CN116396928A - 一种原代成纤维细胞的培养体系、培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种原代成纤维细胞的培养体系、培养方法和应用，按重量百分比计，所述培养体系包括基础培养基91‑98.5％、胎牛血清0‑2％、抗生素1‑5％和添加剂0.5‑2％，所述添加剂包括多种生长因子。本发明还提供利用所述原代成纤维细胞的培养体系进行成纤维细胞的培养的培养方法，以及该培养体系在培养成纤维细胞中的应用。本发明能够实现在低血清条件下长期稳定培养成纤维细胞。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体地，涉及一种原代成纤维细胞的培养体系、培养方法和应用。
背景技术
成纤维细胞是疏松结缔组织中的主要细胞，在体外2D培养状态下通常呈长梭形或不规则的三角状，镜下可以看到明显的细胞核。成纤维细胞在培养时有较好的增殖能力，生长旺盛，并且可以分泌胶原，使其在培养时拥有较好的贴壁性能。成纤维细胞是由胚胎时期的间充质干细胞分化而来，因此成纤维细胞和间充质干细胞在培养形态、生长特性以及部分表面标志物上都有一定共性。
成纤维细胞作为疏松结缔组织中的主要细胞，主要起支持作用。此外由于成纤维细胞功能活动旺盛，具有明确的蛋白合成和分泌功能，因此成纤维细胞在众多的组织修复中发挥着重要作用，例如皮肤损伤后增生性瘢痕的产生以及骨创伤修复中纤维性骨痂的形成。也是由于其这一特性，在一些实质性器官中，由于外部损伤或慢性炎症环境引起了起支持作用的成纤维细胞过度增殖和胶原等细胞外基质的大量过度沉积，使实质性细胞的位置被成纤维细胞取代，这样的现象在肺纤维化、肝纤维化等疾病中是一种广泛存在的致病机理。
传统的培养成纤维细胞的方法是通过基础培养基和高比例血清的组合(一般10-20％)，这样的组合一般可以维持成纤维细胞的快速的增殖。但是血清的成分具体在不同批次之间有较大的不同，因此这种培养原代成纤维细胞的培养很难长期保持稳定。此外血清中微量的一些炎症因子和有害成份会引起成纤维细胞的提前老化，降低成纤维细胞的增殖数量。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种原代成纤维细胞的培养体系、培养方法和应用。
根据本发明的第一方面，提供一种原代成纤维细胞的培养体系，按重量百分比计，所述培养体系包括：基础培养基91-98.5％、胎牛血清0-2％、抗生素1-5％和添加剂0.5-2％，所述添加剂包括多种生长因子。
可选的，所述基础培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、嘌呤、嘧啶、缓冲液和pH指示剂。
可选的，所述添加剂为在4℃保存时容易分解的物质，所述添加剂以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，使用时按百分之一的量添加至所述基础培养基中。
可选的，所述多种生长因子包括重组人碱性成纤维生长因子、重组人胰岛素和人全铁转铁蛋白。
可选的，所述多种生长因子在培养体系中的浓度为：重组人碱性成纤维生长因子3-8ng/ml、重组人胰岛素3-8ug/ml、人全铁转铁蛋白5-10ug/ml。
可选的，所述抗生素包括青霉素和链霉素。
可选的，青霉素和链霉素以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，使用时按百分之一的量添加至所述基础培养基中。
根据本发明的第二方面，提供一种成纤维细胞的培养方法，该培养方法利用上述的原代成纤维细胞的培养体系进行成纤维细胞的培养。
根据本发明的第三方面，提供一种上述的原代成纤维细胞的培养体系在培养成纤维细胞中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下至少之一的有益效果：
1、本发明通过多种重组蛋白的组合使用，形成对多种成纤维细胞生长和增殖形成充足和有足够特异性的营养支持，同时利用这些多种重组蛋白对成纤维细胞的营养支持，能够降低对培养体系中添加血清量至2％甚至完全不使用血清，而血清浓度的降低可以有效的推迟成纤维发生老化的时间，更利于成纤维细胞的稳定增殖，从而更容易获得更多高活性的成纤维细胞。
2、本发明能够提高分离的成纤维细胞的高增殖能力维持的时间，增加成纤维细胞传代后维持其细胞特性的代数。利用培养基的这一特性，可以使原代分离的成纤维细胞在经过多次传代后，依旧可以维持细胞的增殖能力和分泌功能，可以更容易通过扩增获取足够量的细胞。
3、本发明通过多种重组蛋白的组合使用，使长期培养的MEF能够维持其有利于胚胎干细胞生长和未分化状态的细胞特性，在相同的传代次数后，用于胚胎干细胞培养时使胚胎干细胞能够更快的增殖并维持未分化状态。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明应用例1和对照组的细胞传代两次后的P2细胞的生长情况；
图2为本发明应用例1和对照组的细胞传代6次后的P6细胞的生长状态；
图3为本发明应用例2和对照组的胚胎干细胞房的生长情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明实施例提供一种原代成纤维细胞的培养体系，按重量百分比计，该培养体系包括：基础培养基91-98.5％、胎牛血清0-2％、抗生素1-5％和添加剂0.5-2％，其中，添加剂包括多种生长因子。
基础培养基包括了在4℃保存时不易分解的成分，在一些实施方式中，基础培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、嘌呤、嘧啶、缓冲液和pH指示剂
在上述基础培养基中，氨基酸是组成蛋白质的基本单位，是细胞蛋白质合成的原料，缺少氨基酸时细胞会发生生长不良；添加的氨基酸包括必需和非必需氨基酸，其中部分氨基酸机体无法合成被称为必需氨基酸；非必需氨基酸也可以替代细胞生长过程中耗尽的成分刺激细胞增殖。葡萄糖是用于供能的碳水化合物。维生素中的很多种是多种酶的活性基团成分，因此是细胞生长和增殖必不可少的，由于单纯的细胞无法产生足够多种类和数量的维生素，因此必须在培养基中进行添加。培养基中添加了多种无机盐成分以维持细胞的正常生理功能和细胞的渗透压，其中Na+、K+和Cl–还参与许多大分子物质的跨膜运输；Mg2+是细胞间质的重要组分和很多酶反应的辅酶；Ca2+能够调节细胞膜功能并参与多项细胞生理活动。微量元素包括铁元素等，铁元素在细胞培养中很重要，其作为辅酶发挥了多种生理作用，铁是细胞氧化代谢的关键酶琥珀酸脱氢酶的组成要素之一，在氧化和能量代谢中发挥作用，此外铁作为铁卟啉结构的核心能减少过氧化物对细胞的伤害，此外铁是RNA聚合酶的必需元素，是细胞完成DNA复制从而进行细胞增值所必需的。脂类在培养基中的添加为细胞提供适当的预成形脂质，减少了细胞对其生物合成的需要，能够促进细胞的新陈代谢，提高细胞分裂速率和代谢水平。细胞的增殖需要细胞不断地分裂，其中伴随着DNA的不断复制，嘌呤和嘧啶是DNA的基本组成物质，其添加有利于细胞DNA的快速合成，提高细胞增殖速率。缓冲液中HCO3 -主要发挥缓冲作用，降低培养基pH的变化程度。pH指示剂如酚红的主要作用是指示培养基的酸碱度，提示使用者在培养环境变化至不适宜细胞生长前进行换液。
在一优选实施方式中，基础培养基的组成如表1所示。
表1基础培养基的组成
在一些实施方式中，添加剂为在4℃保存时容易分解的物质，添加剂以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，其中工作浓度即在培养体系中的浓度，需要使用时按百分之一的量添加至基础培养基中。
在一些实施方式中，多种生长因子包括重组人碱性成纤维生长因子(bFGF)、重组人胰岛素、人全铁转铁蛋白。上述添加剂中多种生长因子的组合，能够形成对胎牛血清中营养物质依赖的降低，和对成纤维细胞有针对性的营养支持，以更长地维持体外培养的成纤维细胞的增殖时间和细胞特性。
在上述添加剂中，重组人碱性成纤维生长因子(bFGF)是一种含155个氨基酸的阳离子多肽，分子量为17KD，有很强促有丝分裂活性，能够在多种组织愈合，血管生成以及神经再生的生理活动中发挥作用，原理上来说，与其受体结合后，能够将信号传递至细胞核，通过RNA聚合酶1加强核蛋白的的转录速度，促进细胞从G0向G1和S期的转换，进而促进细胞的分离与增殖。胰岛素可以促进细胞中RNA、蛋白质、脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，维持其一定浓度可以使细胞保持较高的生长速率。人全铁转铁蛋白中的铁参与DNA的复制和细胞代谢，是一种必需元素，人全铁转铁蛋白能够为细胞补充铁元素，维持细胞的正常生长和增殖。通过上述生长因子的共同作用，促进细胞增殖，降低对血清的依赖。
在一优选实施方式中，添加剂的组成如表2所示。
表2添加剂的组成
| 组分名称 | 工作浓度 |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子 | 3-8ng/ml |
| 重组人胰岛素 | 3-8ug/ml |
| 人全铁转铁蛋白 | 5-10ug/ml |
在一些实施方式中，抗生素包括青霉素和链霉素。因为原代分离的细胞由于组织提取的过程中无法做到全程无菌，最后很难避免少量细菌的残留，培养体系中添加青霉素和链霉素两种抗生素可以极大降低原代培养的污染概率，同时不会对细胞的生长造成影响。青霉素和链霉素溶液是以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，需要使用时按百分之一的量添加至培养基中，优选地，培养体系中使用50-500U/ml的青霉素和50-500ug/ml的链霉素，此双抗浓度是常规培养原代细胞使用的浓度，高于此浓度会对部分种类的细胞增殖产生影响，而低于此浓度会更容易使原代分离时附带的极少量微生物污染爆发出来。
胎牛血清是细胞培养中的重要添加成分，含有多种细胞生长所需的生物活性成分，其在培养基中以高浓度存在时(10％-20％)会极大地促进成纤维细胞的增殖速度，但是血清中除了有利于细胞生长的多种物质，同时不可避免地会存在一些炎症因子和有害成份会引起成纤维细胞的提前老化，降低成纤维细胞的增殖数量。在一些实施方式中，胎牛血清的添加量为0％-2％。本发明实施例的培养体系中由于针对成纤维细胞的营养需求添加了添加剂中的多种重组蛋白，所以降低了成纤维细胞对血清的依赖，培养体系中血清的添加量只需要0％-2％。这种低血清的含量也可以降低血清中的有害成分对细胞增殖能力和细胞特性的影响。
本发明另一实施例提供一种成纤维细胞的培养方法，该培养方法利用上述的原代成纤维细胞的培养体系进行成纤维细胞的培养。
上述实施例通过多种重组蛋白的组合使用，形成对成纤维细胞生长和增殖形成充足和有足够特异性的营养支持，同时利用这些多种组蛋白对成纤维细胞的营养支持，降低对培养体系中添加血清量的需求，而血清浓度的降低可以有效降低血清中的有害成分对细胞增殖能力和细胞特性的影响，更利于成纤维细胞获得增殖速度上的长期扩增，从而更容易获取更多的成纤维细胞，以完成后续实验。
以具体应用例和对比例对上述实施例中的成纤维细胞的培养体系的效果进行进一步说明。
应用例1
本发明实施例利用上述的培养体系培养成纤维细胞；具体地，将培养体系用于培养小鼠胚胎成纤维细胞，包括以下步骤：
步骤1、按下述表3的浓度配制基础培养基：
表3基础培养基中组分浓度
步骤2、按下述表4的浓度配制添加剂、抗生素和血清：
表4基础培养基中添加剂、抗生素(双抗生素)和血清的浓度
| 组分名称 | 工作浓度 |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子 | 5ng/ml |
| 重组人胰岛素 | 5ug/ml |
| 人全铁转铁蛋白 | 7.5ug/ml |
| 胎牛血清 | 0.02ml/ml |
| 青霉素 | 100U/ml |
| 链霉素 | 100ug/ml |
步骤3、按上述列表配制培养基后，依照以下的步骤从分离小鼠胚胎成纤维细胞：
1.取怀孕12-15天的孕鼠，紧追脱臼处死后，放入盛有75％酒精的烧杯中浸泡100秒。
2.浸泡完成后，取出孕鼠，放入超净台的无菌培养皿中，腹部向上，用眼科剪打开腹腔，暴露出子宫。
3.找到子宫角和子宫颈，用眼科剪配合眼科镊剪断，注意不要伤到子宫内的胎鼠，取下后将整个子宫转移至另一干净的培养皿中。
4.用PBS清晰子宫数次，以去除子宫表面的血污；再次转移子宫至另一干净的培养皿中，之后剪开子宫，取出胎鼠。
5.胎鼠转移至另一装有PBS的培养皿中，清洗的同时去除胎膜和胎盘。
6.胎鼠转移至另培养皿中，小心剪去胎鼠的四肢，头部和内脏，剩余的躯干用PBS清晰1-2次。
7.在一新的培养皿中，将清洗干净的胎鼠躯干剪碎至1mm3左右的小碎块，之后将碎块转移至一个无菌的离心管中，加入组织体积10倍量的PBS震荡离心管清洗组织后，静止一会，待较大的组织块都沉底后，弃去上清液。
8.加入剩余组织体积3倍量的0.25％胰蛋白酶，离心管置于37℃的震荡水浴摇床中消化15min。
9.消化完成后，用电动移液器，吹打消化后的组织使其充分解离，之后立即加入1ml胎牛血清终止胰酶的消化。
10.消化液过70um的滤网以去除较大的细胞团快，滤液转入新的离心管中，300g离心5min，离心完成后弃去上清，用3ml PBS重悬细胞，取10ul悬液计数细胞，剩余的悬液再次，300g离心5min，离心完成后弃去上清。
11.管底的沉淀用适量的培养基悬选后，按3×105/瓶的数量接种于T-25培养瓶中，置于37℃5％CO2的培养箱中培养过夜。
12.第二天，观察瓶中细胞，有较多细胞贴壁后，弃去原有的培养基，并加2ml PBS清洗培养平面一次；之后细胞分两组，A组用上述的培养体系培养，B组用DMEM+10％FBS的传统培养基配方进行培养。
13.之后每日观察细胞，记录细胞生长状态，细胞铺瓶率超过80％时进行传代，传代5-6代后其中一组细胞生长状态发现明显老化后记录两组细胞的生长状态并进行对比。
DMEM+10％FBS的传统培养基配方培养的小鼠胚胎成纤维细胞作为对照；两组细胞传代两次后的P2细胞的生长情况如图1所示。传代6次后的两组P6细胞的生长状态如图2所示，其中，A代表应用例1的成纤维培养体系培养的原代小鼠小肠胚胎成纤维细胞；B代表DMEM+10％FBS的传统培养基配方小鼠胚胎成纤维细胞。
由图1可以看出，P2代时，两组细胞的生长情况几乎没有差别，细胞活性均很好。P6代时，如图2所示用传统培养基配方培养的细胞几乎都已经出现了胞内空泡以及细胞厚度变薄等细胞老化的特征。而用上述实施例的培养体系培养的A组细胞仅少数细胞变薄老化，其他细胞依然保持较高的生长活性和状态。
上述结果说明，上述实施例中的培养体系相较传统培养基配方，能够延长原代成纤维细胞的活性维持代数，有利于实验中获取更多数量的原代细胞，以及维持原代细胞原本细胞特性的时间，更有利于后续的细胞实验。
应用例2
本发明实施例提供一种上述的培养体系在培养小鼠胚胎成纤维(MEF)饲养层细胞中的应用；具体地，将培养体系用于培养MEF饲养层细胞，然后MEF饲养层细胞用于胚胎干细胞培养，包括以下步骤：
步骤1、按下述表5的浓度配制基础培养基：
表5基础培养基中组分浓度
步骤2、按下述表6的浓度配制添加剂，抗生素和血清：
表6基础培养基中添加剂、抗生素(双抗生素)和血清的浓度
| 组分名称 | 工作浓度 |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子 | 8ng/ml |
| 重组人胰岛素 | 8ug/ml |
| 人全铁转铁蛋白 | 7.5ug/ml |
| 胎牛血清 | 0.01ml/ml |
| 青霉素 | 100U/ml |
| 链霉素 | 100ug/ml |
步骤3、按上述列表配制培养基后，依照以下的步骤从进行培养MEF饲养层细胞后其在胚胎干细胞培养中的应用实验：
实验分两组，分别用表5和表6浓度配置的成纤维培养体系和DMEM+10％FBS的传统培养基的配置。
(1)取P1的原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，消化下来，PBS清洗后，用上述培养体系和传统培养基重悬后以5×105的密度，以1ml/瓶的量接种于T-25培养瓶中，再加入3ml各组对应的培养基。
(2)将上述T-25培养瓶置于二氧化碳培养箱中37℃培养过夜，第二天向两组细胞的培养基中添加适量的丝裂霉素，使培养基中丝裂霉素的终浓度为10ug/ml。
(3)加入丝裂霉素的两组细胞在37℃5％CO2的培养箱孵育3小时。
(4)孵育完成后，吸弃含丝裂霉素的培养基，再用PBS清洗细胞5次。
(5)之后将两组细胞用胰酶消化下来，分别接种于一个包被0.2明胶的T-25培养瓶中，之后细胞均在37℃5％CO2的培养箱孵育静置过夜。
(6)将小鼠胚胎干细胞ES-E14TG2a的冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75％酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
(7)将冻存管内细胞悬液转移至含3-4ml小鼠胚胎干细胞完全培养液的15ml离心管内，以300g，离心5min。
(8)离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞养液2ml，吹打悬浮。重复吹打，制成单细胞悬液，吹打中尽量避免气泡产生。
(9)吸弃两组MEF细胞的T-25培养瓶中的培养基，用2ml PBS清洗细胞2次，之后每瓶中各加入3ml小鼠胚胎干细胞完全培养基，之后每瓶中再各加入1ml充分重悬的小鼠胚胎干细胞悬液，之后细胞均在37℃5％CO2的培养箱中培养。
(10)第3天，镜下观察小鼠胚胎干细胞的生长情况。
分组A使用的是用上述表5和表6配置的培养体系培养的MEF细胞；而分组B使用的DMEM+10％FBS的传统培养基培养的MEF细胞。这两种培养基培养的MEF细胞作为饲养层，接种同一支复苏的小鼠胚胎干细胞，生长48h后，胚胎干细胞房的生长情况如图3所示。
结果显示分组A的MEF上生长的小鼠胚胎干细胞，镜下观察明显细胞克隆面积更大，克隆周围的细胞保持亮园的形态，没有发生分化的趋势。分组B的MEF上生长的小鼠胚胎干细胞的细胞克隆面积相对较小，而且部分克隆的细胞没有维持亮圆型的未分化的典型状态，说明细胞有一定分化的趋势。
本发明实施例中的成纤维培养体系相较于传统培养基培养，使其培养的MEF饲养层上的小鼠胚胎干细胞有了更快的增殖速度和更好的保持未分化的干细胞状态。说明本发明实施例的成纤维细胞培养体系可以更好的维持成纤维细胞在体内的生物学活性，维持这样的状态更有利于细胞应用和科研实验中高质量细胞的获取。
本申请人之前申请的专利CN115466712A，公开一种原代大血管内皮细胞的培养体系，按重量百分比计，包括基础培养基78-86.5％、胎牛血清2-5％、抗生素1-5％和添加剂0.5-2％，所述添加剂包括多种生长因子。其中，所述添加剂中各组分在培养体系中的浓度为：重组人表皮细胞生长因子3-10ng/ml、氢化可的松0.15-0.3ug/ml、重组人血管内皮生长因子1-5ng/ml、重组人碱性成纤维生长因子2-10ng/ml、肝素20-80ug/ml、重组人胰岛素5-10ug/ml、人全铁转铁蛋白8-20ug/ml、R3胰岛素样生长因子1浓度为10-20ng/ml。由于内皮细胞和上皮细胞用基础培养基加血清的传统培养基组合很难在维持原代细胞特性的前提下扩增2代以上，专利CN115466712A中的培养体系主要在于增加内皮细胞传代后维持内皮细胞特性的代数。成纤维细胞的营养需求相对内皮细胞和上皮细胞更为简单，本申请的培养体系除了可以维持原代细胞原本细胞特性的时间，延长原代成纤维细胞的活性维持代数之外，还可以更好地保持未分化的干细胞状态，从而解决传统培养基存在的成纤维细胞会更快老化从而导致最终获得的细胞总数相对较少的问题。本申请与专利CN115466712A中的培养体系部分组分相同，这些相同成分设置的目的是为了弥补降低血清后的通用细胞营养需求。此外，随着胎牛血清的价格连年上涨，重组蛋白随着生产规模的增加单价不断下降，成纤维细胞培养体系的生产成本相对较低，上述实施例中成纤维细胞的培养体系有利于降低目标细胞的培养成本。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。上述各优选特征在互不冲突的情况下，可以任意组合使用。
Claims (9)
1.一种原代成纤维细胞的培养体系，其特征在于，按重量百分比计，所述培养体系包括：基础培养基91-98.5％、胎牛血清0-2％、抗生素1-5％和添加剂0.5-2％，所述添加剂包括多种生长因子。
2.根据权利要求1所述的原代成纤维细胞的培养体系，其特征在于，所述基础培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、嘌呤、嘧啶、缓冲液和pH指示剂。
3.根据权利要求2所述的原代成纤维细胞的培养体系，其特征在于，所述添加剂为在4℃保存时容易分解的物质，所述添加剂以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，使用时按百分之一的量添加至所述基础培养基中。
4.根据权利要求1所述的原代成纤维细胞的培养体系，其特征在于，所述多种生长因子包括重组人碱性成纤维生长因子、重组人胰岛素和人全铁转铁蛋白。
5.根据权利要求4所述的原代成纤维细胞的培养体系，其特征在于，所述多种生长因子在培养体系中的浓度为：重组人碱性成纤维生长因子3-8ng/ml、重组人胰岛素3-8ug/ml、人全铁转铁蛋白5-10ug/ml。
6.根据权利要求1所述的原代成纤维细胞的培养体系，其特征在于，所述抗生素包括青霉素和链霉素。
7.根据权利要求6所述的原代成纤维细胞的培养体系，其特征在于，青霉素和链霉素以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，使用时按百分之一的量添加至所述基础培养基中。
8.一种成纤维细胞的培养方法，其特征在于，利用权利要求1-7任一项所述的原代成纤维细胞的培养体系进行成纤维细胞的培养。
9.一种权利要求1-7任一项所述的原代成纤维细胞的培养体系在培养成纤维细胞中的应用。
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