CN105112364A - 人脂肪间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分：L-谷氨酰胺、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、维生素C、人血清白蛋白和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖。本发明属于干细胞技术领域，本发明提供的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，能促进脂肪间充质干细胞的快速贴壁和快速增殖，保持良好的干细胞幼稚形态和干细胞特性。

Description

人脂肪间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，涉及一种人脂肪间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法。

背景技术

人脂肪间充质干细胞（adipose-derivedstemcells，ADSCs）是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖，同时具有来源丰富，体内储备量大，取材比骨髓等容易，少量组织即可获取大量干细胞，衰亡率低等优点。成体脂肪组织来源的间充质干细胞在临床上具有很高的应用价值，广泛应用于组织工程及再生医学领域。

1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖（1,2,3,4,6-Pentagalloylglucose，PGG）是从药用植物余甘子中提取得到的化合物，CAS登录号为14937-32-7。中国专利申请200910040157.6公开了1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖的抗流感病毒方面的用途。

传统的含动物血清的干细胞培养基给干细胞的生产与科研带来多种不利因素。血清能为干细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，但其存在诸多缺点：批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，成分不明确，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。

无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入成分明确的血清替代成分，既能满足干细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。因此，发展无血清培养基是干细胞走向临床应用的重要条件。目前已有一些市售干细胞无血清培养基，但是现有市售无血清培养基存在细胞增殖不够理想、价格昂贵等缺陷。

中国专利申请201210197360.6公开了一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基，该培养基以高糖型DMEM为基础培养基，添加了牛磺酸、还原型谷胱甘肽和铜蓝蛋白等组分，但存在细胞贴壁性差，增殖缓慢的缺陷。

中国专利申请201310134502.9公开了一种无血清的脂肪间充质干细胞培养基，该培养基以低糖型DMEM为基础培养基，虽然添加了碱性成纤维生长因子、肝素和谷氨酰胺等组分，但脂肪间充质干细胞的生长增殖效果不够理想。

因此，现有技术存在细胞贴壁性差，细胞增殖速率不够理想等问题。

发明内容

为解决现有技术中存在的细胞贴壁性差，细胞增殖速率不够理想等问题，发明人通过大量试验筛选，得到一种新的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，该培养基的使用无需培养瓶进行包被，细胞贴壁性良好，细胞增殖速率高，保持良好的干细胞幼稚形态和干细胞特性，降低了成本。

本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步体现和说明。

本发明提供一种人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺1~10mM、胰岛素样生长因子5~100ng/mL、表皮生长因子1~50ng/mL、转化生长因子1~10ng/mL、血小板源性生长因子1~10ng/mL、成纤维细胞生长因子1~50ng/mL、转铁蛋白0.5~10μg/mL、维生素C5~50μg/mL、人血清白蛋白0.2~3mg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖1.25~15μM。

上述组分及其浓度是发明人经大量试验筛选确定的。上述组分中，DMEM基础培养基提供氨基酸、无机盐、糖类等基本物质；L-谷氨酰胺作为一种必需氨基酸，在细胞培养过程中起到重要作用，可作为细胞新陈代谢的二次能量来源；转铁蛋白是血浆中主要的铁传递蛋白，为细胞内化和细胞代谢提供所需的铁；维生素C是维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用，还可抗氧化；人血清白蛋白能提供细胞生长所需的营养物质，还可调节渗透压，保护细胞免受机械损伤；胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、血小板源性生长因子和成纤维细胞生长因子则起到间充质干细胞生存维持和增殖刺激的作用；1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖（1,2,3,4,6-Pentagalloylglucose，PGG）促进了人脂肪间充质干细胞的快速贴壁和快速增殖，并能够维持脂肪干细胞的干细胞幼稚形态和干细胞特性。

优选地，本发明提供的无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺1~10mM、胰岛素样生长因子5~20ng/mL、表皮生长因子1~20ng/mL、转化生长因子1~10ng/mL、血小板源性生长因子1~10ng/mL、成纤维细胞生长因子1~20ng/mL、转铁蛋白0.5~10μg/mL、维生素C5~50μg/mL、人血清白蛋白0.2~3mg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖5~12.5μM。

优选地，本发明提供的无血清培养基，包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺5mM、胰岛素样生长因子10ng/mL、表皮生长因子10ng/mL、转化生长因子5ng/mL、血小板源性生长因子5ng/mL、成纤维细胞生长因子10ng/mL、转铁蛋白5μg/mL、维生素C25μg/mL、人血清白蛋白1mg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖10μM。

优选地，本发明提供的无血清培养基，还包括0.1~10ng/mL的干细胞生长因子（SCGF）。干细胞生长因子可以进一步促进人脂肪间充质干细胞的增殖并维持干细胞特性。当然，本发明提供的无血清培养基还可以进一步包括链霉素，链霉素的浓度为100μg/mL。

优选地，所述干细胞生长因子的浓度为0.2~0.4ng/mL。

优选地，所述DMEM基础培养基为高糖型DMEM基础培养基或低糖型DMEM基础培养基。

优选地，所述成纤维细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），所述血小板源性生长因子为PDGF，所述胰岛素样生长因子为胰岛素样生长因子-1（IGF-1），所述转化生长因子为转化生长因子-β（TGF-β）。

相应地，本发明还提供人脂肪间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入L-谷氨酰胺、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、维生素C、人血清白蛋白和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖，混匀，过膜除菌即得。

此外，本发明还提供人脂肪间充质干细胞的无血清培养基在人脂肪间充质干细胞培养中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种新的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，与传统的含血清培养基相比，本发明提供的培养基促进了人脂肪间充质干细胞的快速贴壁，培养的人脂肪间充质干细胞能够保持较好的干细胞幼稚形态，具有更好的细胞增殖速率和细胞干性，降低了成本。本发明提供的制备方法简单，制得的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基用于人脂肪间充质干细胞的培养，培养获得的细胞表现出优异的细胞性能。

附图说明

图1含不同浓度PGG的培养基对人脂肪间充质干细胞增殖的影响。

图2含不同浓度干细胞生长因子的培养基对人脂肪间充质干细胞增殖的影响。

图3人脂肪间充质干细胞在不同培养基中的增殖曲线。

图4培养基1和培养基2培养P10代人脂肪间充质干细胞的形态图。

图5人脂肪间充质干细胞在不同培养基中培养后的干性基因表达结果图。

图6人脂肪间充质干细胞在不同培养基中培养后的诱导分化结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明中的各组分均为常规市售产品，例如1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖购自成都普瑞法科技开发有限公司，货号BP0001。本发明中，培养基1：本发明实施例三提供的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基；培养基2：高糖型DMEM基础培养基+10%体积百分比的胎牛血清。

实施例一含不同浓度PGG的培养基对细胞增殖的影响

发明人进行大量试验筛选得到本发明提供的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基配方，并进一步对PGG的浓度影响进行了考察。将PGG粉末用DMSO溶解成100mM母液，分别用高糖型DMEM基础培养基将PGG母液稀释成20μM、15μM、12.5μM、10μM、7.5μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.63μM与0.31μM的PGG溶液。

将P1代人脂肪间充质干细胞以10⁴个/mL的密度接种于96孔板中，分别用含不同浓度PGG的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基（与实施例三提供的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基的区别在于PGG浓度不同）培养，每孔100μL，以不加PGG的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基为对照组。置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中继续培养，分别于24h、48h与72h之后，用MTT检测方法，测定每孔的吸光值，将加入PGG处理组的吸光值与不加PGG的对照组的吸光值相对比，求算添加不同浓度PGG后的细胞增殖率，结果如图1所示。从图1可知，当PGG浓度达到1.25μM时，存活率呈现显著升高的趋势，并随着浓度的增加而升高；当PGG浓度达到10μM时，存活率达到峰值，并随着浓度的增加而降低。

实施例二含不同浓度干细胞生长因子的培养基对细胞增殖的影响

将P1代人脂肪间充质干细胞以10⁴个/mL的密度接种于96孔板中，分别用含不同浓度干细胞生长因子的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基（与实施例六提供的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基的区别在于干细胞生长因子浓度不同）培养，每孔100μL，以不加干细胞生长因子的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基为对照组。置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中继续培养，于24h之后，用MTT检测方法，测定每孔的吸光值，将加入干细胞生长因子处理组的吸光值与不加干细胞生长因子的对照组的吸光值相对比，求算添加不同浓度干细胞生长因子后的细胞增殖率，结果如图2所示。从图2可知，当干细胞生长因子浓度达到0.1ng/mL时，增殖率呈现显著升高的趋势，并随着浓度的增加而升高；当干细胞生长因子浓度达到0.3ng/mL时，存活率达到峰值，并随着浓度的增加而降低。

实施例三人脂肪间充质干细胞的无血清培养基

人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺5mM、胰岛素样生长因子-110ng/mL、表皮生长因子10ng/mL、转化生长因子-β5ng/mL、血小板源性生长因子5ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子10ng/mL、转铁蛋白5μg/mL、维生素C25μg/mL、人血清白蛋白1mg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖10μM。

制备方法：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入L-谷氨酰胺、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、维生素C、人血清白蛋白和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖，混匀，过膜除菌即得。

实施例四人脂肪间充质干细胞的无血清培养基

人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺10mM、胰岛素样生长因子-15ng/mL、表皮生长因子2ng/mL、转化生长因子-β10ng/mL、血小板源性生长因子1ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子5ng/mL、转铁蛋白1μg/mL、维生素C5μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖5μM。

制备方法与实施例三类似。

实施例五人脂肪间充质干细胞的无血清培养基

人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括低糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺1mM、胰岛素样生长因子-120ng/mL、表皮生长因子20ng/mL、转化生长因子-β1ng/mL、血小板源性生长因子10ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子20ng/mL、转铁蛋白10μg/mL、维生素C20μg/mL、人血清白蛋白0.5mg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖12.5μM。

制备方法与实施例三类似。

实施例六人脂肪间充质干细胞的无血清培养基

人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，包括高糖型DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺5mM、胰岛素样生长因子-110ng/mL、表皮生长因子10ng/mL、转化生长因子-β5ng/mL、血小板源性生长因子5ng/mL、碱性成纤维细胞生长因子10ng/mL、转铁蛋白5μg/mL、维生素C25μg/mL、人血清白蛋白1mg/mL、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖10μM和干细胞生长因子0.3ng/mL。

制备方法与实施例三类似。

实施例七人脂肪间充质干细胞在不同培养基中的增殖

将P1代人脂肪间充质干细胞以5000个/mL的密度接种到6孔板中，接种2mL，分别用培养基1和培养基2培养，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，每3天进行换液，在连续10天的培养过程中在倒置相差显微镜下观察记录细胞形态，且每天分别将培养的细胞用0.25%胰酶消化，使用细胞计数板计数，计算其细胞密度，连续检测10d，细胞密度对培养时间绘制细胞密度随时间的变化曲线，结果如图3所示。从图3可知，本发明优选的无血清培养基所培养的细胞增殖速率明显大于传统的含血清培养基。

分别用培养基1和培养基2对P1代人脂肪间充质干细胞进行培养，培养至P10代时的细胞形态图如图4所示。从图4可知，两种培养基培养得到的细胞形态并无显著性差异，与原代细胞相比细胞形态也无显著性变化，保持了较好的干细胞幼稚形态，未出现老化迹象。

实施例八人脂肪间充质干细胞在不同培养基中培养后的干性基因表达

将P1代人脂肪间充质干细胞以3×10⁵个/mL的密度接种到6孔板中，接种2mL，分别用培养基1和培养基2培养，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养，培养48h之后提取RNA，反转录，采用实时荧光定量q-PCR检测干性相关基因Sox-2、Oct4、Nanog的mRNA相对表达量，结果如图5所示。从图5可知，培养基1所培养的人脂肪间充质干细胞的干性基因表达明显优于培养基2培养的人脂肪间充质干细胞。

实施例九人脂肪间充质干细胞在本发明提供的培养基中培养后的细胞表型检测

将培养基1培养的人脂肪间充质干细胞继续培养到第10代，去掉培养液，PBS洗涤3次，用0.25%胰蛋白酶液消化，1000r/min离心5min，调整细胞浓度，制成浓度为10⁵个/mL的单细胞悬液，使用藻红蛋白（PE）标记的CD105，CD73和CD90单克隆抗体，和异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD45，CD34，CD14，CD19和HLA-DR单克隆抗体，在4℃下孵育30min，用PBS洗涤2次，1000r/min离心5min，用500μL的PBS重悬细胞，然后上流式细胞仪检测。结果显示，采用本发明提供的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基培养的脂肪间充质干细胞经过10次传代培养，细胞表型中CD105、CD73和CD90的阳性率大于95%，而CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR的阳性率小于2%，结果如表1所示。从表1可知，本发明提供的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基能够很好的保持人脂肪间充质干细胞的生物学特性不变。

实施例十人脂肪间充质干细胞在本发明提供的培养基中培养后的诱导分化

将培养基1培养的人脂肪间充质干细胞继续培养到第10代，消化收集后，以2×10⁴个/mL的密度接种于24孔板中，接种0.5mL，在上述培养基中培养3d。当细胞长至80%汇合度时，用成脂诱导剂（由培养基1添加1μmol/L地塞米松、200μmol/L吲哚美辛、0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10μmol/L胰岛素得到）进行诱导分化。每3d更换一次诱导培养基，诱导培养两周。两周后，将细胞进行油红O染色，以观察细胞脂滴形成情况，成脂诱导结果如图6所示，结果说明人脂肪间充质干细胞经成脂诱导剂诱导,能够分化形成脂肪细胞，证明人脂肪间充质干细胞具有成脂分化能力。

当细胞长至80%汇合度时，用成骨诱导剂(由培养基1添加0.1μmol/L地塞米松、50μmol/L维生素C、10mmol/Lβ-甘油酸钠得到)进行诱导分化。每3d更换1次诱导培养基，细胞经4周分化培养后，进行茜素红染色，以观察细胞成骨钙结节形成情况，成骨诱导结果如图6所示，结果说明人脂肪间充质干细胞经成骨诱导剂诱导，可见大量黑色矿化结节状沉积，证明人脂肪间充质干细胞具有成骨分化能力。

当细胞长至80%汇合度时，用软骨诱导培养基(由培养基1添加110mg/L丙酮酸钠、0.15mmol/L维生素C、100nmol/L地塞米松、6.25ng/L牛胰岛素、6.25mg/L转铁蛋白和10ng/mL转化生长因子-β得到)。每3d更换1次诱导培养基。诱导培养2周后，进行Alcianblue染色，成软骨诱导结果如图6所示，结果说明蛋白聚糖基质产生，证明人脂肪间充质干细胞具有向软骨细胞分化的能力。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺1~10mM、胰岛素样生长因子5~100ng/mL、表皮生长因子1~50ng/mL、转化生长因子1~10ng/mL、血小板源性生长因子1~10ng/mL、成纤维细胞生长因子1~50ng/mL、转铁蛋白0.5~10μg/mL、维生素C5~50μg/mL、人血清白蛋白0.2~3mg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖1.25~15μM。

2.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺1~10mM、胰岛素样生长因子5~20ng/mL、表皮生长因子1~20ng/mL、转化生长因子1~10ng/mL、血小板源性生长因子1~10ng/mL、成纤维细胞生长因子1~20ng/mL、转铁蛋白0.5~10μg/mL、维生素C5~50μg/mL、人血清白蛋白0.2~3mg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖5~12.5μM。

3.根据权利要求2所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：包括DMEM基础培养基，还包括如下组分及其浓度：L-谷氨酰胺5mM、胰岛素样生长因子10ng/mL、表皮生长因子10ng/mL、转化生长因子5ng/mL、血小板源性生长因子5ng/mL、成纤维细胞生长因子10ng/mL、转铁蛋白5μg/mL、维生素C25μg/mL、人血清白蛋白1mg/mL和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖10μM。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：还包括0.1~1ng/mL的干细胞生长因子。

5.根据权利要求4所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：所述干细胞生长因子的浓度为0.2~0.4ng/mL。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：所述DMEM基础培养基为高糖型DMEM基础培养基或低糖型DMEM基础培养基。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基，其特征在于：所述成纤维细胞生长因子为碱性成纤维细胞生长因子，所述血小板源性生长因子为PDGF，所述胰岛素样生长因子为胰岛素样生长因子-1，所述转化生长因子为转化生长因子-β。

8.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：向DMEM基础培养基中，按所述浓度加入L-谷氨酰胺、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子、血小板源性生长因子、成纤维细胞生长因子、转铁蛋白、维生素C、人血清白蛋白和1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖，混匀，过膜除菌即得。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的人脂肪间充质干细胞的无血清培养基在人脂肪间充质干细胞培养中的用途。