CN105087480A - 无血清干细胞培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加在该基础培养基中的补充因子，补充因子包括亚硒酸钠、转铁蛋白、牛血清白蛋白、胰岛素、纤粘连蛋白和氢化可的松。采用本发明的上述无血清干细胞培养基，其相对现有技术的血清培养基，可以避免血清批次间的质量差异，提高细胞培养和试验结果的重复性；并避免血清所带来的外源性污染及血清组分的细胞毒性作用。并且其自身成分相对明确、质量一致且蛋白含量低，有利于提高细胞产品生产的稳定性并易于纯化。同时，在上述几种特定搭配维持干细胞增殖和性状程度后，可通过延长细胞的GI期或迫使细胞处于G0期而较长时间的维持细胞高密度培养，能更好地保持其干细胞特性。

Description

无血清干细胞培养基及其应用

技术领域

本发明属于细胞培养基技术领域，具体涉及一种无血清干细胞培养基及其应用。

背景技术

干细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在细胞培养中必须提供某些痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。因此采用的基础培养基常常要添加血清，如马血清或胎牛血清；因为血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，它能提供细胞在体外培养时所需要的生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用；而且本身血清中还富含有丝分裂因子，也利于细胞系和原代培养。但血清培养基存在一定的弊端，无法规避动物血清中的异源体，如果使用动物血清培养基培育出来的细胞，会存在人体异源体排斥和冲突。

尤其是在干细胞培养的过程中，血清中大量成分复杂的蛋白质，给细胞培养的标准化带来困难，其中复杂的蛋白和多重的细胞因子，会导致本身就容易分化的干细胞生出多种完全不同的细胞表型，而产生多种完全不同的细胞分化趋势，也给细胞培养表达产品分离纯化和结果的重复性带来很大的困难。

发明内容

本发明实施的目的在于克服血清培养基的缺陷，提供一种无血清干细胞培养基及其应用。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加在该基础培养基中的补充因子，所述补充因子包括亚硒酸钠、转铁蛋白、牛血清白蛋白、胰岛素、纤粘连蛋白和氢化可的松。

本发明还提出将上述无血清培养基进行干细胞培养方面的应用。

采用本发明的上述无血清干细胞培养基，针对干细胞自身容易生出多种完全不同的细胞表型和多种完全不同的细胞分化趋势的情形，采用上述各功能成分稳定和保持其分化水平，并且将其中的生长因子尽量控制保持在单一的水平；并且可以避免现有技术血清蛋白培养基存在的血清批次间的质量差异，提高细胞培养和试验结果的重复性；并避免血清所带来的外源性污染及血清组分的细胞毒性作用。并且其自身成分相对明确、质量一致且蛋白含量低，有利于提高细胞产品生产的稳定性并使细胞产品易于纯化。同时，在上述几种特定搭配维持干细胞增殖和性状程度后，可通过延长细胞的GI期或迫使细胞处于G0期而较长时间的维持细胞高密度培养，能更好地保持其干细胞特性。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明采用血清培养基培养干细胞至第4天时显微镜观察结果；

图2为本发明无血清培养基培养干细胞至第4天时显微镜观察结果；

图3为本发明采用血清培养基培养干细胞至第14天时显微镜观察结果；

图4为本发明无血清培养基培养干细胞至第14天时显微镜观察结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实例提出一种无血清干细胞培养基，包括基础培养基，和添加在基础培养基中的补充因子，补充因子包括亚硒酸钠、转铁蛋白、牛血清白蛋白、胰岛素、纤粘连蛋白和氢化可的松。

本发明的无血清培养基针对干细胞培养中自身容易生出多种完全不同的细胞表型和多种完全不同的细胞分化趋势的情形，采用上述各功能成分稳定和保持其分化水平，并且将其中的生长因子尽量控制保持在单一的水平，并且可以避免现有技术血清蛋白培养基存在的血清批次间的质量差异，提高细胞培养和试验结果的重复性。

通常在干细胞的血清培养中，血清中具有较多天然成分，自身可以中和细胞毒素保护细胞，而无血清培养基首先需要解除毒素物质对干细胞的伤害；干细胞培养的过程中，过氧化氢是细胞生长和克隆的主要毒性物质，可由培养基中的酪氨酸、色氨酸、核黄素、抗坏血酸盐等产生，引起细胞膜上的饱和脂肪酸、细胞蛋白质氧化和DNA损伤而导致细胞死亡。本发明上述亚硒酸钠，其中含有的微量元素硒参与谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧化酶的作用过程，可以促进氢过氧化物代谢，消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害。

另一方面，转铁蛋白的添加之后，其与哺乳动物细胞上存在特定的转铁蛋白受体结合，形成的受体与转铁蛋白复合物是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源，此外，转铁蛋白还具有生长因子的性质并能与其他微量元素如钒等结合。

牛血清白蛋白是无血清培养基的主要添加生长因子，它可以通过与维生素、脂类、激素、金属离子和生长因子的结合而稳定和调节上述物质在无血清培养基中的活性；并且牛血清白蛋白比较大，可增加培养基的粘度，调节渗透压，并保护细胞免受机械损伤等作用，此外还有结合毒素和减轻蛋白酶对细胞影响的作用，因此加入牛血清白蛋白，以达到保护和稳定细胞生长的作用。

胰岛素本身的是血糖调节激素，专用至培养基中之后，能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸的效率，从而提升RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是比较重要的细胞存活因子。

相对于胰岛素，氢化可的松也是激素，是一种糖皮质激素，具有免疫抑制作用、抗毒作用、抗休克及一定的盐皮质激素活性等；用在细胞培养基中，首先可以免疫抑制和抗毒作用，可以避免细胞进一步自身抗毒和免疫反应，从而降低了细胞自身产生性状变异和分化的情形。并且，其激素本身的功能是可促进表皮细胞的生长，促进细胞培养过程中生长和增殖的速度。

最后在无血清培养基中还添加纤粘连蛋白，干细胞多是来自于中胚层细胞，必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中要添加促贴壁和扩展因子，同时又不诱导细胞产生纤维化贴壁的诱导，所以采用添加纤粘连蛋白进行。纤粘连蛋白其本身是一种细胞外基质，通过细胞外基质改变细胞表面的粘附性促使其贴壁；并且纤粘连蛋白还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，遏制干细胞发生多向性的分化。

本发明的无血清培养基，其针对干细胞自身来自于中胚层、且细胞易发生分化的特性，采用有限数量的特定成分和功能的添加剂保证干细胞的基本生长要求，以避免干细胞受到多种复杂的蛋白和多重细胞因子诱导出现多种性状和分化趋势的问题。同时，通过胰岛素和氢化可的松的细胞激素联合蛋白和无机盐，补充在基础培养中，使无血清培养基能满足促进干细胞生长和增殖效率的同时，并维持干细胞的分化程度和性状稳定。

进一步，在上述实施方式中，激素类型的成分胰岛素和氢化可的松在本发明中需要控制其添加的量的范围要比较窄，因为这两种是生长激素类的功能物质，其本身是一些特定功能细胞代谢的产物，如果大量添加那么会导致干细胞向相应类型的细胞进行诱导和分化，所以这一种情形中控制其量使其满足促进生长而避免诱导的发生，添加在基础培养基中之后，调节胰岛素的浓度9～11μg/ml、氢化可的松调整为10^-5～10^-6mol/L的浓度。

并且，其中转铁蛋白是血浆中主要的含铁蛋白质，基于本发明中作为结核性供铁和调节的功能，转铁蛋白浓度的80～100μg/ml；在经过试验和观察后，转铁蛋白这一成分还可以搭配“柠檬酸铁、二甲肿酸铁、葡糖酸铁”这几种机结合性的铁盐，功能状态的铁可以辅助补充形成的结合复合体的来源。

而亚硒酸钠作为微量元素的补充，基本上控制其代谢能满足消除氧自由基的和氧化物酶的浓度即可，基本上达到8～10mg/ml大致上就已经能满足培养基的要求了。

而牛血清白蛋白的添加不能过于大量，虽然其是无血清培养基的主要添加生长因子，但是首先本身是大蛋白，对培养液的粘性影响比加大，大量添加的话容易加深培养基的粘滞力，不利于养料和流动和细胞的增殖扩散；并且其大量蛋白大量添加，会影响细胞的各项代谢；所以基本上按照干细胞的代谢环境要求，经过反复的实验和研究之后控制0.8～l.2mg/ml的终浓度即可。而相对于牛血清蛋白，纤粘连蛋白基本上控制30～40ng/ml即可。

同时，在满足上述功能成分之后，基于本发明干细胞培养的要求，不需要在额外添加其他的生长因子成分和促进成分，以避免不同的生长促进导致干细胞发身边多样性的性状产生趋势。

基于针对干细胞培养的效果要求，本发明的上述基础培养基优选采用IMEM培养基；IMEM培养基是合成的基础培养基，相比加多了几种氨基酸的量，其他的成分相比低了一些。虽然维持细胞代谢能力、并保证细胞不死的能力不如DEME等培养基，但是其自身基本上不促进增殖，不如其他的DEME等培养基，用于本发明中正好可以避免与添加的补充因子产生多向性的增殖诱导。

同时，在实施的过程中为了避免干细胞体外培养中的其他杂菌污染，在上述无血清培养基中还可以添加双抗，即80～100U/ml的青霉素及80～100mg/ml的链霉素。

本发明在上述无血清干细胞培养基的基础上，还提出上述无血清干细胞培养基在干细胞体外培养或者是定向诱导培养上的应用。采用本发明的上述无血清干细胞培养基应用时，其相对现有技术血清培养基是可以避免血清批次间的质量差异，提高细胞培养和试验结果的重复性；并避免血清所带来的外源性污染及血清组分的细胞毒性作用。并且其自身成分相对明确、质量一致且蛋白含量低，有利于提高细胞产品生产的稳定性并使细胞产品易于纯化。同时，在上述几种特定搭配维持干细胞增殖和性状程度后，可通过延长细胞的GI期或迫使细胞处于G0期而较长时间的维持细胞高密度培养，能更好地保持其干细胞特性。

为使本发明的上述实施的技术细节和过程方法能更易于本领域技术人员的理解和实施参考，同时凸显出本发明无血清干细胞培养基的性能和品质，以下通过具体的实施例进行举例说明。

实施例1

S10，配置本发明的上述无血清培养基，具体的量比配方为：

以IMEM培养基作为基础培养基，并且向其中添加上述补充因子成分，并最终控制IMEM培养基中各项补充因子的浓度分别为含转铁蛋白100μg/ml(混合添加有1mg的柠檬酸铁)、亚硒酸钠10mg/ml、牛血清白蛋白lmg/ml、胰岛素10μg/ml、纤粘连蛋白40ng/ml、氢化可的松10^-6mol/L、青霉素100U/ml及链霉素100mg/ml；

配置完成之后置于培养瓶(25ml)中保存备用。

S20，制备MSCs：将来源于人骸关节手术或下肢骨开放性手术时收集的骨髓标本(肝素抗凝处理)；其中，标本提供者中男性3人，女性2人，年龄最大者50岁，最小者28岁。每份标本按1：2的比例加在密度为1.073g/ml的pereoll分离液上2300rpm离心30min，取中层单核细胞，加入消毒PBS缓冲液，1000rpm离心10min，洗涤3次，弃上清液之后所得到的细胞体即为骨髓MSCs；

然后将所得MSCs在光学显微镜下计数，调整至1×10⁷/培养瓶(25ml)密度用于细胞培养，这里的培养瓶为步骤S10中制备的含有无血清培养基的培养瓶。

S30，将步骤S20接种有骨髓MSCs的无血清培养基的培养瓶置于37℃、5％CO₂、95％湿度的培养箱中培养。每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，3天后进行首次换液(采用半量换液)。7天后，细胞大部分贴壁时全量换液，此后每2～3天换液一次，直至细胞生长到几乎完全融合，

S40，将步骤S30中培养至融合的MSCs再次传下一代培养：步骤S30的MSCs扩增至细胞生长到几乎完全融合时倾去旧培养基，然后用PBS液漂洗2～3次后，加入0.25％的胰蛋白酶(内含0.02％EDTA)，加入量以使胰蛋白酶可以完全覆盖瓶底的细胞为准。将培养瓶置于倒置显微镜下观察，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入自制的无血清培养基，终止消化，吸管顺序轻轻吹打瓶底，倒置显微镜下观察细胞完全脱壁后，按1:2～1:3比例传代接种于25ml培养瓶，放置于37℃、5％CO₂、95％湿度的培养箱中培养，直至细胞生长到几乎完全融合时，再次进行传代；每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。

同时，为了进行对比验证本发明的上述无血清培养干细胞培养的结果，在上述步骤实施的过程中，同时采用血清培养基作为对照组进行对比，其中血清培养基采用：含10％胎牛血清、10^-6mol/L的氢化可的松、100U/ml的青霉素及100mg/ml链霉素的低糖DMEM培养基。

然后，同样按照上述步骤，在培养的过程中每日用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况。

其中，用本发明的无血清培养基和有血清培养基进行培养至第4天和第14天时的照片如图1-4，图1为血清培养基培养至第4天时显微镜拍照的照片，图2为本发明无血清培养基培养至第4天时显微镜拍照的照片；图3为血清培养基培养至第14天时显微镜拍照的照片，图4为本发明无血清培养基培养至第14天时显微镜拍照的照片。

从上述的图中可以看出，在培养的时间较短内，通常血清培养基和本发明的培养基培养的差异不大，细胞的数量多不是很多，形态上血清培养基培养的细胞形态更加多样和复杂；但是到培养时间更长至14天的拍照结果，本发明图4中培养的细胞的排布基本上致密均一，形态基本上趋于相同；而图3的血清培养基，细胞之间的间距和稀松度比图4大，而且细胞的排列的方式上稍显杂论，这个也是因为细胞的形态均一性不如图4所造成的。

同时，进一步为了验证所培养的干细胞的表型和品质，进行如下验证试验：

(1)MSCs法绘制生长曲线：

取5块96孔板，每块96孔板以5×10³/孔的密度将有血清培养组及无血清培养组的第3代细胞各接种于5个孔中，有血清培养组每孔加入含10％胎牛血清的低糖DMEM液200μl，无血清培养组每孔加入自制无血清培养基200μl，在另外没有细胞的孔中分别只加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基和自制无血清培养基各200μL作为空白对照，各5孔，置于37℃、％CO₂培养箱中培养，实验孔和对照孔每三天换液一次。

此后每天同一时间，随机抽取一板，测定光吸收(OD)值。测量时每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μL，继续在37℃、5％CO₂培养箱中培养6小时后，小心吸弃孔内液体，每孔内加入150μL的DMSO。将96孔板放置在酶联免疫检测仪上震荡20分钟，采用双波长测定法,酶联免疫测定仪设定检测波长492nm，参比波长630nm，测定OD值。检测OD值的结果如下：

(2)细胞周期检测流式细胞术分析G0/G1期、G2/M期细胞百分比。其结果如下：

从上表的结果中可以看出，血清培养组G0/G1期、G2/M期细胞百分比分别平均为39.93％、33.43％，无血清培养组分别平均为71.35％、10.1％。从对比的结果，本发明的无血清培养基培养成分相对明确、质量一致且蛋白含量低，有利于提高细胞产品生产的稳定性并使细胞产品易于纯化。而且可通过延长细胞的GI期或迫使细胞处于G0期而较长时间的维持细胞高密度培养，从而尽可能的生产目的产物，由此也可以说明无血清培养能得到更多的间充质干细胞，并更好地保持其干细胞特性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种无血清干细胞培养基，包括基础培养基和添加在该基础培养基中的补充因子，其特征在于，所述补充因子包括亚硒酸钠、转铁蛋白、牛血清白蛋白、胰岛素、纤粘连蛋白和氢化可的松。

2.如权利要求1所述的无血清干细胞培养基，其特征在于，所述补充因子还包括柠檬酸铁、二甲肿酸铁、葡糖酸铁中的一种或多种。

3.如权利要求1或2所述的无血清干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为IMEM培养基。

4.如权利要求1或2所述的无血清干细胞培养基，其特征在于，所述亚硒酸钠在基础培养基中的浓度为8～10mg/ml。

5.如权利要求1或2所述的无血清干细胞培养基，其特征在于，所述胰岛素在基础培养基中的浓度为9～11μg/ml；

和/或，所述氢化可的松在基础培养基中的浓度为10^-5～10^-6mol/L。

6.如权利要求1或2所述的无血清干细胞培养基，其特征在于，所述转铁蛋白在基础培养基中的浓度为80～100μg/ml。

7.如权利要求1或2所述的无血清干细胞培养基，其特征在于，所述牛血清白蛋白在基础培养基中的浓度为0.8～l.2mg/ml；

和/或，所述纤粘连蛋白在基础培养基中的浓度为30～40ng/ml。

8.如权利要求1或2所述的无血清干细胞培养基，其特征在于，基础培养基中还添加有青霉素和链霉素，且所述青霉素的浓度为80～100U/ml、链霉素的浓度为80～100mg/ml。

9.如权利要求1至8任一项所述的无血清干细胞培养基在干细胞培养中的应用。