CN106350490A - 利用无血清培养基从成纤维细胞中获得神经细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用无血清培养基从成纤维细胞中获得神经细胞的方法，主要涉及向细胞的基础培养基中添加少量代血清添加剂、酪氨酸激酶类生长因子以及小分子化合物，获得一种新型的无血清培养基，以及使用该新型无血清培养基将不同来源的体细胞直接转分化为神经细胞的方法。利用本发明制得的无血清培养基可以在不借助外源性转录因子高表达的条件下，将不同来源的体细胞直接转分化为神经细胞。为今后神经细胞在临床疾病治疗中应用提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及神经细胞转分化技术领域，具体地，本发明主要涉及向细胞的基础培养基中添加少量代血清添加剂、酪氨酸激酶类生长因子以及小分子化合物，获得一种新型无血清培养基，以及使用该新型无血清培养基直接转分化获得神经细胞的方法。
背景技术
近几十年以来，得益于小分子药物的大力发展和广泛应用，过去一些严重危害人类健康的疾病能够得到很好的治疗，人均寿命和身体素质都有了很大的飞跃。目前，危害人类健康的疾病的结构已经产生了变化：伴随着衰老而来的一些慢性退行性疾病如帕金森综合症、阿尔茨海默病，糖尿病等逐渐成为危害现代人健康的疑难病症。由于神经细胞的再生能力很差，神经退行性疾病(Neurodegenerative Diseases)如帕金森病、阿尔茨海默病，以及神经系统损伤性疾病如脊髓损伤、脑损伤等已经成为危害人类健康的重要疾病类型之一。以阿尔兹海默病(Alzheimer’s Disease,AD)为例：在欧美国家，每年因阿尔兹海默病死亡的人数约10万，列于冠心病、癌症和中风后，是第四大致死原因。在中国，对阿尔兹海默病的流行病学调查尚不完善，一般认为65岁以上人群中患病率约为4％，发病率为0.6～1.2％。随着老龄化社会进程的加剧，预计到2050年我国阿尔兹海默病的患者将超过3000万，预期医疗费用超过1万亿。针对阿尔兹海默病的发病机制研究者提出过多种理论，并研制出包括AChE抑制剂、胆碱前体等在内的多种药物。不幸的是，虽然这些药物可以改善患者胆碱能神经的功能障碍，但是并不能根治疾病。其他神经退行性疾病的治疗中也有类似的困境。因此，在继续研究这些神经退行性疾病的发病机理并开发新型小分子药物的同时，也需要从其他新的角度(如以干细胞为基础的再生医学)为神经退行性疾病的治疗开辟新的治疗途径。
由于神经退行性疾病一般伴随着大脑特定区域的迟发性神经细胞退行性病变、细胞丢失等特征，因此可以通过移植神经细胞来缓解症状或者治疗疾病。但是，由于神经细胞的细胞结构相对复杂且亚型众多，难以直接从体内分离神经细胞。即使成功分离出神经细胞，也一般不具备扩增能力，因此很难获得足够数量的神经细胞来开展移植实验和治疗。由于神经干细胞具有一定的自我增殖能力，并能够分化为神经系统中主要类型的细胞，因此在神经退行性疾病的治疗中可以发挥更有效的作用。目前，体内来源的神经干细胞在帕金森病，脊髓损伤等疾病模型的治疗中都取得了不错的效果。美国的Stem Cells公司在瑞典获得批准使用胎脑来源的神经干细胞进行脊髓损伤的I/II期临床使用。NeuroGeneration公司获得美国FDA批准利用病人自身的神经干细胞在体外进行培养后进行I/II期临床实验。然而，目前国际上用于临床前研究的神经干细胞多是从流产胎儿的脑或脊髓中分离，涉及来源不足、伦理争议及免疫排斥等问题，很难大面积推广。因此，依耐体内获得神经细胞的移植治疗在很大程度上受限于细胞来源问题。
干细胞领域的发展为人类治疗疾病提供了一条新的途径：从人体内分离出特定的细胞，在体外的一定条件下进行扩增和转换为目的细胞，并在移植回体内后修复或者替换受损的组织和器官，从而达到疾病治疗的目的(Li等，How far are induced pluripotentstem cells from the clinic？Ageing research reviews(2010)9(3):257-64；Grabel,Prospects for pluripotent stem cell therapies:into the clinic and back to thebench.J Cell Biochem(2012)113(2):381-7)。研究者曾经计划使用胚胎干细胞(ESCs)体外分化获得神经干细胞或者神经细胞，但是由于胚胎干细胞来源不足、面临伦理争议、免疫排斥以及成瘤风险，这一计划离实际应用有一段很大的距离。2006年诱导多能干细胞技术(iPS技术)的建立，使来源不足、伦理争议以及免疫排斥等问题都在很大程度上都得到了解决(Takahashi等，Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic andadult fibroblast cultures by defined factors.Cell(2006)126(4):663-76)。而2010年神经转分化技术的建立则可以有效规避成瘤性风险(Vierbuchen等，Direct conversionof fibroblasts to functional neurons by defined factors.Nature(2010)463(7284):1035-41)。这样，以干细胞为基础的再生医学有望成为治疗部分疾病尤其是神经退行性疾病的重要手段。
综上所述，体外获得神经细胞或者神经干细胞有两种途径：1)利用iPS技术将体细胞变为多能干细胞，再通过定向分化获得神经细胞或者神经干细胞；2)直接利用转分化技术从体细胞出发获得神经细胞或者神经干细胞。早在1973年，Eguchi和Okada就提出了转分化(transdifferentiation)的概念，其是指一种分化完全的细胞丢失其原有表型而转变为其他类型细胞的现象。此后，不同的细胞类型转换被科学家发现或者实现：胚胎成纤维细胞转换成具有收缩特性的肌细胞，在成年蝾螈四肢再生过程中，皮肤、肌肉和软骨细胞先转换为祖细胞，B淋巴细胞转换为巨噬细胞，耳蜗细胞转换成功能性的听觉细胞(Izumikawa等Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapyin deaf mammals.Journal(2005)11(Issue):271-6.)。2008年，Zhou等以Ngn3，Pdx1和Mafa三个因子为主的诱导体系可将20％的胰岛外分泌细胞转化为类似于β-胰岛细胞的细胞。在神经转分化方面，国内外也已经取得了一定的研究进展：2010年，美国科学家成功将小鼠成纤维细胞诱导成为神经细胞(Vierbuchen等，Direct conversion of fibroblasts tofunctional neurons by defined factors.Nature(2010)463(7284):1035-41)。随后，将不同体细胞诱导成为神经细胞以及神经干细胞的技术也逐渐建立了起来(Sheng等，Directreprogramming of Sertoli cells into multipotent neural stem cells by definedfactors.Cell Res(2011)22(1):208-18；Wang等，Generation of integration-freeneural progenitor cells from cells in human urine.Nat methods(2012)10(1):84-89)。
虽然通过转分化获得神经元/神经干细胞的方法相比于采用ES/iPS细胞体外分化来说能够一定程度上规避成瘤风险，且在获得目标细胞的周期上会更短，但是，目前大部分的转分化方法也同样需要借助于在细胞内过表达某几个转录因子而实现，这需要借助于病毒载体等来实现，因此引入了安全性问题，离实际临床应用仍然有一定的距离。如果能通过化学小分子或其他无需向细胞内导入基因的方法来实现转分化，则以上问题能够得到解决。2012年，我国科学家利用附加体(episomal)在人尿液细胞中导入多个因子，获得了无基因组整合的神经前体细胞。2014年，我国科学家利用小分子化合物以及低氧环境直接将小鼠和人类的体细胞转分化成为神经干细胞(Cheng等,Generation of neural progenitorcells by chemical cocktails and hypoxia.Cell Res(2014)24(6):665-79)，在这方面取得了重要突破。
然而，通过以上两种方法转分化获得的神经干细胞都面临着两大问题：其一，效率较低或获得的神经干细胞难以纯化，例如采用小分子加低氧环境诱导而来的神经干细胞需要在体外多次传代才能得以纯化和稳定。其二，所需的周期还是较长。另外，从安全性上考虑，通过神经干细胞的移植来治疗神经系统疾病是否具有致瘤性还并没有被完全确定。
针对利用转分化技术获得神经细胞中出现的种种问题，在本发明中，向基础的细胞培养基中添加少量酪氨酸激酶类生长因子以及小分子化合物，我们实现不同种属的不同类型细胞向神经元的转分化，得到的神经元可以表达神经特异性标记蛋白β-tublinⅢ，GABA，Glutamate等。该方法不需要借助外源转录因子的高表达，有效地避免了转分化过程对于基因组产生的影响，并且我们的方法是目前所有报道中实验周期最短的之一。本方法能够直接获得没有增殖能力的神经元，因此没有致瘤性的安全考虑。该方法能够在体外更加安全快速的获得神经元，为今后神经系统疾病的临床治疗提供技术支撑。
发明内容
为了克服现有技术的不足，
本发明的目的之一是提供一种用于将不同来源的体细胞直接转分化成为神经细胞的无血清培养基。
本发明的目的之二是提供一种利用该无血清培养基直接转分化获得神经细胞的方法。
本发明采用的技术方案为：
一种用于将不同来源的体细胞直接转分化成为神经细胞的无血清培养基，该无血清培养基包括基础培养基、代血清添加剂、酪氨酸激酶类生长因子以及小分子化合物；所述代血清添加剂包括胰岛素和转铁蛋白，所述酪氨酸激酶类生长因子包括bFGF，所述小分子化合物包括2-巯基乙醇和/或亚硒酸钠。
其中所述基础培养基为Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM),MinimalEssential Medium(MEM),Basal Medium Eagle(BME),F-10,F-12,RPMI 1640,Glasgow’sMinimal Essential Medium(GMEM),αMinimal Essential Medium(αMEM),Iscove’sModified Dulbecco’s Medium(IMDM)中的一种或两种以上的混合物。
优选地，所述基础培养基为DMEM和F12的混合物，更优选地，所述基础培养基为DMEM和F12体积比为1：1的混合物。
所述代血清添加剂为胰岛素和转铁蛋白的混合物；优选地，在最终培养基中胰岛素的浓度在5-10mg/L之间，转铁蛋白的浓度在5.5-100mg/L之间；更优选的，在最终的培养基中胰岛素的浓度为10mg/L，转铁蛋白的浓度为5.5mg/L。(其中，胰岛素为Sigma公司生产的sigma I8405(货号)或者同等产品；转铁蛋白为Sigma公司生产的sigma T0665(货号)或者同等产品。)
所述酪氨酸激酶类生长因子为bFGF；优选地，在最终培养基中bFGF的浓度在0-40ng/ml之间，但浓度不为0；更优选地，在最终培养基中bFGF的浓度为20ng/ml。
所述小分子化合物为2-巯基乙醇和/或亚硒酸钠；优选地，在最终培养基中，2-巯基乙醇的浓度在10-200μg/ml之间，亚硒酸钠的浓度在10-200μg/ml之间；更优选地，在最终培养基中2-巯基乙醇的浓度为50μg/ml，或亚硒酸钠的浓度为67μg/ml。
所述培养基还包含适于细胞生长的其它组分，其中其它组分选自L-谷氨酰胺、NEAA中的一种或两种的组合。如NEAA(100X)，GlutaMax(100X)。
本发明还提供了上述无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：
将上述配置培养基所需的代血清添加剂、酪氨酸激酶类生长因子、小分子化合物以及适于细胞生长的其它组分分别加入基础培养基中，颠倒混合均匀，同时避免产生大量泡沫(对于不同组分的加入顺序等没有要求，只是简单的混合)，配置好的培养基于4℃保存，可稳定保存2周。
其中胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠，具体保存方式参见产品说明书。酪氨酸激酶类生长因子应配置为高浓度储存液分装保存于-20℃，并避免反复冻融。
本发明还提供了将不同来源的体细胞直接转分化成为神经细胞的方法，包括如下步骤：
(a)准备不同来源的体细胞；
(b)用上述的无血清培养基，在适合于细胞生长的条件下，培养步骤(a)中的细胞，以获得神经细胞；
(c)检测并且分析经诱导获得的神经细胞；
(d)于神经细胞生长的条件下继续培养步骤(c)中的神经细胞。
上述方法中，所述体细胞来源于人、大鼠或小鼠。
上述方法中，所述体细胞为成纤维细胞、神经胶质细胞。
上述方法中，所述步骤(c)中检测并且分析经诱导获得的神经细胞包括，免疫荧光或者流式细胞分选确定在获得细胞中一个或者多个神经细胞标志物(TuJ，MAP2，NeuN等)的表达。
本发明所具有的有益效果：
利用本发明制得的无血清培养基可以在不借助外源性转录因子高表达的条件下，将不同来源的体细胞或者成体干细胞直接转分化为神经细胞。
附图说明
图1为所示实现小鼠胚胎成纤维细胞向神经细胞的转分化无血清培养基不同因子组合表达神经细胞标志物的细胞的百分比。通过实验数据可发现，四个因子组合所配置的无血清培养体系即A组(转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+2-巯基乙醇(终浓度50μg/ml))和B组(转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+亚硒酸钠(终浓度67μg/ml))就可以实现小鼠胚胎成纤维细胞转变成为神经细胞这一过程。而C组(转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+2-巯基乙醇(终浓度50μg/ml)+亚硒酸钠(终浓度67μg/ml)+EGF(终浓度20ng/ml))和D组(转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+2-巯基乙醇(终浓度50μg/ml)+亚硒酸钠(终浓度67μg/ml)+B27supplements(终浓度2％(体积)))则说明在这一转变过程中EGF和B27supplements都起到抑制的作用。E-K组的结果表明因子组合再次减少后转分化的效率也就越低。
图2为利用无血清培养基(转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+2-巯基乙醇(终浓度50μg/ml))培养小鼠胚胎成纤维细胞后所获得细胞表达TuJ等神经细胞标记物的情况，而Vimentin是小鼠胚胎成纤维细胞的标志物。
图3为利用无血清培养基(转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+亚硒酸钠(终浓度67μg/ml))培养小鼠胚胎成纤维细胞后所获得细胞表达TuJ等神经细胞标记物的情况，而Vimentin是小鼠胚胎成纤维细胞的标志物。
定义和技术
1.除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编著(1987))；丛书METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)：PCR 2：A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编著，(1995))，Harlow和Lane编著，(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney编著，(1987))；W.French Anderson等人，HANDBOOK OF STEM CELLS，卷2。
2.除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本文中使用的一些术语进行了下述定义。
3.所有的数字标识，例如pH、温度、时间和浓度，包括范围，都是近似值。要了解，虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。也要了解，虽然不总是明确的叙述，本文中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本领域已知的。
4.本发明所用的术语“基础培养基”是指任何能够支持细胞生长的培养基。基础培养基提供了标准的无机盐例如锌、铁、镁、钙和钾，以及维生素、葡萄糖、缓冲系统以及关键的氨基酸。可以用于本发明的基础培养基包括但不限于Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium(DMEM)、Minimal Essential Medium(MEM)、Basal Medium Eagle(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、αMinimal Essential Medium(αMEM)、Glasgow’s Minimal Essential Medium(G-MEM)、以及Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium。本领域的技术人员已知如何选择适用于所培养的细胞的基础培养基。在优选的实施方案中，基础培养基是DMEM与F12的混合物。在更优选的实施方案中，基础培养基是DMEM与F12体积比1：1的混合物。
5.根据本发明的无血清培养基是通过本领域技术人员已知的常规技术制备的，如Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)中所述的混合配制血清的技术和条件。
6.本文中所用的术语“体细胞”是相对于“生殖细胞”以及“胚胎干细胞”而言的概念，其是由“胚胎干细胞”分化或内细胞团继续发育产生的不再具备多能性，一般具有具体功能的细胞，其一般从发育阶段位于囊胚期(在小鼠中具体为受精后3.5天)之后的胎鼠或成鼠取材，取材时一般避免取到可能具有多能性的生殖细胞及其来源(如精原干细胞、生殖嵴干细胞等)。本文中所用的体细胞优选来源于人、大鼠或小鼠，更优选地，来源于小鼠。本文中的体细胞可以是机体内任何类型的体细胞，优选为成纤维细胞、神经胶质细胞。
7.本文所述的术语“转分化”(有时也称为“重编程”)是指一种分化完全的细胞丢失其原有表型而转变为其他类型细胞的现象，且这一转变不经过多能干细胞的中间过程。在本发明中，“转分化”指将不同来源的体细胞或者成体干细胞转变为神经细胞的过程。优选为将成纤维细胞、神经胶质细胞以及间充质干细胞转变为神经细胞。更优选为小鼠胚胎成纤维细胞、大鼠神经胶质细胞以及人类骨髓来源间充质干细胞转变为神经细胞。最优选为小鼠胚胎成纤维细胞。
8.本文所述的“适宜细胞生长的条件”是本领域的常规干细胞培养条件，并且包括一些适宜各个具体细胞系，但是不影响细胞基本性质的修饰，培养方法以及培养条件参见W.French Anderson等人，HANDBOOK OF STEM CELLS，卷2。
9.本文所述的检测神经细胞的方法是本领域技术人员熟知的，参见例如Vierbuchen等，Direct conversion of fibroblasts to functional neurons bydefined factors.Nature(2010)463(7284):1035-41)等。所述方法包括免疫荧光染色、流式细胞分选和电生理测试等。
10.除了特别说明,本文中提及的各种试剂均来自英杰生命科学公司(Invitrogen)或者西格玛公司(Sigma)。
具体实施方式
下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。
本发明中所用技术概述：
1.小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的分离与培养
取孕龄13-14天的小鼠，颈椎脱臼处死，浸泡在0.5％新洁尔灭中30s，取出后，将其固定在无菌的铺有吸水纸的解剖盘上，腹面向上。用75％的乙醇清洁孕鼠腹部，防止腹毛黏附在子宫及其他腹腔脏器上，造成污染。用无菌手术器械剖开孕鼠腹部皮肤层，肌肉层，暴露小鼠腹腔。用新的无菌手术器械去除黏连到子宫上的脂肪和结缔组织，迅速将小鼠子宫取出。将其放入预装有含双抗的PBS的10cm培养皿中。在超净工作台内，用含双抗的PBS洗涤小鼠子宫3次。用无菌眼科剪剪开包膜，将小鼠胚胎与胚外组织分离，将胚胎放置于新的预装有含双抗PBS的10cm培养皿中。用弯头眼科剪将小鼠胚胎剪至1-3mm3大小。向培养皿中加入适量0.25％和0.05％混合的胰蛋白酶，37℃条件下，消化10min，至溶液变浑浊，加入等体积MEF细胞培养基，终止消化。轻轻吹打混匀5-10次，静置。将细胞悬液转移至50ml离心管中，200g，离心5min。弃上清，向沉淀中加入MEF细胞培养基，轻轻吹打重悬，将细胞分种到15cm培养皿中，补充适量培养基，混匀，于37℃，5％CO2条件下培养。于第二天，观察细胞状态，更换新鲜培养基，标记细胞代数为P0。MEF细胞培养基(500ml)包含：高糖DMEM培养基430ml，FBS 60ml，GlutaMax和NEAA各5ml。
2.MEF细胞冻存
吸弃培养基，用DPBS洗涤细胞一次，加入适量0.25％胰蛋白酶，37℃条件下消化1-2min，加入等量MEF细胞培养基，终止消化。用巴氏吸管吹散细胞，将细胞悬液转移至15ml离心管中，200g离心5min。弃上清，用MEF细胞培养基重悬细胞，吸取少量细胞进行计数，其余细胞重新离心。配置冻存液，冻存液成分为，10％DMSO+90％FBS。用冻存液重悬细胞，调整细胞浓度至3×106个/ml，每只冻存管加入0.5ml细胞悬液，标记冻存细胞名称，代数及冻存时间。将冻存管放入程序降温盒中，放于-80℃冰箱中进行过夜冻存。于第二天将冻存管取出，放入液氮中进行长期低温保存。
3.MEF细胞转分化
从液氮管中取出冻存管，于37℃水浴快速振荡解冻，解冻后，用吸水纸擦去水滴。用75％酒精对冻存管外壁进行消毒后放入生物安全柜，于生物安全柜内吸取细胞悬液加入到15ml离心管中。逐滴加入MEF细胞培养液6ml，边加边振荡，200g，离心5min。弃上清，加入MEF培养基重悬，并将细胞转移到培养皿中，摇动铺匀后，与37℃，5％CO2条件下培养，待细胞长满10cm培养皿80％时传代培养。
将于BD公司购买的Matrigel于冰上放置，低温解冻。待解冻后，分装Matrigel至无菌EP管中，280ul/支，于-80℃条件下保存。使用时，将EP管于-80℃中取出，于冰上解冻，解冻时间约为30-50min。待Matrigel解冻后，取45ml 4℃预冷的F12培养基，从中取少量加入到EP管中，反复吹打，吹打次数约为50次，将280ul Matrigel充分溶于45ml F12培养基中，放于4℃保存，待用。使用时，在细胞培养板中加入Matrigel，覆盖培养板底部，置于37℃条件下30min以上。
吸弃培养基，用DPBS洗涤细胞一次，加入1ml 0.25％胰蛋白酶，37℃条件下消化3min，加入2ml MEF细胞培养基，终止消化。用巴氏吸管吹散细胞，将细胞悬液转移至15ml离心管中，200g离心5min。弃上清，用MEF细胞培养基重悬细胞，细胞计数，并调整细胞浓度。对于24孔板，每孔种MEF细胞1×104个，6孔板每孔种细胞5×104至8×104个，待细胞贴壁完全后(12-24小时)，更换本发明的无血清培养基，此时标记天数为D0。
利用无血清培养基培养细胞16天，每天观察细胞状态，拍摄明场照片，记录细胞形变情况。每48小时更换一次新鲜的无血清培养基，更换培养基前需提前将培养基置于室温进行预热。记录培养天数，培养天数为D0至D16。
4.免疫荧光染色鉴定神经细胞
将处理过的盖玻片取出，于超净工作台内，用酒精灯点燃盖玻片上的残余无水乙醇，进行轻度灼烧灭菌。将盖玻片方置于在24孔板中。将Matrigel铺于盖玻片上，并将MEF细胞接种于盖玻片上。按照上述方法进行接种和培养，于D24取出24孔板。用PBS洗涤细胞一次，吸弃PBS，加入4％多聚甲醛进行固定，室温固定30min。固定结束后，用PBS洗涤3次，每次5min。利用0.3％Triton-X100(PBS配置)进行通透，室温通透20min。通透结束后，加入3％BSA(PBS配置)溶液室温封闭2h，PBS洗涤3次，每次5min。封闭结束后。向盖玻片中滴加一抗(稀释比例按照抗体说明书所提供，PBS+1％BSA稀释)200ul，4℃孵育过夜。用PBS洗涤3次，每次5min，洗去残余一抗。加入二抗(Invitrogen1：400稀释，PBS稀释)200ul，避光，室温孵育1h。用PBS洗涤三次，每次5min，洗去残余二抗。加入DAPI(终浓度为1μg/ml，PBS稀释)染液，对细胞核进行染色，避光，室温5min，PBS洗涤三次，每次5min。洗去残余DAPI后，用封片剂封片，倒置荧光显微镜下观察，拍照记录。
实施例1：实现小鼠胚胎成纤维细胞向神经细胞的转分化无血清培养基的成分优化。因子组合如下：
A：转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+2-巯基乙醇(终浓度50μg/ml)
B：转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+亚硒酸钠(终浓度67μg/ml)
C：转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+2-巯基乙醇(终浓度50μg/ml)+亚硒酸钠(终浓度67μg/ml)+EGF(终浓度20ng/ml)
D：转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+2-巯基乙醇(终浓度50μg/ml)+亚硒酸钠(终浓度67μg/ml)+B27supplements(终浓度2％(体积))
E：转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)
F：胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+2-巯基乙醇(终浓度50μg/ml)
G：胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+亚硒酸钠(终浓度67μg/ml)
H：转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+2-巯基乙醇(终浓度50μg/ml)
I：转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+亚硒酸钠(终浓度67μg/ml)
J：转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+2-巯基乙醇(终浓度50μg/ml)
K：转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+亚硒酸钠(终浓度67μg/ml)
| 转铁蛋白 | 胰岛素 | bFGF | 2-巯基乙醇 | 亚硒酸钠 | EGF | B27 | |
| A | 5.5ng/ml | 10ng/ml | 20ng/ml | 50μg/ml | 0 | 0 | 0 |
| B | 5.5ng/ml | 10ng/ml | 20ng/ml | 0 | 67μg/ml | 0 | 0 |
| C | 5.5ng/ml | 10ng/ml | 20ng/ml | 50μg/ml | 67μg/ml | 20ng/ml | 0 |
| D | 5.5ng/ml | 10ng/ml | 20ng/ml | 50μg/ml | 67μg/ml | 0 | 2％ |
| E | 5.5ng/ml | 10ng/ml | 20ng/ml | 0 | 0 | 0 | 0 |
| F | 0 | 10ng/ml | 20ng/ml | 50μg/ml | 0 | 0 | 0 |
| G | 0 | 10ng/ml | 20ng/ml | 0 | 67μg/ml | 0 | 0 |
| H | 5.5ng/ml | 10ng/ml | 0 | 50μg/ml | 0 | 0 | 0 |
| I | 5.5ng/ml | 10ng/ml | 0 | 0 | 67μg/ml | 0 | 0 |
| J | 5.5ng/ml | 0 | 20ng/ml | 50μg/ml | 0 | 0 | 0 |
| K | 5.5ng/ml | 0 | 20ng/ml | 0 | 67μg/ml | 0 | 0 |
如图1所示实现小鼠胚胎成纤维细胞向神经细胞的转分化无血清培养基不同因子组合表达神经细胞标志物的细胞的百分比。通过实验数据可发现，四个因子组合所配置的无血清培养体系即A组(转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+2-巯基乙醇(终浓度50μg/ml))和B组(转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+亚硒酸钠(终浓度67μg/ml))就可以实现小鼠胚胎成纤维细胞转变成为神经细胞这一过程。而C组(转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+2-巯基乙醇(终浓度50μg/ml)+亚硒酸钠(终浓度67μg/ml)+EGF(终浓度20ng/ml))和D组(转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+2-巯基乙醇(终浓度50μg/ml)+亚硒酸钠(终浓度67μg/ml)+B27supplements(终浓度2％(体积)))则说明在这一转变过程中EGF和B27supplements都起到抑制的作用。E-K组的结果表明因子组合再次减少后转分化的效率也就越低。
实施例2：利用如下的无血清培养基实现小鼠胚胎成纤维细胞向神经细胞的转分化。
如前所述，一种无血清培养基(最优化的无血清培养基)，以DMEM和F12和混合培养基(体积比1：1)为基础，添加：胰岛素(终浓度10ng/ml)，转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)，bFGF(终浓度20ng/ml)，2-巯基乙醇(终浓度50μg/ml)或亚硒酸钠(终浓度67μg/ml)以及细胞培养辅助成分：NEAA(100X)，GlutaMax(100X)制得。
在利用最优化的无血清培养基培养小鼠胚胎成纤维细胞16天之后，利用免疫荧光的方法可以发现获得表达神经细胞标志物的神经细胞。
如图2所示，利用无血清培养基(转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+2-巯基乙醇(终浓度50μg/ml))培养小鼠胚胎成纤维细胞后所获得细胞可以表达TuJ等神经细胞标记物，而Vimentin是小鼠胚胎成纤维细胞的标志物。
如图3所示，利用无血清培养基(转铁蛋白(终浓度5.5ng/ml)+胰岛素(终浓度10ng/ml)+bFGF(终浓度20ng/ml)+亚硒酸钠(终浓度67μg/ml))培养小鼠胚胎成纤维细胞后所获得细胞可以表达TuJ等神经细胞标记物，而Vimentin是小鼠胚胎成纤维细胞的标志物。
Claims (10)
1.用于将不同来源的体细胞直接转分化成为神经细胞的无血清培养基，其特征在于：该无血清培养基包括基础培养基、代血清添加剂、酪氨酸激酶类生长因子以及小分子化合物；所述代血清添加剂包括胰岛素和转铁蛋白，所述酪氨酸激酶类生长因子包括bFGF，所述小分子化合物包括2-巯基乙醇和/或亚硒酸钠。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：其中所述基础培养基为DMEM、MEM、BME、F-10、F-12、RPMI 1640、GMEM、αMEM、IMDM中的一种或两种以上的混合物。
3.根据权利要求2所述的无血清培养基，其特征在于：所述基础培养基为DMEM和F12的混合物，更优选地，所述基础培养基为DMEM和F12体积比为1：1的混合物。
4.根据权利要求1或3所述的无血清培养基，其特征在于：所述代血清添加剂为胰岛素和转铁蛋白的混合物；优选地，在最终培养基中胰岛素的浓度在5-10mg/L之间，转铁蛋白的浓度在5.5-100mg/L之间；更优选的，在最终的培养基中胰岛素的浓度为10mg/L，转铁蛋白的浓度为5.5mg/L。
5.根据权利要求4所述的无血清培养基，其特征在于：所述酪氨酸激酶类生长因子为bFGF；优选地，在最终培养基中bFGF的浓度在0-40ng/ml之间，但浓度不为0；更优选地，在最终培养基中bFGF的浓度为20ng/ml。
6.根据权利要求5所述的无血清培养基，其特征在于：所述小分子化合物为2-巯基乙醇和/或亚硒酸钠；优选地，在最终培养基中，2-巯基乙醇的浓度在10-200μg/ml之间，亚硒酸钠的浓度在10-200μg/ml之间；更优选地，在最终培养基中2-巯基乙醇的浓度为50μg/ml，或亚硒酸钠的浓度为67μg/ml。
7.权利要求1或6所述的无血清培养基，其特征在于：所述培养基还包含适于细胞生长的其它组分，其中其它组分选自L-谷氨酰胺、NEAA中的一种或两种的组合。
8.将不同来源的体细胞直接转分化成为神经细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(a)准备不同来源的体细胞；
(b)用权利要求1-7中任一项所述的无血清培养基，在适合于细胞生长的条件下，培养步骤(a)中的细胞，以获得神经细胞；
(c)检测并且分析经诱导获得的神经细胞；
(d)于神经细胞生长的条件下继续培养步骤(c)中的神经细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述体细胞来源于人、大鼠或小鼠；所述体细胞为成纤维细胞、神经胶质细胞。
10.根据权利要求的8或9中任一项的方法，其特征在于：所述步骤(c)中检测并且分析经诱导获得的神经细胞包括，免疫荧光或者流式细胞分选确定在获得细胞中一个或者多个神经细胞标志物(TuJ，MAP2，NeuN等)的表达。
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