CN113337457A - 一种无血清调控干细胞的细胞状态的方法以及调节剂的应用 - Google Patents

一种无血清调控干细胞的细胞状态的方法以及调节剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种无血清调控干细胞的细胞状态的方法以及调节剂的应用，涉及细胞培养的技术领域，所述调节剂包括溶血磷脂酸lysophosphatidic acid(LPA)，能够用于无血清调控干细胞的细胞状态；所述调控干细胞的细胞状态包括：改变细胞形态、增加细胞干重、减慢生长速度、改变代谢状态、改变基因表达水平、改变信号通路状态、降低组蛋白乙酰化水平、维持干细胞多能性及分化能力中的至少一种；本发明采用明确的成分LPA使干细胞达到近似于血清培养时的细胞状态，为构建无血清而需要特定细胞状态的细胞模型提供了途径，在避免外源物造成污染的同时，显著降低了培养的成本。

Description

一种无血清调控干细胞的细胞状态的方法以及调节剂的应用
技术领域
本发明涉及细胞培养的技术领域，具体而言，涉及一种无血清调控干细胞的细胞状态的方法以及调节剂的应用。
背景技术
人类多能干细胞(hPSC)具有无限自我复制及分化为体内的所有细胞类型的特点，是研究人类胚胎发育的重要模型系统，其分化产生的特定细胞类型在细胞治疗，药物筛选和疾病模型研究中也起着重要作用。细胞培养基成分对维持及改变干细胞状态起着重要作用。
现有的干细胞培养过程中，通常需要添加血清。血清是由血浆去除纤维蛋白原而形成的一种很复杂的混合物，其组成成分虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。但是血清中的外源物质同样可能带来污染。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种无血清调控干细胞的细胞状态的方法以及调节剂的应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了一种无血清调控干细胞的细胞状态的方法，其包括：采用调节剂对干细胞的细胞状态进行调控，所述调节剂包括溶血磷脂酸；
所述调控干细胞的细胞状态是指(1)～(8)中的至少一种：
(1)改变细胞形态；
(2)增加细胞干重；
(3)减慢生长速度；
(4)改变代谢状态；
(5)改变基因表达水平；
(6)改变信号通路状态；
(7)降低组蛋白乙酰化水平；
(8)维持干细胞多能性及分化能力。
第二方面，本发明实施例提供了一种调节剂在制备用于无血清调控干细胞的细胞状态的试剂中的应用，所述调节剂包括溶血磷脂酸LPA；
所述调控干细胞的细胞状态是指(1)～(8)中的至少一种：
(1)改变细胞形态；
(2)增加细胞干重；
(3)减慢生长速度；
(4)改变代谢状态；
(5)改变基因表达水平；
(6)改变信号通路状态；
(7)降低组蛋白乙酰化水平；
(8)维持干细胞多能性及分化能力。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供了一种无血清调控干细胞的细胞状态的方法以及调节剂的应用，所述调节剂包括溶血磷脂酸LPA，能够用于无血清调控干细胞的细胞状态；所述调控干细胞的细胞状态包括：改变细胞形态、增加细胞干重、减慢生长速度、改变代谢状态、改变基因表达水平、改变信号通路状态、降低组蛋白乙酰化水平、维持干细胞多能性及分化能力中的至少一种，本发明采用明确的成分LPA使干细胞达到近似于血清培养时的细胞状态，为构建无血清而需要特定细胞状态的细胞模型提供了途径，在避免外源物造成污染的同时，显著降低了培养的成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1在LPA的化学结构及其在血清提取物中的占比；其中，A为LPA的化学结构，B为各种LPA在血清提取物AlbuMAX中的占比，C为血清白蛋白albumin以及血清提取物AlbuMAX中LPA的含量；
图2为实施例2中LPA对人胚胎干细胞的影响，其中，A为添加各种LPA以及LPA联合albumin使用情况下，细胞形态的变化，B为LPA对细胞大小的影响，C为LPA对细胞干重的影响，D为LPA对细胞增殖的影响；
图3为实施例3中LPA对细胞代谢的影响，其中A为：LPA、LPA+Albumin以及LPA+Albumin+CDL对糖酵解、三羧酸循环，氧化还原中间产物及核糖核苷酸等物质的含量的影响，CDL为ThermoFisherTM的Chemically Defined Lipid Concentrate，货号为11905；B为LPA与高浓度脂类添加物hCDL联用对代谢产物的影响；C为PLS-DA分析的代谢数据结果；
图4为实施例4中LPA对干细胞基因表达、组蛋白乙酰化以及ERK信号通路的影响结果，其中，A为RNA芯片数据的分析结果；B为LPA处理组与AlbuMAX组对组蛋白H3乙酰化水平的影响结果；C为LPA处理组与AlbuMAX组对ERK磷酸化水平的影响结果；
图5为实施例5中LPA对干细胞多能性以及分化能力的影响，其中，A为调节剂对干细胞多能性相关基因OCT4、SOX2以及NANOG表达的影响；B为调节剂对干细胞自发分化过程的影响；C为调节剂对干细胞定向三胚层分化的影响。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先，本发明实施例提供了一种无血清调控干细胞的细胞状态的方法，其包括：采用调节剂对干细胞的细胞状态进行调控，所述调节剂包括溶血磷脂酸LPA；
所述调控干细胞的细胞状态是指(1)～(8)中的至少一种：
(1)改变细胞形态；
(2)增加细胞干重；
(3)减慢生长速度；
(4)改变代谢状态；
(5)改变基因表达水平；
(6)改变信号通路状态；
(7)降低组蛋白乙酰化水平；
(8)维持干细胞多能性及分化能力。
溶血磷脂酸(LPA)，是迄今发现的最小，结构最简单的磷脂，是细胞磷脂合成的关键性前体，也是甘油磷脂代谢的中间产物。本发明的发明人研究了LPA添加在干细胞培养基中对干细胞的多种细胞状态的影响，以LPA替代血清培养细胞，控制细胞状态，为稳定地构建细胞模型及其后续的研究提供基础。
在一些实施例中，上述“改变细胞形态”是指使干细胞的细胞形态趋近于采用血清培养时的细胞形态，(2)～(8)可以此类推。
优选地，所述改变代谢状态是指：增强糖酵解、增强三羧酸循环、增强氧化还原中间产物以及增强核糖核苷酸的物质含量中的至少一项。
优选地，所述改变基因表达水平是指：使干细胞多能性相关基因的表达水平达到血清培养时的表达水平；具体是指(9)～(12)中的至少一种：
(9)上调TGFβ、p53、MAPK中至少一种信号通路的相关基因；
(10)上调焦点粘连、肌动蛋白细胞骨架、紧密连接中至少一种相关基因；
(11)下调Hippo、Ras、Wnt中至少一种通路相关基因；
(12)下调脂肪酸代谢、氧化磷酸化、细胞周期、RNA转运中的至少一种相关基因；
优选地，所述信号通路状态是指(13)～(15)中的至少一种：
(13)使ERK磷酸化水平上升；
(14)上调TGFβ、p53、MAPK中至少一种信号通路；
(15)下调Hippo、Ras、Wnt中至少一种信号通路。
优选地，所述调控干细胞的细胞状态是指：培养干细胞，以使干细胞在无血清培养的情况下达到血清培养时的状态。发明人发现，在无血清培养基中添加LPA对干细胞进行培养，能够顺利地进行干细胞的培养，并使干细胞的细胞状态趋近于采用血清培养时的状态。在一些实施例中，调节剂的调节方式如下：将干细胞培养至一定细胞密度时，往培养基中添加调节剂。
可选地，所述调节剂的添加时机为：当干细胞培养至细胞密度为10％～40％时，添加所述调节剂。优选地，所述调节剂的添加时机为：当干细胞培养至细胞密度为10％～20％时，添加所述调节剂，经48小时培养后细胞密度可达到70％。相应地，在细胞密度30％～40％时添加所述调节剂，经24小时培养后细胞密度可达到70％。在一些具体的实施例中，添加时机可选自细胞密度为10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、30％、32％、34％、36％、38％和40％中的任意密度的时机。
在一些实施例中，采用血清培养是指：在培养基中添加血清或血清提取物。优选地，所述血清提取物为AlbuMAX，AlbuMAX具体可选自SigmaTM的AlbuMAXⅠ，货号为11020-021，处理浓度为1.6％。
优选地，在无血清培养基中，LPA的处理浓度为0.01～5μM。本文中的“处理浓度”为LPA调控干细胞的细胞状态时的浓度，同“终浓度”。在一些实施例中，LPA的处理浓度可以为0.01μM、0.05μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM和5μM中的任意浓度。
优选地，所述LPA为油酰基-L-α-溶血磷脂酸钠盐(Oleoyl-L-α-lysophosphatidicacid sodium salt)，具体可包括16:0Lyso PA、18:0Lyso PA、18:1Lyso PA、18:2Lyso PA和20:4Lyso PA中的至少一种；其中，“18:1Lyso PA”为缩写，全称为1-oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphate。16:0Lyso PA、18:0Lyso PA、18:1Lyso PA、18:2Lyso PA和20:4LysoPA均可购自AvantiTM，货号分别为857123P，857128P，857138C，857125C。
优选地，所述调节剂还包括白蛋白和脂类物质中的至少一种。具体地，白蛋白或脂类物质的添加均能够有效进一步提高调节剂的调控能力，使干细胞的细胞状态更加趋近采用血清培养时的细胞状态。
优选地，在无血清培养基中，白蛋白的处理浓度为0.01％～5％，所述脂类物质的处理浓度为0.001％～0.1％。在一些实施例中，白蛋白的处理浓度可选自0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％和5％中的任意比例；和脂类物质的处理浓度可选自0.001％、0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％和0.1％中的任意比例。
优选地，白蛋白是指Albumin，具体可选用SigmaTM的bovine serum albumin，货号为A7030。
在一些实施例中，所述脂类物质为高浓度脂类添加物hCDL；包括以下组分，各组分在hCDL中的终浓度如下：0.1～1.4mg/mL花生四烯酸，12～32mg/mL胆固醇，1～14mg/mL生育酚乙酸酯，1～8mg/mL亚油酸，1～8mg/mL亚麻酸，0.1～5mg/mL肉豆蔻酸，1～8mg/mL油酸，1～20mg/mL棕榈酸，0.1～5mg/mL棕榈油酸，10～26mg/mL硬脂酸。制备后，根据上述限定的hCDL的处理浓度，按比例添加至培养基中，达到上述作用浓度的范围。优选地，在一些实施例中，所述hCDL中组分的浓度为：0.7mg/mL花生四烯酸，22mg/mL胆固醇，7mg/mL生育酚乙酸酯，4mg/mL亚油酸，4mg/mL亚麻酸，1mg/mL肉豆蔻酸，4mg/mL油酸，10mg/mL棕榈酸，2mg/mL棕榈油酸，16mg/mL硬脂酸。
在一些实施例中，本发明不对无血清培养基的成分进行限制，只要满足能够培养干细胞以及无血清的条件即可；可选地，所述无血清培养基为E8培养基；优选地，所述无血清培养基的成分包括：DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、硒酸钠、转铁蛋白和胰岛素中的至少一种。
优选地，所述干细胞包括胚胎干细胞和多能干细胞中的至少一种。
此外，本发明实施例还提供了调节剂在制备用于无血清调控干细胞的细胞状态的试剂中的应用，所述调节剂包括溶血磷脂酸LPA；
所述调控干细胞的细胞状态是指(1)～(8)中的至少一种：
(1)改变细胞形态；
(2)增加细胞干重；
(3)减慢生长速度；
(4)改变代谢状态；
(5)改变基因表达状态；
(6)改变信号通路状态；
(7)降低组蛋白乙酰化水平；
(8)维持干细胞多能性及分化能力。
在上述应用中，调控的技术方案同前述任一实施例所述的无血清调控干细胞的细胞状态的方法，在此不再赘述。
现有技术在干细胞的培养过程中多添加有血清，血清能够提供有利于细胞生长增殖所有的营养物质，并对细胞的生长状态进行有效调控，使细胞能够顺利有效地进行生长。但是血清的添加也同样存在一些问题，如可能对培养的干细胞造成污染，且实验的可重复性较低，稳定性较差。
本发明采用了以明确的成分LPA使干细胞达到近似于血清培养的效果，在去除血清造成的外源污染的同时，大大降低了培养成本，同时，LPA在维持干细胞多能性的同时，降低干细胞的增殖速率的特性也显著降低了培养基等耗材的使用，大幅降低了培养干细胞的人力和时间的成本。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
验证LPA在血清提取物中的含量，本实施例采用了三重四极杆液相质谱仪定量检测了各种LPA在AlbuMAX(用于细胞培养的富含脂质牛血清白蛋白)中的占比，并定量测定了18:1Lyso PA在albumin(白蛋白)与AlbuMAX中的含量(见图1)。
由结果可知，LPA在AlbuMAX中有可观含量，而在albumin中几乎没有。
实施例2
验证LPA对人胚胎干细胞培养的影响。
本实施例测试了在单独作用及与albumin共用的条件下不同种LPA(16:0Lyso PA，18:0Lyso PA，18:1Lyso PA，18:2Lyso PA，20:4Lyso PA)在不同浓度(0.01μM、0.1μM、1μM和5μM)下对细胞形态的影响，具体操作如下：
将人胚胎干细胞H1培养在E8培养基中，每天更换培养基，细胞密度达到70％-80％后用DPBS-EDTA洗涤两次，然后在室温下孵育5分钟，去除DPBS-EDTA，并用含有10μM Rockinhibitor(Y27632)的E8培养基重悬细胞后，以1:20的密度传代至预先包被Matrigel的12孔板，第二天换液，第三天开始加调节剂(细胞密度约为20％)，每天换液及加调节剂，两天后观察细胞形态。细胞大小经流式细胞仪测定。细胞在加调节剂两天后收集，计数，并在50℃干燥3天后测定细胞干重。细胞收集后经流式细胞仪计数后得到增殖曲线，结果如下。
图2中A为16:0Lyso PA，18:0Lyso PA，18:1Lyso PA，18:2Lyso PA，20:4Lyso PA对细胞形态的影响，由结果可知，各种LPA随浓度提升均可以使干细胞的形态接近AlbuMAX培养的状态，在联合albumin使用的情况下，LPA改变细胞形态的效果得到增强；由图2中B可知，LPA联合albumin增大了细胞，这一效果与AlbuMAX相同；由图2中C可知，与AlbuMAX类似的，LPA可以增加细胞干重；由图2中D可知，LPA减慢细胞增殖的速率，该效果与AlbuMAX类似。
实施例3
验证LPA对细胞代谢的影响。
H1细胞经加调节剂(LPA、LPA+Albumin、LPA+Albumin+hCDL)处理两天后收集并使用三重四极杆液相质谱仪测定其代谢物水平，阳性对照采用AlbuMAX进行处理，空白处理(E8)为阴性对照。
AlbuMAX处理组：AlbuMAX的添加量为处理浓度为：1.6％。
调节剂为LPA处理组：LPA的处理浓度为1μM；
调节剂为LPA+Albumin处理组：LPA的处理浓度为1μM，Albumin的处理浓度为1％；
调节剂为LPA+Albumin+hCDL处理组：LPA的处理浓度为1μM，Albumin的处理浓度为1％；
hCDL包括以下组分，各组分在hCDL中的终浓度如下：0.7mg/mL花生四烯酸，22mg/mL胆固醇，7mg/mL生育酚乙酸酯，4mg/mL亚油酸，4mg/mL亚麻酸，1mg/mL肉豆蔻酸，4mg/mL油酸，10mg/mL棕榈酸，2mg/mL棕榈油酸，16mg/mL硬脂酸。hCDL在培养基中的处理浓度为0.1％。
结果请参照图3。
由图3中A可知，LPA增加了糖酵解，三羧酸循环，氧化还原中间产物及核糖核苷酸等物质的含量。与AlbuMAX具有相似的趋势。由图3中B可知，LPA与hCDL联合也有类似AlbuMAX的效果，这种效果并不是由于hCDL，而是由LPA贡献的。由图3中C可知，以PLS-DA分析代谢数据可见AlbuMAX与含有LPA的加药组具有相似性，尤其与LPA+albumin+hCDL最为接近。
可见LPA处理组与AlbuMAX组具有高度相似性。同时比较了LPA与自配hCDL联用的影响，发现高浓度常规脂类物质并不会引起AlbuMAX类似的代谢改变，而LPA是造成改变的主要因素。利用偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)可见LPA处理组与AlbuMAX组具有相似性，而LPA+albumin+hCDL组与AlbuMAX最为接近。
实施例4
LPA对人胚胎干细胞基因表达的影响。
H1细胞加不同调节剂(E8、LPA、LPA+Albumin、hCDL、AlbuMAX、Albumin+hCDL、Albumin)处理两天后经RNA芯片分析，hCDL的处理浓度为0.01％，LPA、Albumin和AlbuMAX的处理浓度均可参照实施例3，不再赘述。
结果参照图4。
由图4中A可知，LPA处理组与AlbuMAX处理组具有高度相似性。
由图4中B可知，Western blot显示LPA+Albumin处理组、LPA+Albumin+hCDL处理组与AlbuMAX处理组均使得组蛋白H3乙酰化水平下降。
由图4中C可知，Western blot显示LPA+Albumin+hCDL处理组与AlbuMAX组均使得ERK磷酸化水平上升。
由结果可知，H1细胞加药处理两天后经RNA芯片分析可见LPA处理组与AlbuMAX组具有高度相似性。Western blot显示LPA处理与AlbuMAX一样会降低组蛋白H3的乙酰化水平并提升ERK磷酸化水平。
实施例5
LPA对人胚胎干细胞多能性及分化能力的影响。
H1细胞经加不同调节剂(E8、Albumax、Albumin、Albumin+hCDL、LPA、LPA+Albumin、LPA+Albumin+hCDL)处理3代后仍维持多能性标识基因NANOG，OTC4及SOX2的表达。调节剂处理时各组分的处理浓度同实施例3。
干细胞自分化的实验操作为：在H1细胞的细胞密度到30％左右时以加药的E6培养基(E8培养基去除FGF2和TGFβ)培养12天，每天换液。12天后检测谱系标识基因。LPA对细胞自分化的外胚层标识基因无影响，对中胚层和内胚层标识基因有和AlbuMAX类似的影响。三个胚层的定向分化实验操作分别为：中胚层分化，H1细胞先在加调节剂的E8培养基中培养48小时，之后加入20纳克/毫升BMP4的E8培养基培养两天后检测标识基因；内胚层分化，首先以加入5μM的CHIR99021的E5培养基(E8培养基去除FGF2，TGFβ及胰岛素)培养一天，然后以加入10纳克/毫升的Activin A的E5培养基培养3天；外胚层分化，以加入10μM SB431542和100nM LDN193189的E6培养基培养4天后检测标识基因。结果参照图5。
由图5中A可知，LPA处理组不影响干细胞多能性相关基因的表达。由图5中B可知，LPA在干细胞自分化过程中具有与AlbuMAX相似的影响。由图5中C可知，LPA在干细胞定向三胚层分化的过程中具有与AlbuMAX相似的影响。
实验结果表明LPA对外胚层标识基因无影响，对中胚层和内胚层标识基因有和AlbuMAX类似的影响。
需要说明的是，在本发明实施例中使用了16:0；18:0；18:1；18:2；20:4五种LPA，五种LPA具有相似的效果。其中18:1LPA为市售最常见及科研文献中最常见的LPA种类，因此，实施例主要以18:1为主记载了大部分数据。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种无血清调控干细胞的细胞状态的方法，其特征在于，其包括：采用调节剂对干细胞的细胞状态进行调控，所述调节剂包括溶血磷脂酸LPA；
所述调控干细胞的细胞状态是指(1)～(8)中的至少一种：
(1)改变细胞形态；
(2)增加细胞干重；
(3)减慢生长速度；
(4)改变代谢状态；
(5)改变基因表达水平；
(6)改变信号通路状态；
(7)降低组蛋白乙酰化水平；
(8)维持干细胞多能性及分化能力。
2.根据权利要求1所述的无血清调控干细胞的细胞状态的方法，其特征在于，所述改变代谢状态是指：增强糖酵解、增强三羧酸循环、增强氧化还原中间产物以及增强核糖核苷酸的物质含量中的至少一项；
优选地，所述改变基因表达水平是指(9)～(12)中的至少一种：
(9)上调TGFβ、p53、MAPK中至少一种信号通路的相关基因；
(10)上调焦点粘连、肌动蛋白细胞骨架、紧密连接中至少一种相关基因；
(11)下调Hippo、Ras、Wnt中至少一种通路相关基因；
(12)下调脂肪酸代谢、氧化磷酸化、细胞周期、RNA转运中的至少一种相关基因；
优选地，所述信号通路状态是指(13)～(15)中的至少一种：
(13)使ERK磷酸化水平上升；
(14)上调TGFβ、p53、MAPK中至少一种信号通路；
(15)下调Hippo、Ras、Wnt中至少一种信号通路。
3.根据权利要求1所述的无血清调控干细胞的细胞状态的方法，其特征在于，所述调控干细胞的细胞状态是指：在所述调节剂存在的状态下培养干细胞，以使干细胞在无血清培养的情况下达到血清培养时的状态。
4.根据权利要求1所述的无血清调控干细胞的细胞状态的方法，其特征在于，所述干细胞包括胚胎干细胞和多能干细胞中的至少一种。
5.根据权利要求1～4任一项所述的无血清调控干细胞的细胞状态的方法，其特征在于，所述调控包括：采用无血清培养基对干细胞进行培养，在培养过程中在所述无血清培养基中添加调节剂。
6.根据权利要求5所述的无血清调控干细胞的细胞状态的方法，其特征在于，在无血清培养基中，LPA的处理浓度为0.01～5μM；
优选地，所述LPA为油酰基-L-α-溶血磷脂酸钠盐；
优选地，所述LPA选自：16:0Lyso PA、18:0Lyso PA、18:1LysoPA、18:2Lyso PA、20:4Lyso PA中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的无血清调控干细胞的细胞状态的方法，其特征在于，所述调节剂还包括白蛋白和脂类物质中的至少一种；
优选地，所述脂类物质为高浓度脂类添加物hCDL；hCDL包括以下组分，各组分在hCDL中的终浓度如下：(0.1～1.4)mg/mL花生四烯酸，(12～32)mg/mL胆固醇，(1～14)mg/mL生育酚乙酸酯，(1～8)mg/mL亚油酸，(1～8)mg/mL亚麻酸，(0.1～5)mg/mL肉豆蔻酸，(1～8)mg/mL油酸，(1～20)mg/mL棕榈酸，(0.1～5)mg/mL棕榈油酸和(10～26)mg/mL硬脂酸。
8.根据权利要求7所述的无血清调控干细胞的细胞状态的方法，其特征在于，在无血清培养基中，白蛋白的处理浓度为0.01％～5％，所述脂类物质的处理浓度为0.001％～0.1％；
优选地，所述无血清培养基为E8培养基；
优选地，所述无血清培养基的成分包括：DMEM/F12、L-抗坏血酸-2-磷酸镁、硒酸钠、转铁蛋白和胰岛素中的至少一种。
9.根据权利要求5所述的无血清调控干细胞的细胞状态的方法，其特征在于，所述调节剂的添加时机为：当干细胞培养至细胞密度为10％～40％时，添加所述调节剂。
10.调节剂在制备用于无血清调控干细胞的细胞状态的试剂中的应用，其特征在于，所述调节剂包括溶血磷脂酸LPA；
所述调控干细胞的细胞状态是指(1)～(8)中的至少一种：
(1)改变细胞形态；
(2)增加细胞干重；
(3)减慢生长速度；
(4)改变代谢状态；
(5)改变基因表达水平；
(6)改变信号通路状态；
(7)降低组蛋白乙酰化水平；
(8)维持干细胞多能性及分化能力。
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