成能力。为了比较利用本发明的小环载体的分化效率和现有技术，在没有转导小环载体并均包含BMP2及TGFβ3的生长因子的培养基中分化诱导的软骨细胞的阳性对照组(Both rhGF)中也确认相同标记基因表达。
其结果，如图14所示，与人诱导多能干细胞、拟胚体衍生的生长细胞及mcMock转导拟胚体衍生的生长细胞的对照组相比，确认mcBMP2-OG、mcTGFβ3-OG及mcBOTH-OG的所有实验组中软骨细胞标记基因以高水平表达。确认作为在早期软骨细胞中表达的标记的SOX9在来源于转导小环载体的细胞的软骨细胞体中显著表达(图14的(a)部分)。在ACAN及COL10A1标记的情况下，确认绝对表达水平表示为低于SOX9的水平，与在作为阳性对照组的BothrhGF组相比，以高水平表达(图14的(d)部分及图14的(e)部分)。与此同时，COL2A1及COL1A1也在mcBMP2-OG、mcTGFβ3-OG及mcBOTH-OG中显著表达，相对于Both rhGF阳性对照组，确认以显著高的水平表达软骨细胞标记基因(图14的(c)部分及图14的(d)部分)。相反，确认作为骨形成标记的RUNX2表达水平低于添加重组生长因子的情况，并确认在mcBOTH-OG中以最低的水平表达。
与软骨细胞标记基因的表达一同，确认细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的积累水平。对于ECM积累确认，从mcBMP2-OG、mcTGFβ3-OG及mcBOTH-OG分化诱导的软骨细胞体通过阿辛蓝(alcian blue)、番红O(safranin O)及甲苯胺蓝(toluidine blue)染色来确认。
其实验步骤如下：首先用磷酸盐缓冲盐水(phosphate-buffered saline，PBS)清洗软骨细胞体细胞。将清洗的试样在室温下用4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)处理2小时并固定。固定后，使用乙醇溶液进行脱水，使用乙醇-二甲苯混合溶液再次清洗。将清洗的试样用石蜡包被过夜。固定所获得的石蜡块，利用切片机(microtome)以7μm的单位切割来制备试样块，在染色各个块之前，将切片块置于60℃的烘箱中至少10分钟以升高温度。切片块立即用二甲苯脱蜡，减少乙醇浓度并进行水化后，用流动的自来水擦拭1分钟。
为了阿辛蓝染色，将切片块浸泡在1％的阿辛蓝溶液(Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA)并在室温下培养30分钟。培养后，再用自来水清洗切片块，使用核固红溶液进行对比染色后，用显微镜观察试样。
为了番红O染色，利用Weigert's苏木精(Sigma Aldrich)溶液处理切片块并在室温下染色10分钟后，再用流动的自来水清洗10分钟。将清洗的块再用0.001％的固绿溶液(Sigma Aldrich)及0.1％的番红O溶液(Sigma Aldrich)分别染色5分钟后，用显微镜观察试样。
通过将脱水的切片块浸泡在0.04％的甲苯胺蓝溶液并培养10分钟来进行甲苯胺蓝染色。用流动的自来水清洗染色的切片块，直到完全干燥为止干燥10分钟。染色过程结束后，增加乙醇浓度并处理在切片块来脱水。经处理100％的二甲苯2次来去除乙醇，在VectaMountTM Permanent安装培养基(vector Laboratories，CA，USA)上安装后用显微镜观察。
同时，为了确认构成生成的ECM的胶原蛋白的种类，通过第一型胶原蛋白及第二型胶原蛋白染色，利用免疫化学染色确认软骨细胞体的胶原蛋白形成与否。在染色各块之前，将切片置于60℃的烘箱中至少10分钟以升高温度。每个切片块立即用二甲苯脱蜡，减少乙醇浓度并水化后，用流动的自来水擦拭1分钟。
然后，试样切片浸入沸腾的柠檬酸盐缓冲溶液(citrate buffer)中并再水化以暴露(unmasking)抗原蛋白。冷却抗原暴露结束的试样块后，用3％的光氧化氢溶液处理以封闭在组织中表达的过氧化酶的活性。然后，再次清洗试样块，用包含1％的BSA的TBS封闭。用封闭溶液稀释一抗来使用，将抗-1型胶原蛋白抗体(1/200稀释；Abcam)或抗-2型胶原蛋白抗体(1/100稀释；Abcam)处理于试样并在4℃的温度下培养过夜。第二天，用包含0.1％的吐温20的TBS清洗试样并处理二抗。在室温下将二抗(1/200稀释；vector Laboratories)处理40分钟后，清洗。清洗后，将ABC reagent drops(vector Laboratories)处理30分钟。然后，浸泡于DAB溶液中培养5分钟，处理Mayer's苏木精(Sigma Aldrich)1分钟来进行对比染色。安装进行对比染色的试样，并用明亮的光照显微镜观察。
其结果，如图15所示，确认在所有实验组中显著形成ECM，其中，来源于mcBMP2-OG的软骨细胞体中整体上示出均匀的ECM表达，相反，在来源于mcTGFβ3-OG的软骨细胞体中的部分领域中积累并表达ECM(图15的(a)部分至图15的(c)部分)。
作为在生物体内构成软骨的胶原蛋白可列举第一型胶原蛋白及第二型胶原蛋白。已知第一型胶原蛋白形成纤维状软骨，第二型胶原蛋白形成透明软骨(hyalinecartilage)。确认胶原蛋白的表达在所有实验组中显著表达，但确认在来源于mcBOTH-OG的软骨细胞体中第一型胶原蛋白及第二型胶原蛋白均已高水平示出(图15的(d)部分及图15的(e)部分)。由此，本发明人通过利用本发明的小环载体来诱导软骨细胞的分化的过程中，在与培养mcBMP2-OG及mcTGFβ3-OG来分化软骨细胞一起情况相比，预计可以有效诱导软骨细胞分化。
实施例11.确认通过小环载体转导分化诱导的软骨细胞体的生物体内软骨再生能力
为了确认通过本发明的方法分化诱导的软骨细胞体在实际生物体内中是否有效示出软骨再生能力，在软骨缺陷小鼠模型中通过移植从mcBOTH-OG分化诱导的软骨细胞体来确认再生效果。
首先，制备了具有软骨缺陷的模型小鼠(图16的(a)部分)。为此，将麻醉试验用鼠(Sprague-Dawley)并且对股骨远端(distal femur)的滑车槽(trochlear groove)的关节软骨(articular cartilage)进行微钻孔以诱导1.5mm×1.5mm×1.5mm的软骨缺损。然后，上述实施例8中分化诱导10天的软骨细胞体移植在软骨缺损部位。为了关节切开术(arthrotomy)，用尼龙线密封开放手术部位的皮肤。手术后给动物喂食足够的饲料和饮用水4周，4周后处死小鼠，并对软骨缺损部位进行组织免疫来进行观察。为了软骨再生效果，使用国际软骨再生学会(International Cartilage Repair Society，ICRS)中制定的康复分数来确认再生程度并对其进行比较。
其结果，如图16所示，通过阿辛蓝、甲苯胺蓝及番红O染色，确认在诱导软骨缺损的部位，诱导基于移植的软骨细胞的ECM形成。在4周时间内保持缺陷的对照组(defect only)和移植来源于mcMock-OG的软骨细胞的对照组中没有ECM积累，而空的空间增加。这表明，尽管移植mcMock-OG的细胞，由于没有生长因子，因此显著的软骨细胞分化没有进行，从而诱导细胞的凋亡。
与此相反，在移植来源于mcBOTH-OG的软骨细胞体的实验组中，软骨细胞密集在各种领域中，并通过分化诱导显著示出软骨再生效果，确认诱导了ECM积累(图16的(b)部分至图16的(d)部分)。并且，当确认组织学评分时，评分显著高于对照组，确认软骨再生效果有效进行(图16的(e)部分)。
实施例12.按细胞大小分离的软骨细胞分化的诱导
本发明人为了建立可制备细胞治疗剂级的软骨细胞的方法，建立了从逆分化干细胞(induced plurientent stem cells，iPSCs)生成拟胚体后，获得间充质样拟胚体衍生的生长细胞(outgrowthcells，OG细胞)，将通过离心分离按大小分离获得的拟胚体衍生的生长细胞分化诱导成软骨细胞的方法(图17)。
i)准备iPSC
首先，制备了来源于脐带血单核细胞(CBMC)的逆分化干细胞。此时所使用的的CBMC使用了从韩国首尔圣母医院的脐带血库获得的。利用磷酸缓冲盐食盐水稀释脐带血(PBS)，通过发克浓度梯度(Ficollgradient)在850xg下离心分离30分钟收集CBMC后，清洗及冷冻干燥并储存直至使用。在使用之前解冻CBMC后，并重悬于补充有CC110细胞因子混合物(STEMCELL)的无血清培养基(StemSpan)培养基(STEMCELLTechnological，Vancouver，British Columbia，Canada)中，在温度为37℃的5％的CO2的培养箱中培养5天。
然后，为了从CBMC制备iPSC，以3×105的浓度将CBMC接种于24孔板(well plate)，使用CytoTune-iPS仙台重新编程试剂盒并根据制造生提供的方案诱导重编程，获得了来源于CBMC的iPSC。
ii)从来源于CBMC的iPSC的拟胚体及拟胚体衍生的生长细胞(OG细胞)的诱导
将来源于CBMC的iPSC重悬于Aggrewell培养基(STEMCELL)，以2×106细胞/孔的浓度接种于100mm的培养板中。在37℃的培养箱中将接种的iPSC培养24小时，第二天，用TeSR-E8培养基更换培养基后，进一步培养6天来获得拟胚体。将获得的拟胚体悬浮于含有20％的胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，并在明胶涂层板上培养7天来诱导拟胚体衍生的生长细胞的形成。
iii)按拟胚体衍生的生长细胞的大小分离
从明胶涂层板分离形成的拟胚体衍生的生长细胞，使其通过40μm大小的细胞过滤器(Thermo Fisher Scientific)去除细胞块，以单个细胞单位分离。为了按大小再次分离已分离的细胞而进行了离心分离。首先，在500rpm下离心分离5秒钟，获得沉淀的细胞作为大尺寸的细胞(heavy cell)，在1100rpm下再次离心分离上清液5秒钟，获得沉淀的细胞作为中间尺寸的细胞(medium cell)。并且，在1500rpm下再次离心分离清液5秒钟，获得沉淀的细胞作为小尺寸的细胞(light cell)。
iv)从拟胚体衍生的生长细胞分化诱导成软骨细胞体
分别计数获得的上述大尺寸的细胞、中间尺寸的细胞及小尺寸的细胞，并以3×105个细胞/管的浓度接种于软骨分化培养基来培养。上述软骨分化培养基使用了包含20％的敲除血清替代品(knockout serumreplacement)、1×非必需氨基酸、1mM的L-谷氨酰胺、1％的丙酮酸钠、1％的ITS+预混料、10-7M的地塞米松、50μm的坏血酸、40μg/mL的L-脯氨酸、50ng/ml的人骨形成蛋白2(human bone morphogenetic protein 2)及10ng/ml的转化生长因子β3(human transforming growth factor beta 3)的DMEM培养基。在软骨分化培养基接种各个细胞后，在750xg下离心分离5分钟，沉淀细胞，每天更换一次新的培养基，在37℃的温度下共培养30天，最终获得已分化诱导的软骨细胞体。
实施例13.确认按大小分离的拟胚体衍生的生长细胞中分化诱导标记
为了确定软骨细胞的分化能力是否按大小分离的拟胚体衍生的生长细胞来区分，首先，通过离心分离确认按大小分离的拟胚体衍生的生长细胞的特征。
首先，利用显微镜观察上述实施例12的步骤iii)中获得各个大尺寸的拟胚体衍生的生长细胞、中间尺寸的拟胚体衍生的生长细胞及小尺寸的拟胚体衍生的生长细胞的细胞形态(cell morphology)，其结果，如图18的(a)部分及图18的(b)部分所示，确认按大小分离了细胞。
然后，各个细胞以5×105细胞根据试样相同的方式计数后，使用Trizol(LifeTechnologies公司)破碎各个细胞来提取mRNA，使用Revert Aid TM First Strand cDNA合成试剂盒(Thermo FisherScientific)根据制造商提供的方案以mRNA为模板合成cDNA。以合成的cDNA为模板，再使用记载于下述表9中的引物序列进行PCR反应，确认作为有助于分化诱导成软骨细胞的转录因子的SOX9及作为有助于细胞生长的肥大标记(hypertrophymarker)的COL10的mRNA表达水平。mRNA表达水平通过电泳确认后，为了定量分析，以GAPDH为基准分析细胞中SOX9及COL10A1的相对表达水平。
其结果，如图18的(c)部分至图18的(e)部分所示，在大尺寸的拟胚体衍生的生长细胞中SOX9的表达水平低且COL10的表达水平高，相反，在细胞小尺寸的拟胚体衍生的生长细胞中SOX9的表达水平相对高且没有COL10的表达。
表9
在分化诱导根据拟胚体衍生的生长细胞大小的软骨细胞的过程中，为了确认标记表达使用的引物目录及其序列
为了在蛋白质水平再次确认上述SOX9及COL10A1的表达，进行了荧光免疫分析。以相同的方式计数各个细胞后，用PBS清洗并用4％的多聚甲醛(paraformaldehyde)固定。将固定的细胞用0.1％的triton X-100处理10分钟，使其具有渗透力(permeability)后，通过沉淀获得细胞，处理在含有2％的牛血清白蛋白(BSA)的PBS(PBA)并在室温下封闭细胞30分钟。对封闭的细胞处理抗-SOX9抗体或抗-COL10抗体作为一抗后，在室温下反应2小时。然后，加入Alexa Fluor 594-抗体在暗室下诱导反应1小时。反应结束后，用PBA清洗细胞并用荧光显微镜观察染色的细胞。细胞的核型用DAPI染色。
其结果，如图18的(f)部分及图18的(g)部分所示，细胞大尺寸的拟胚体衍生的生长细胞中SOX9的表达水平低且COL10的表达水平高，相反，在小尺寸的拟胚体衍生的生长细胞中SOX9的表达水平相对高且没有COL10的表达，在mRNA表达水平下确认的结果，具有与在蛋白质水平下确认的结果一致的状态。
实施例14.确认来源于拟胚体衍生的生长细胞的软骨细胞体的特征
14-1.确认根据拟胚体衍生的生长细胞大小的软骨细胞体结构生成能力
在通过本发明的方法分化的软骨细胞体中，确认根据拟胚体衍生的生长细胞的大小示出分化程度差异。
具体地，以通过上述实施例12的步骤iv)中分化诱导来获得的软骨细胞体的集落为对象，利用4％的多聚甲醛在室温下固定2小时，并利用混合乙醇及二甲苯的溶液进行脱水。利用石蜡固定脱水的细胞体后，切割成7μm大小来制备了切片。以制备的切片为对象，进行甲苯胺蓝(toluidine blue)、番红O(safranin O)及阿辛蓝(alcian blue)染色，并用显微镜确认各个试样。
其结果，如图19所示，确认根据大小分离的拟胚体衍生的生长细胞随着诱导分化软骨细胞体的时间的流逝，集落的大小也不同(图19的(a)部分)。在分化诱导结束后，通过染色软骨细胞体并在组织学上确认时，从小尺寸的细胞分化诱导的软骨细胞体具有更稳定的结构(图19的(b)部分)。与此相反，从大尺寸的拟胚体衍生的生长细胞分化诱导的软骨细胞体的软骨组织结构松散，确认这与骨关节炎患者相似。
14-2.确认根据拟胚体衍生的生长细胞大小的软骨细胞体的标记表达水平差异
确认在通过本发明的方法分化的软骨细胞体中是否表达软骨细胞的标记基因，确认作为软骨分化促进标记的SOX5、SOX6及SOX9；作为胶原蛋白标记的COL2A1、COL1A1及COL10A10；作为细胞外基质蛋白质的ACAN、CHAD及PRG4；以及作为骨分化标记的RUNX2、OPN及BGLAP的基因表达水平状态。
具体地，通过上述实施例12的步骤iv)中分化诱导来获得软骨细胞体，利用液氮快速冷却后，利用小瓷杵粉碎。将Trisol加入到每个破碎的试样中来破碎并提取总mRNA。以提取的mRNA为模板合成cDNA，再次以cDNA为模板利用记载于上述表9中的引物序列进行PCR反应，根据分化的软骨细胞中拟胚体衍生的生长细胞的大小分析标记基因的相对表达水平。
其结果，如图20所示，拟胚体衍生的生长细胞的大小越小，由此诱导的软骨细胞体的细外基质蛋白的基因表达高，相反骨分化标记的组间显著性下降。由此，来源于小尺寸的拟胚体衍生的生长细胞的软骨细胞体可显著示出透明软骨的形成，确认具有高价值。
实施例15.确认根据拟胚体衍生的生长细胞大小示出的作为软骨细胞体的分化能力的差异的原因
根据拟胚体衍生的生长细胞的大小分化成软骨细胞体的分化能力具有差异，拟胚体衍生的生长细胞越小向软骨细胞体的分化能力越优秀，因此寻找使拟胚体衍生的生长细胞大尺寸的细胞不能显著示出分化能力的因子。
具体地，从上述实施例12的步骤iii)中获得的各个大尺寸的拟胚体衍生的生长细胞、中间尺寸的拟胚体衍生的生长细胞及小尺寸的拟胚体衍生的生长细胞提取总mRNA后，通过微阵列分析确认其基因表达水平。通过将微阵列分析结果与对中间尺寸的拟胚体衍生的生长细胞及小尺寸的拟胚体衍生的生长细胞中的基因表达水平的大尺寸拟胚体衍生的生长细胞中的基因表达水平进行比较，来筛选在大尺寸的拟胚体衍生的生长细胞中特异性表达水平发生变化的基因。
其结果，如下述表10及表11所示，越是拟胚体衍生的生长细胞的大尺寸的拟胚体衍生的生长细胞，胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth Factor 2，IGF2)的表达水平越显著高。
表10
表11
H：大尺寸OG；M：中间尺寸OG；L：小尺寸OG
实施例16.确认在处理IGF2抑制剂的环境下分化诱导的软骨细胞体的分化能力
16-1.确认在处理IGF2抑制剂的培养基中培养的拟胚体衍生的生长细胞的增殖程度
确认通过上述实施例15根据拟胚体衍生的生长细胞的大小由此分化的软骨细胞体中IGF2的表达水平具有差异，用于确认当处理作为IGF2抑制剂的克罗美塞丁(chromeceptin)时拟胚体衍生的生长细胞的分化能力是否发生变化。
首先，在上述实施例12步骤的iii)中获得拟胚体衍生的生长细胞中以大尺寸的细胞为对象，根据步骤iv)诱导分化成软骨细胞体的过程中，在培养基中以2nM至2μM的浓度处理克罗美塞丁(chromeceptin)3天并进行培养。然后，根据处理时间观察细胞的形态，并计数增殖的细胞数量。
其结果，如图21所示，随着克罗美塞丁(chromeceptin)的处理浓度的增加，细胞的增殖程度减少，72小时后在包含2μM的克罗美塞丁(chromeceptin)的培养基中分化诱导的拟胚体衍生的生长细胞的数量比未处理对照组减少约3倍以上。
16-2.确认在IGF2抑制剂处理培养基中培养的拟胚体衍生的生长细胞的软骨分化标记
当处理作为IGF2抑制剂的克罗美塞丁(chromeceptin)时，随着浓度增加，拟胚体衍生的生长细胞的增殖也发生变化，用于确认基于此的软骨分化标记的表达水平中是否也具有差异。
为此，以上述实施例16-1的条件处理克罗美塞丁(chromeceptin)来从大尺寸的拟胚体衍生的生长细胞诱导分化成软骨细胞体，同时得拟胚体衍生的生长细胞并提取mRNA，合成cDNA。以合成的cDNA为模板对SOX9、COL2A1、COL10A1及IGF2的表达水平进行定量分析。
其结果，如图22所示，首先，确认随着克罗美塞丁(chromeceptin)的处理浓度增加，在拟胚体衍生的生长细胞中IGF2的表达水平减少。与此相反，作为软骨分化标记的SOX9的表达水平随着克罗美塞丁(chromeceptin)的处理浓度增加显著增加，相对于未处理对照组(Normal Ctrl)，在处理2μM的克罗美塞丁(chromeceptin)的细胞试样中SOX9的表达水平显著增加。
16-3.确认在IGF2抑制剂处理培养基中分化诱导的软骨细胞体的软骨细胞标记
随着处理IGF2抑制剂，大尺寸的拟胚体衍生的生长细胞中软骨细胞分化标记的表达水平也可以显著增加。为此，确认在这种环境下分化诱导的软骨细胞体中是否也显著分化。
首先，以在上述实施例12的步骤iii)中获得的拟胚体衍生的生长细胞中大尺寸的细胞为对象，根据步骤iv)在诱导分化成软骨细胞体的过程中，向培养以2mM的浓度处理克罗美塞丁(chromeceptin)来培养3天。将实验组分成从软骨细胞体开始形成的时间点处理克罗美塞丁(chromeceptin)来诱导软骨细胞分化的实验组(before aggregation)及诱导软骨细胞体形成后第7天的时间点开始处理克罗美塞丁(chromeceptin)来诱导软骨细胞分化的实验组(after aggregation)的两个组，获得分化的各个软骨细胞体。然后，从获得的软骨细胞体提取mRNA，确认COL2A1、SOX9、COL1A1及COL10A1的表达水平。
其结果，如图23所示，确认了，作为软骨细胞标记的SOX9，根据处理克罗美塞丁(chromeceptin)来诱导分化成软骨细胞体，相对于软骨细胞体形成初期(beforeaggregation)，在软骨细胞体形成末期(after aggregation)，SOX9的表达水平显著增加。

Claims (24)

1.一种从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，包括：
步骤i)，从来源于脐带血单核细胞的逆分化干细胞形成并获得拟胚体；
步骤ii)，从上述步骤i)的拟胚体形成并获得拟胚体衍生的生长细胞；以及
步骤iii)，培养上述步骤ii)的拟胚体衍生的生长细胞来获得软骨细胞体。
2.根据权利要求1所述的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，通过重编程脐带血单核细胞来获得上述步骤i)的来源于脐带血单核细胞的逆分化干细胞。
3.根据权利要求2所述的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，上述重编程是对脐带血单核细胞处理包含Yamanaka因子的仙台病毒来诱导成多能细胞。
4.根据权利要求1所述的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，通过对明胶培养基涂抹拟胚体来形成上述步骤ii)的拟胚体衍生的生长细胞。
5.根据权利要求4所述的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，每1cm2的上述明胶培养基中涂抹50～70个拟胚体。
6.根据权利要求1所述的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，上述步骤i)的来源于脐带血单核细胞的逆分化干细胞为HLA纯合体。
7.根据权利要求6所述的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，上述HLA纯合体的类型为韩国人的HLA纯合体的类型。
8.根据权利要求7所述的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，上述韩国人的HLA纯合体的类型为选自由HLA-A*33、HLA-B*44及HLA-DRB1*13组成的组中的一种。
9.一种从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，包括：
步骤i)，通过培养逆分化干细胞来形成拟胚体；
步骤ii)，通过在明胶涂层培养基中培养在上述步骤i)中形成的拟胚体来获得拟胚体衍生的生长细胞；
步骤iii)，将在上述步骤ii)中获得的拟胚体衍生的生长细胞转导于包含用于编码BMP2的碱基序列的小环载体或包含用于编码TGFβ3的碱基序列的小环载体中的一种或两种之中；
步骤iv)，将在上述步骤iii)中转导的拟胚体衍生的生长细胞分化诱导成软骨细胞；以及
步骤v)，获得在上述步骤iv)中分化诱导的软骨细胞。
10.一种从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，包括：
步骤i)，通过培养逆分化干细胞来形成拟胚体；
步骤ii)，通过在明胶涂层培养基中培养在上述步骤i)中形成的拟胚体来获得拟胚体衍生的生长细胞；
步骤iii)，将在上述步骤ii)中获得的拟胚体衍生的生长细胞转导于包含用于编码BMP2的碱基序列的小环载体中；
步骤iv)，将在上述步骤ii)中获得的拟胚体衍生的生长细胞转导于包含用于编码TGFβ3的碱基序列的小环载体中；
步骤v)，将在上述步骤iii)中转导的拟胚体衍生的生长细胞以及在上述步骤iv)中转导的拟胚体衍生的生长细胞混合培养来分化诱导成软骨细胞；以及
步骤vi)，获得在上述步骤v)中分化诱导的软骨细胞。
11.根据权利要求9或10所述的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，上述包含用于编码BMP2的碱基序列的小环载体为如下的非病毒性载体：
(a)包含由CMV启动子、序列1的碱基序列组成的BMP2基因以及包含SV40聚腺苷酸化序列的基因表达盒；
(b)包含位于上述(a)的基因表达盒外部的噬菌体λ的att附着序列；以及
(c)不包含复制起始点及抗生素抗性基因。
12.根据权利要求9或10所述的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，上述包含用于编码TGFβ3的碱基序列的小环载体为如下的非病毒性载体：
(a)包含由CMV启动子、序列2的碱基序列组成的TGFβ3基因以及包含SV40聚腺苷酸化序列的基因表达盒；
(b)包含位于上述(a)的基因表达盒的噬菌体λ的att附着序列；以及
(c)不包含复制起始点及抗生素抗性基因。
13.根据权利要求9或10所述的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，从上述软骨细胞分化诱导的步骤是在不包含重组生长因子的培养基中培养3天至30天来执行。
14.一种从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，包括：
步骤i)，通过培养逆分化干细胞来获得拟胚体；
步骤ii)，通过附着培养在上述步骤i)中获得的拟胚体来获得拟胚体衍生的生长细胞；
步骤iii)，将在上述步骤ii)中获得的拟胚体衍生的生长细胞离心分离来按尺寸分离细胞，并筛选小尺寸的细胞；
步骤iv)，将在上述步骤iii)中筛选的小尺寸的细胞分化诱导成软骨细胞；以及
步骤v)，获得在上述步骤iv)中分化诱导的软骨细胞。
15.根据权利要求14所述的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，通过重编程脐带血单核细胞来获得上述步骤i)的逆分化干细胞。
16.根据权利要求14所述的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，上述步骤ii)的附着培养是在明胶涂层板培养细胞。
17.根据权利要求14所述的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，上述步骤iii)的离心分离及筛选通过下述步骤a)至步骤c)来进行：
步骤a)，在300rpm至800rpm的条件下将包含拟胚体衍生的生长细胞的培养基离心分离3秒钟至10秒钟，并将沉淀的细胞分成大尺寸的细胞；
步骤b)，在800rpm至1200rpm的条件下将上述步骤a)的离心分离后的上清液离心分离3秒钟至10秒钟，并将沉淀的细胞分成中间尺寸的细胞；以及
步骤c)，在1200rpm至2000rpm的条件下将上述步骤b)的离心分离后的上清液离心分离3秒钟至10秒钟，并将沉淀的细胞分成小尺寸的细胞。
18.根据权利要求14所述的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，上述步骤iv)的分化诱导在包含人骨形成蛋白2及转化生长因子β3的培养基中执行。
19.根据权利要求18所述的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法，其特征在于，向上述培养基中进一步添加IGF2抑制剂。
20.一种软骨细胞，其特征在于，通过权利要求1至19中任一项所述的从干细胞分化诱导的软骨细胞的制备方法来制备。
21.一种用于预防或治疗软骨损伤疾病的药学组合物，其特征在于，包含权利要求20的软骨细胞作为有效成分。
22.根据权利要求21所述的用于预防或治疗软骨损伤疾病的药学组合物，其特征在于，上述软骨损伤疾病为退行性关节炎、类风湿关节炎、骨折、足底筋膜炎、肱骨外科炎、钙化性肌腱炎、骨折不愈合或由创伤导致的关节损伤。
23.一种软骨损伤疾病的治疗方法，其特征在于，包括向患有软骨损伤疾病的个体以药学有效量给药权利要求20的软骨细胞的步骤。
24.一种权利要求20的软骨细胞的用途，其特征在于，用作用于预防或治疗软骨损伤疾病的药学组合物的有效成分。
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