CN105087481A - 无血清培养基及干细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种无血清培养基，包括基础培养基，胰岛素、含铁的食品添加剂、亚硒酸钠、纤粘连蛋白、胰高血糖素、肝细胞生长因子和青链霉素等。同时，本发明还公开了一种干细胞的培养方法，包括如下步骤：获取干细胞，采用本发明提供的无血清培养基进行体外培养。通过本发明提供的无血清培养基所获得的细胞，不仅可避免血清培养基所携带的病原体污染造成纯化细胞困难的问题，而且能够提高细胞生产的稳定性、提高细胞增殖量，以及增强细胞活性。

Description

无血清培养基及干细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，特别涉及无血清培养基及干细胞的培养方法。

背景技术

目前，在干细胞的常规培养体系中均加入了一定比例的动物血清，比较常用的是胎牛血清或新生小牛血清。血清是由很多大小不同生物分子组成的极为复杂的混合物，它对细胞在体外培养时的主要作用是提供生长因子、激素、结合蛋白，并提供保护作用。但它也含有一些不利于细胞生长的抑制因子或毒性物质，具有潜在的细胞毒性作用。血清中大量成分复杂的蛋白质，给细胞培养的标准化带来困难，同时也给细胞培养表达产品分离纯化带来很大的困难。而且动物血清可能存在动物携带的已知或未知病原体，对以后可能的临床应用构成威胁，对用于规模化培养干细胞增加了难度。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中利用动物血清培养细胞存在一定的毒性作用及病原体污染等缺陷，提供一种无毒性且无污染的无血清培养基。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种无血清培养基，包括基础培养基，还包括胰岛素、含铁的食品添加剂、亚硒酸钠、纤粘连蛋白、胰高血糖素、肝细胞生长因子和青链霉素。

在本发明提供的无血清培养基中，所述含铁的食品添加剂包括转铁蛋白、柠檬酸铁、二甲胂酸铁和葡糖酸铁中的一种或多种。

在本发明提供的无血清培养基中，所述无血清培养基中，亚硒酸钠的浓度为5-20μg/ml、含铁的食品添加剂的浓度为2-10μg/ml、胰岛素的浓度为2-10μg/ml、纤粘连蛋白或层粘连蛋白的浓度为0.1-2μg/ml、胰高血糖素的浓度为1-10μg/ml、肝细胞生长因子的浓度为10-30ng/ml，以及青链霉素的浓度为20-200U/ml。

在本发明提供的无血清培养基中，还包括表皮生长因子和HEPES。

在本发明提供的无血清培养基中，所述表皮生长因子的浓度为10-30ng/ml和HEPES的浓度为5-20mmol/l。

在本发明提供的无血清培养基中，还包括氢化可的松、地塞米松和雌激素三者中的一种。

在本发明提供的无血清培养基中，所述氢化可的松的浓度为6-10nmol/l，或，地塞米松的浓度为0.1-2nmol/ml，或，雌激素的浓度为1-10nmol/l。

在本发明提供的无血清培养基中，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

本发明进一步提供一种干细胞的培养方法，包括如下步骤：

获取干细胞，采用上述的无血清培养基进行体外培养。

实施本发明提供的无血清培养基及干细胞的培养方法，可以达到以下有益效果：1、采用无血清培养基能够避免现有技术存在血清批次间的质量差异，提高细胞培养和试验结果的重复性；2、可避免现有技术存在的血清所带来的外源性污染及血清组分的细胞毒性作用；3、能够避免不明的血清组分对细胞培养及试验研究的影响；4、成份相对明确、质量一致且蛋白含量低，有利于提高细胞产品生产的稳定性并使细胞产品易于纯化；5、能够延长细胞的GI期或迫使细胞处于G0期而较长时间的维持细胞高密度培养，从而尽可能的生产目的产物，并更好地保持干细胞的特性。

具体实施方式

为解决现有技术中采用含有动物血清的培养基培养干细胞血清组分存在易产生毒性作用，并携带有病原体且细胞分离纯化困难等缺陷，本发明的创新点在于提供一种无血清培养基，通过在培养基中加入能够替代血清的补充因子，从而实现了无污染培养干细胞，提高细胞产品生产稳定性的目的。

本发明提供的一种无血清培养基，包括基础培养基、胰岛素、含铁的食品添加剂、亚硒酸钠、纤粘连蛋白、胰高血糖素、肝细胞生长因子和青链霉素。

其中，基础培养基中的葡萄糖是细胞生长增殖以及产物表达过程中的重要能量来源，优选地，基础培养基为DMEM/F12培养基，该DMEM/F12培养基中含有极其丰富和复杂的细胞生长所需的营养物质，能够支持多种类型细胞在无血清的培养基中生长。

胰岛素能够促进细胞利用葡萄糖和蛋白质，促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是非常重要的细胞存活因子；优选地，无血清培养基中，胰岛素的浓度为2-10μg/ml。

微量元素铁是细胞生长增殖所必需的，含铁的食品添加剂可以为转铁蛋白、柠檬酸铁、二甲胂酸铁和葡糖酸铁中的一种或多种；优选地，含铁的食品添加剂为转铁蛋白，因为大多数哺乳动物细胞上均存在特定的转铁蛋白受体，转铁蛋白受体与转铁蛋白复合物结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源，此外，转铁蛋白还具有生长因子的性质并能与其他微量元素如钒等结合，为细胞生长增殖提供必需的微量元素。优选地，无血清培养基中，含铁的食品添加剂的浓度为2-10μg/ml。

进一步地，在细胞培养过程中，基础培养基中的酪氨酸、色氨酸、核黄素、抗坏血酸盐等会产生大量的过氧化氢，过氧化氢是细胞生长和克隆的主要毒性物质，会引起细胞膜上的饱和脂肪酸、细胞蛋白质氧化和/或DNA损伤而导致细胞死亡。因此，在本发明提供的无血清培养基中加入适量的亚硒酸钠，亚硒酸钠中的微量元素硒参与谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物歧化酶的作用过程，从而能够消除氧化物酶和氧自由基对细胞的伤害；优选地，该无血清培养基中，亚硒酸钠的浓度为5-20μg/ml。

此外，许多动物细胞必须贴壁才能生长，而无血清培养基中，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子，细胞往往以悬浮形式生长，而不利于细胞增殖。因此，通过在无血清培养基中加入促贴壁物质来弥补这一缺陷，促贴壁物质一般为细胞外基质，可以是纤粘连蛋白或层粘连蛋白等，同时，促贴壁物质还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化起重要作用。优选地，促贴壁物质为纤连蛋白，主要促进中胚层细胞的贴壁与分化；无血清培养基中，纤粘连蛋白或层粘连蛋白的浓度为0.1-2μg/ml。

胰高血糖素能够参与细胞的糖代谢、脂类代谢等，调节细胞的增值与功能表达；优选地，胰高血糖素的浓度为1-10μg/ml。

肝细胞生长因子能够刺激细胞的增殖分化；优选地，肝细胞生长因子的浓度为10-30ng/ml。

青链霉素通过与细菌的核糖体相结合，从而抑制细菌内蛋白质的合成而导致细菌死亡，可预防细菌的生长，且青链霉素的毒性作用较小，可忽略对细胞生长增殖的影响；优选地，青链霉素的浓度为20-200U/ml。

综上所述，本发明提供的无血清培养基不仅可避免血清培养基培养细胞所造成的病原体污染，以及细胞分离纯化等问题，而且能够促进细胞的生长增殖。

进一步地，本发明提供的无血清培养基还包括表皮生长因子等多肽类生长因子，以及HEPES(中文名：羟乙基哌嗪乙硫磺酸，2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonicacid，)，这些物质对于细胞的生长增殖均具有积极地促进作用。其中，多肽类生长因子能够刺激细胞的增殖分化；HEPES能够补偿无血清造成的缓冲能力下降，以维持细胞生长所需的酸碱度；优选地，表皮生长因子的浓度为10-30ng/ml、HEPES的浓度为5-20mmol/l。

进一步地，本发明提供的无血清培养基还包括氢化可的松、地塞米松和雌激素三者中的一种，能够参与细胞的糖代谢、脂类代谢等，调节细胞的增值，促进细胞功能表达。优选地，氢化可的松的浓度为6-10nmol/l，或，地塞米松的浓度为0.1-2nmol/ml，或，雌激素的浓度为1-10nmol/l。

本发明进一步提供一种干细胞的培养方法，在本实施例中，干细胞为间充质干细胞，当然本发明的无血清培养基也可应用于其他类型的干细胞，本实施例间充质干细胞的培养方法包括如下步骤：

1)获取间充质干细胞；

2)采用本发明提供的无血清培养基进行体外扩增培养。

其中，步骤1)获取间充质干细胞的过程为：

取人骸关节或下肢骨骨髓标本，肝素抗凝，按1:2的比例加在密度为1.073g/ml的peroll分离液上2300rpm离心30min，取中层单核细胞，加入PBS缓冲液，1000rpm离心10min，洗涤3次，弃上清液。所得原代间充质干细胞在光学显微镜下计数，调整至1×10⁷个/培养瓶(25ml)密度用DMEM/F12培养基进行培养。

可以理解的是，以上仅为本发明提供的其中一种获取间充质干细胞的途径，现有技术中，间充质干细胞的获取方式同样适用于本发明。

步骤2)具体过程为：

当步骤1)中的细胞生长到几乎完全融合时，倾去旧培养基，用PBS液漂洗2～3次，倾去PBS液，加入0.25％的胰蛋白酶(内含0.02％EDTA乙二胺四乙酸)消化，加入量以使胰蛋白酶可以完全覆盖瓶底的细胞为准。将培养瓶置于倒置显微镜下观察，见胞质回缩，细胞间隙增大后，加入本发明提供的无血清培养基，终止消化，吸管顺序轻轻吹打瓶底，倒置显微镜下观察细胞完全脱壁后，按1:2～1:3比例传代接种于25ml培养瓶，放置于37℃、5％CO₂、95％湿度的培养箱中培养，直至细胞生长到几乎完全融合时，再次进行传代，每2-3天换液一次。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合本发明提供的不同无血清培养基培养间充质干细胞的实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

在该实施例中，无血清培养基的组分及各组分在无血清培养基中的浓度分别为：

DMEM/F12培养基：500mL；

胰岛素：10μg/ml；

转铁蛋白：10μg/ml；

柠檬酸铁：10μg/ml

亚硒酸钠：20μg/ml；

纤粘连蛋白：2μg/ml；

胰高血糖素：3μg/ml；

肝细胞生长因子：10ng/ml；

青链霉素：50U/ml。

实施例2

在该实施例中，无血清培养基的组分及各组分在无血清培养基中的浓度分别为：

DMEM/F12培养基：500mL；

胰岛素：6μg/ml；

转铁蛋白：7μg/ml；

亚硒酸钠：15μg/ml；

表皮生长因子：15ng/ml；

肝细胞生长因子：15ng/ml；

纤粘连蛋白：1.5μg/ml；

胰高血糖素：5μg/ml；

HEPES：l5mmol/L；

青链霉素：l20U/ml。

实施例3

在该实施例中，无血清培养基的组分及各组分在无血清培养基中的浓度分别为：

DMEM/F12培养基：500mL；

胰岛素：5μg/ml；

转铁蛋白：5μg/ml；

亚硒酸钠：10μg/ml；

表皮生长因子：20ng/ml；

肝细胞生长因子：20ng/ml；

纤粘连蛋白：1μg/ml；

胰高血糖素：4μg/ml；

HEPES：l0mmol/l；

青链霉素：l00U/ml；

地塞米松：1nmol/ml。

为进一步验证本发明提供的无血清培养基具有突出的显著性效果，以下通过具体实验进一步详细说明。

检测对象：

实验组1-3：分别对应利用本发明实施例1-3提供的无血清培养基按照上述步骤2)的方法步骤培养所获得的细胞；

对照组：采用含有10％(WT)的胎牛血清、l0mmol/lHEPES、l00U/ml青链霉素的DMEM高糖培养基代替本发明中的无血清培养基培养所获得的细胞；其中，还包括采用NaOH溶液调节培养基PH值至7.2-7.4的步骤。

一、检测实验一

MTT法检测细胞活性

取5块96孔板，每块96孔板以5×10³/孔的密度将实验组和对照组培养获得的第3代细胞各接种于5个孔板中，对照组每孔加入含10％(WT)胎牛血清的低糖DMEM液200μl，实验组1-3每孔分别加入与实施例1-3中对应的无血清培养基200μl，在另外没有细胞的孔中分别只加入含10％(WT)胎牛血清的低糖DMEM培养基和本发明提供的无血清培养基各200μL作为空白对照，各5孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，实验孔和对照孔每三天换液一次。

此后每天同一时间，随机抽取一板，测定光吸收(OD)值。测量时每孔加入20μL的5mg/mlMTT溶液，继续在37℃，5％CO₂培养箱中培养6小时后，小心吸弃孔内液体，每孔内加入150μL的DMSO(二甲基亚砜)。将96孔板放置在酶联免疫检测仪上震荡20分钟，采用双波长测定法，酶联免疫测定仪设定检测波长492nm，参比波长630nm，测定OD值，根据测得的OD值来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。

表1：

天数	实验组1	实验组2	实验组3	对照组	空白对照组
						1	0.0564±0.0208	0.0565±0.0218	0.0567±0.0228	0.0562±0.0141	0.0142±0.0003
2	0.0795±0.0177	0.0810±0.0181	0.0832±0.0187	0.0781±0.0131	0.0168±0.0023
						3	0.1157±0.0202	0.1232±0.0212	0.1267±0.0222	0.0793±0.0241	0.0152±0.0057
4	0.1607±0.0184	0.1702±0.0211	0.1717±0.0214	0.1462±0.0156	0.0157±0.0021
						5	0.2879±0.0158	0.3043±0.0160	0.3079±0.0167	0.2111±0.0189	0.0145±0.0033
6	0.3566±0.0129	0.4531±0.0131	0.4576±0.0133	0.3028±0.0233	0.0149±0.0085
						7	0.7357±0.0141	0.8051±0.0148	0.8097±0.0151	0.4281±0.0296	0.0152±0.0027
8	1.605±0.0161	1.6592±0.0159	1.6655±0.0156	0.7362±0.0135	0.0149±0.0051
						9	1.7073±0.0165	1.8126±0.0169	1.8173±0.0170	1.0376±0.0189	0.0577±0.0044
14	1.7577±0.0112	1.7928±0.0118	1.8015±0.0122	0.9329±0.0128	0.0589±0.0033

检测结果：由表1中的数据可知，实验组1-3的OD值均大于对照组，由此可知，通过本发明提供的无血清培养基所获得的间充质干细胞数量较多，且活细胞数量较多，活性较高。

检测实验二、细胞周期检测

分别取实验组和对照组培养第14天所获得的细胞，经流式细胞术分析G0/G1期、G2/M期细胞百分比，分别各取5组标本进行检测分析。

表2：

检测结果：由表2可知，实验组1-3中，G₀/G₁期和G₂/M期细胞百分比均大于对照组；由此可知，实验组1-3通过无血清培养基所获得的活细胞数量多于对照组通过血清培养基所获得的活细胞数量，且实验组G₀/G₁期细胞百分比远大于G₂/M期，由此说明，本发明提供的无血清培养基能够延长细胞的G₀/G₁期而较长时间的维持细胞高密度的培养，在相应诱导剂的刺激作用下，有利于间充质干细胞转化成更多的目的产物。

综上所述，本发明提供的无血清培养基，通过在基础培养基中加入补充因子代替血清，不仅可避免血清所带来的外源性污染以及血清组分的细胞毒性作用，而且能够避免不明血清组分对细胞培养及试验研究的影响；除此之外，无血清培养基成分比较明确、质量一致，有利于提高细胞产品生产的稳定性，提高细胞培养和试验结果的重复性，并且易于纯化细胞产品；另外，本发明提供的无血清培养还有利于延长细胞的G₀/G₁期，在细胞诱导剂的刺激作用下，有利于分化出较多的目的产物。

以上结合本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (9)

1.一种无血清培养基，包括基础培养基，其特征在于：还包括胰岛素、含铁的食品添加剂、亚硒酸钠、纤粘连蛋白、胰高血糖素、肝细胞生长因子和青链霉素。

2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述含铁的食品添加剂包括转铁蛋白、柠檬酸铁、二甲胂酸铁和葡糖酸铁中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述无血清培养基中，亚硒酸钠的浓度为5-20μg/ml、含铁的食品添加剂的浓度为2-10μg/ml、胰岛素的浓度为2-10μg/ml、纤粘连蛋白的浓度为0.1-2μg/ml、胰高血糖素的浓度为1-10μg/ml、肝细胞生长因子的浓度为10-30ng/ml以及青链霉素的浓度为20-200U/ml。

4.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，还包括表皮生长因子和HEPES。

5.根据权利要求4所述的无血清培养基，其特征在于，所述表皮生长因子的浓度为10-30ng/ml，以及HEPES的浓度为5-20mmol/l。

6.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，还包括氢化可的松、地塞米松和雌激素三者中的一种。

7.根据权利要求6所述的无血清培养基，其特征在于，所述氢化可的松的浓度为6-10nmol/l，或，地塞米松的浓度为0.1-2nmol/ml，或，雌激素的浓度为1-10nmol/l。

8.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12培养基。

9.一种干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

获取干细胞，采用如权利要求1-8任一项所述的无血清培养基进行体外培养。