CN109810939B - 一种猪腹膜间皮细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种猪腹膜间皮细胞的培养方法，涉及细胞培养技术领域。所述猪腹膜间皮细胞的培养方法包括以下步骤：将清理后的腹膜平铺于培养皿中进行酶解消化，得原代细胞悬液；将所述原代细胞悬液离心，保留沉淀物，并将所述沉淀物用原代培养液重悬，筛选得原代细胞；其中，所述原代培养液包含15％～20％(v/v)胎牛血清、79％～85％(v/v)DMEM/F‑12基础培养基、0.8％～1.1％(v/v)青链霉素混合液、0.03～0.05％(v/v)EGF以及0.05％～0.12％(v/v)ITS。本发明旨在提供一种适用于猪腹膜间皮细胞的培养方法。

Description

一种猪腹膜间皮细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种猪腹膜间皮细胞的培养方法。

背景技术

腹膜组织是一层覆盖于腹腔脏器及腹腔的壁层的半透膜，由结缔组织和其表面覆盖一层间皮细胞组成，结缔组织中包含血管、淋巴管和脂肪等组织。目前研究腹膜的相关文章集中于腹膜纤维化和腹膜透析领域，对腹膜间皮细胞的研究较少，且大多是人、大鼠和小鼠的相关研究，对猪的腹膜和腹膜间皮细胞研究极少。

目前，培养猪腹膜间皮细胞多是采用人、大鼠或小鼠的腹膜间皮细胞培养方法，然而，由于机体差异，这些方法并不完全适用于猪。采用这些培养方法培养猪腹膜间皮细胞，容易出现原代猪腹膜间皮细胞形态不稳定、杂细胞多、细胞获得率低、培养时间长等缺陷。因此，急需找到一种适用于猪腹膜间皮细胞的培养方法。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种猪腹膜间皮细胞的培养方法，旨在提供一种适用于猪腹膜间皮细胞的培养方法。

为实现上述目的，本发明提出了一种猪腹膜间皮细胞的培养方法，所述猪腹膜间皮细胞的培养方法包括以下步骤：

将清理后的腹膜平铺于培养皿中进行酶解消化，得原代细胞悬液；

将所述原代细胞悬液离心，保留沉淀物，并将所述沉淀物用原代培养液重悬，筛选得原代细胞；

其中，所述原代培养液包含DMEM/F-12基础培养基、15％～20％(v/v)胎牛血清、0.8％～1.1％(v/v)青链霉素混合液、0.03～0.05％(v/v)EGF以及0.05％～0.12％(v/v)ITS。

优选地，将所述原代细胞悬液离心，保留沉淀物，并将所述沉淀物用原代培养液重悬，筛选得原代细胞的步骤之后，还包括：

待所述原代细胞密度达到80％～90％时，使用传代培养液对所述原代细胞进行传代，得传代细胞；

其中，所述传代培养液包含DMEM/F-12基础培养基、10％～15％(v/v)胎牛血清、0.8％～1.1％(v/v)青链霉素混合液、0.03～0.05％(v/v)EGF以及0.05％～0.12％(v/v)ITS。

优选地，将清理后的腹膜平铺于培养皿中进行酶解消化，得原代细胞悬液的步骤之前，还包括：

取猪的腹膜，清除掉所述腹膜表面残余的脂肪，于无菌环境下，用PBS反复冲洗所述腹膜的正反面，得清理后的腹膜。

优选地，将清理后的腹膜平铺于培养皿中进行酶解消化，得原代细胞悬液的步骤包括：

将清理后的腹膜平铺于培养皿中，加入胰酶-EDTA细胞消化液使所述腹膜被完全浸没，于恒温培养震荡器中消化20～30min，得消化液；

向所述消化液中加入胎牛血清终止消化，弃去所述腹膜，得原代细胞悬液；

其中，所述胎牛血清的加入量为所述胰酶-EDTA细胞消化液的加入量的15％～20％(v/v)。

优选地，将所述原代细胞悬液离心，保留沉淀物，并将所述沉淀物用原代培养液重悬，筛选得原代细胞的步骤包括：

将所述原代细胞悬液以1500～2000rpm/min转速离心10～15min，弃去上清液，保留沉淀；

将所述沉淀用原代培养液重悬，移入细胞培养瓶中，于CO₂培养箱中培养，得原代细胞。

优选地，将所述沉淀用原代培养液重悬，移入细胞培养瓶中，于CO₂培养箱中培养，得原代细胞的步骤中，所述于CO₂培养箱中培养时，开始培养后的第30～36h首次更换所述原代培养液，之后，每隔22～24h更换一次所述原代培养液。

优选地，待所述原代细胞密度达到80％～90％时，使用传代培养液对所述原代细胞进行传代，得传代细胞的步骤包括：

待所述原代细胞密度达到80％～90％时，用PBS润洗所述原代细胞，然后加入胰酶-EDTA细胞消化液，于CO₂培养箱中消化2～6min后，加入传代培养液终止消化，得混合悬液；

吹打所述混合悬液至细胞悬浮后，以800～1500rpm/min转速离心6～10min，弃去上清液，加入所述传代培养液重悬浮，然后分瓶培养，得传代细胞。

优选地，待所述原代细胞密度达到80％～90％时，用PBS润洗所述原代细胞，然后加入胰酶-EDTA细胞消化液，于CO₂培养箱中消化2～6min后，加入传代培养液终止消化，得混合悬液的步骤中，

所述传代培养液的加入量与所述胰酶-EDTA细胞消化液的加入量相等。

本发明技术方案中，采用对整块腹膜进行消化处理的方式，消化步骤简单高效且分离出的原代猪腹膜间皮细胞纯度高、形态好；同时利用特定的培养液进行原代培养，该培养液添加了EGF、ITS并调整了胎牛血清与基础培养基的比例，具有促进猪腹膜间皮细胞生长、维持细胞形态的作用，通过该培养液培养猪腹膜间皮细胞，培养时间短、细胞的获得率高、杂细胞含量小，培养出来的原代细胞形态表现为典型的猪腹膜间皮细胞形态且形态稳定、一致性高，可稳定传代2～3代。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提出的猪腹膜间皮细胞的培养方法的一实施例的流程示意图；

图2、图7、图12为各实施例原代培养3天时的细胞状态图；

图3、图8、图13、图17为各实施例及对比例原代培养7天时的细胞状态图；

图4、图9、图14、图18为各实施例及对比例P1代的细胞状态图；

图5、图10、图15为各实施例P2代的细胞状态图；

图6、图11、图16为各实施例P3代的细胞状态图；

图19为实施例1免疫组化鉴定的检测结果图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

目前，培养猪腹膜间皮细胞多是采用人、大鼠或小鼠的腹膜间皮细胞培养方法，然而，由于机体差异，这些方法并不完全适用于猪。采用这些培养方法培养猪腹膜间皮细胞，容易出现原代猪腹膜间皮细胞形态不稳定、杂细胞多、细胞获得率低、培养时间长等缺陷。因此，急需找到一种适用于猪腹膜间皮细胞的培养方法。

鉴于此，本发明提出了一种猪腹膜间皮细胞的培养方法，该方法具有培养时间短、杂细胞少、细胞的获得率高、培养出的原代细胞形态表现为典型的猪腹膜间皮细胞形态且形态稳定、一致性高、可稳定传代2～3代的优点。结合图1提出的猪腹膜间皮细胞的培养方法的一实施例的流程示意图，本发明提出了一种猪腹膜间皮细胞的培养方法，所述猪腹膜间皮细胞的培养方法包括以下步骤：

步骤S10、将清理后的腹膜平铺于培养皿中进行酶解消化，得原代细胞悬液。

腹膜组织是一层覆盖于腹腔脏器及腹腔的壁层的半透膜，由结缔组织和其表面覆盖一层间皮细胞组成。腹膜间皮细胞原代培养是指由腹膜中分离出细胞后进行的首次培养。从腹膜中分离间皮细胞可以采用以下方法：(1)将腹膜剪碎后酶解消化，然后使用纱网将消化液过滤，获得细胞悬液；或者，(2)将消化液注入腹腔消化细胞，再吸取腹腔内液体，经离心弃上清液后，获得细胞材料。但方法(1)获得的细胞悬液中往往会携带一些脂肪颗粒残留，最终导致培养出的细胞中杂细胞占比较高且培养出的原代细胞形态不稳定、易分化为成纤维细胞，而方法(2)需要将消化液注入腹腔，考虑到猪体腹腔容量很大，需要消耗大量的消化液，成本较高，因此，在本实施例中，采用将清理后的腹膜平铺于培养皿中酶解消化的方式，不仅消化步骤简单高效且分离出的原代猪腹膜间皮细胞纯度高、形态好。实施步骤S10时，在本发明的其中一实施例中，通过以下步骤实现：

步骤S110、将清理后的腹膜平铺于培养皿中，加入胰酶-EDTA细胞消化液使所述腹膜被完全浸没，于恒温培养震荡器中消化20～30min，得消化液；

步骤S120、向所述消化液中加入胎牛血清终止消化，弃去所述腹膜，得原代细胞悬液。

细胞之间有粘性是由于细胞表面糖蛋白的糖链互相粘连的原因，使用胰蛋白酶(即胰酶)处理，可分解细胞表面糖蛋白、消化细胞。在胰酶中添加一定量的EDTA(乙二胺四乙酸)可以增强其消化作用，但EDTA会影响细胞的生长及其贴壁性，因此EDTA的加入量不宜过多，在本实施例中，采用的胰酶-EDTA细胞消化液中，胰酶的质量体积比为0.25％，EDTA的质量体积比为0.02～0.04％，即0.25g胰酶以及0.02～0.04gEDTA溶于100mlPBS(磷酸盐缓冲液)，该胰酶-EDTA细胞消化液可自行配置，也可以在市面上购得。消化过程中，为保证消化充分，同时避免酶失活，培养皿需置于恒温培养震荡器中，于30～40℃(优选37℃)下消化20～30min。待消化完成后，需要加入血清终止胰酶的作用，在本实施例中，胎牛血清的加入量为所述胰酶-EDTA细胞消化液的加入量的15％～20％(v/v)。

此外，为使分离出的细胞最大程度地接近生物体内的生化状态，在实施步骤S10时，分离细胞所用的清理后的腹膜可以直接从刚刚被宰杀的猪体中收集，因此，在本发明的一实施例中，上述步骤S10之前，还可以包括以下步骤：

步骤S100、取猪的腹膜，清除掉所述腹膜表面残余的脂肪，于无菌环境下，用PBS反复冲洗所述腹膜的正反面，得清理后的腹膜。

其中，选材的猪体优选为刚刚被宰杀的猪，特别是体重10kg左右的仔猪，具体实施时，于仔猪腹部中线附近用手术刀竖向依次划开皮肤、肌肉层、脂肪层，找到腹膜层，将腹膜层周围脂肪组织剥离后，迅速割下一块腹膜(约10×15cm)，浸泡于灭菌好的预冷PBS溶液(-20～4℃)中，运至无菌实验室，储存时间不宜超过两天。随后，对腹膜进一步清理，剔除其表面残余的脂肪，然后于无菌实验室中，用30～40℃(优选37℃)的PBS反复冲洗所述腹膜的正反面，得清理后的腹膜。

步骤S20、将所述原代细胞悬液离心，保留沉淀物，并将所述沉淀物用原代培养液重悬，筛选得原代细胞；

其中，所述原代培养液包含DMEM/F-12基础培养基、15％～20％(v/v)胎牛血清、0.8％～1.1％(v/v)青链霉素混合液、0.03～0.05％(v/v)EGF以及0.05％～0.12％(v/v)ITS。

原代细胞悬液中除间皮细胞外，还包含有杂细胞、少量脂肪组织、消化液等，需要离心处理，分离出这些杂质，从而获得细胞纯度较高的沉淀，再通过原代培养，即可获得杂细胞少、细胞获得率高、形态稳定的原代细胞。在本实施例中，步骤S20可以通过以下步骤实现：

步骤S210、将所述原代细胞悬液以1500～2000rpm/min转速离心10～15min，弃去上清液，保留沉淀；

步骤S220、将所述沉淀用原代培养液重悬，移入细胞培养瓶中，于CO₂培养箱中培养，得原代细胞。

目前，培养腹膜间皮细胞大多数选取的是M199培养基、RPMI-1640培养基或者DMEM培养基，但发明人发现使用上述三种培养基作为基础培养基培养猪腹膜间皮细胞，在传代培养后，细胞形态变化过大，且细胞不易生长，因此，在本实施例中，选用DMEM/F-12基础培养基，并添加胎牛血清、青链霉素混合液、EGF(表皮生长因子)以及ITS(细胞培养添加物，包括细胞培养中三种最常用的添加物:胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸)，作为原代培养用的原代培养液，同时，基于猪腹膜间皮细胞的生长情况，经多次实验调整出合适的组分比：DMEM/F-12基础培养基、15％～20％(v/v)胎牛血清、0.8％～1.1％(v/v)青链霉素混合液、0.03～0.05％(v/v)EGF以及0.05％～0.12％(v/v)ITS。需要注意的是，上述组分的百分比均为体积比(该组分体积与原代培养液总体积的百分比)，DMEM/F-12基础培养基的组分比以配制时其他组分的加入量为准，即各组分的体积百分比总和为100％，例如，80.85％DMEM/F-12基础培养基、18％胎牛血清、1％青链霉素混合液、0.04％EGF以及0.11％ITS。该原代培养液具有促进猪腹膜间皮细胞生长、维持细胞形态的作用，实验发现，通过该培养液培养猪腹膜间皮细胞，原代细胞24～36h即可贴壁，细胞形态呈椭圆或不规则多边形、大小形态较为一致，在培养4到5天时细胞呈对数增长，在7天左右时即可长满80％～90％，长满后形成铺路鹅卵石状，具有培养时间短、杂细胞少、细胞的获得率高、培养出的原代细胞形态表现为典型的猪腹膜间皮细胞形态且形态稳定、一致性高的优点。

此外，由于细胞在生长过程中会不断释放CO₂，致使培养液pH变小，步骤S220中，细胞培养瓶需置于CO₂培养箱中培养，培养过程中需不断向其中通入空气和CO₂，使其CO₂含量保持在5％。进一步地，为维持良好的细胞生长环境，在培养过程中，需要不断更换培养液，在本实施中，所述于CO₂培养箱中培养时，开始培养后的第30～36h首次更换所述原代培养液，之后，每隔22～24h更换一次所述原代培养液。

细胞培养包括原代培养和传代培养，当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时，就需要将细胞稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长，即传代培养。在本发明的一实施例中，上述步骤S20之后，还包括了如下步骤：

步骤S30、待所述原代细胞密度达到80％～90％时，使用传代培养液对所述原代细胞进行传代，得传代细胞。

由于高比例的血清对细胞有毒性，在本实施例中，细胞传代后，降低了培养液中胎牛血清比例，具体为所述传代培养液包含DMEM/F-12基础培养基、10％～15％(v/v)胎牛血清、0.8％～1.1％(v/v)青链霉素混合液、0.03～0.05％(v/v)EGF以及0.05％～0.12％(v/v)ITS。通过上述传代培养液培养的传代细胞，3～4天即可长满细胞瓶，进行第二次传代，且细胞形态稳定，变化比较小，具有良好的传代能力。

在具体实施时，步骤S30可以通过如下步骤实现：

步骤S310、待所述原代细胞密度达到80％～90％时，用PBS润洗所述原代细胞，然后加入胰酶-EDTA细胞消化液，于CO₂培养箱中消化2～6min后，加入传代培养液终止消化，得混合悬液。

其中，所述传代培养液的加入量与所述胰酶-EDTA细胞消化液的加入量相等。

步骤S320、吹打所述混合悬液至细胞悬浮后，以800～1500rpm/min转速离心6～10min，弃去上清液，加入所述传代培养液重悬浮，然后分瓶培养，得传代后细胞。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

于仔猪腹部中线附近用手术刀竖向依次划开皮肤、肌肉层、脂肪层，找到腹膜层，将腹膜层周围脂肪组织剥离后，迅速割下一块腹膜(约10×15cm)，浸泡于灭菌好的预冷PBS溶液(0℃)中，运至无菌实验室，备用。

取出上述备用的腹膜，清除掉所述腹膜表面残余的脂肪，于无菌环境下，用37℃的PBS反复冲洗所述腹膜的正反面，得清理后的腹膜。将清理后的腹膜平铺于培养皿中，加入0.25％胰酶-EDTA细胞消化液25ml使所述腹膜被完全浸没，将培养皿置于恒温培养震荡器中，于37℃消化20min，得消化液；向所述消化液中加入3.75ml胎牛血清终止消化，弃去所述腹膜，得原代细胞悬液。将原代细胞悬液以2000rpm/min转速离心10min，弃去上清液，保留沉淀，再将沉淀用上述原代培养液重悬，然后移入细胞培养瓶中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养，36h之后进行首次更换原代培养液，随后，每隔24h更换一次原代培养液，记为P0(原代)。

原代细胞培养3～7天时，培养皿中细胞数骤增，期间，当观察细胞(P0，对应图2、3)，当原代细胞密度达到80％～90％时，按以下步骤消化传代：用无菌枪头吸取原代培养液，弃去；加入PBS润洗1～2次，弃去；加入2ml0.25％胰酶-EDTA细胞消化液，放入CO₂培养箱中消化6min，加入2ml传代培养液终止消化，得混合悬液；吹打混合悬液至细胞悬浮后，以800rpm/min转速离心10min，弃去上清液，加入传代培养液重悬浮，然后分瓶培养，并记为P1(第一代)。细胞培养4天时，当观察细胞(P1，对应图4)，当细胞长满细胞瓶时，进行第二次传代，并记为P2(第二代)；细胞培养4天时，当观察细胞(P2，对应图5)，当细胞长满细胞瓶时，进行第三次传代，并记为P3(第三代)，细胞培养4天时，观察细胞(P3，对应图6)。

上述原代培养液的组成为：15％(v/v)胎牛血清、84.12％(v/v)DMEM/F-12基础培养基、0.8％(v/v)青链霉素混合液、0.03％(v/v)EGF以及0.05％(v/v)ITS。

上述传代培养液的组成为：10％(v/v)胎牛血清、89.12％(v/v)DMEM/F-12基础培养基、0.8％(v/v)青链霉素混合液、0.03％(v/v)EGF以及0.05％(v/v)ITS。

上述观察细胞时，采用倒置式生物显微镜拍摄出培养皿中细胞状态，其中图2为培养3天时P0代的细胞状态图；图3为培养7天时P0代的细胞状态图；图4为P1代的细胞状态图；图5为P2代的细胞状态图；图6为P3代的细胞状态图；图2～6的放大倍数为100倍。

观察图2、图3，可以看出，在本实施例中，原代细胞培养至3天时，出现杂细胞较少，培养至7天时，即长满培养皿，形成铺路鹅卵石状，说明培养时间短、细胞获得率高，且均呈典型的腹膜间皮细胞形状，大小形态较为一致。

观察图4～6，可以看出，图4、图5中细胞形态与图3比较接近，说明形态变化较小，图6中部分细胞的形态开始变为长梭形，说明本发明提供的培养方法培养出的细胞可传2～3代。

取本实施例中培养出的第一代细胞按以下步骤进行免疫组化鉴定：

(1)细胞准备：将细胞传代于12孔板。

(2)固定细胞：当细胞融合成单层时，弃去培养液，用PBS清洗3遍，每次5min；用4％多聚甲醛固定15min；再用PBS清洗3遍，每次5min；

(3)在湿盒中每个盖玻片上滴加H₂O₂，37℃，30min，以阻断内源性过氧化物酶。

(4)用PBS振洗3次，每次3min；

(5)滴加正常羊血清，室温孵育10～15min，弃去羊血清；

(6)分别滴加各种特异性抗体：抗波形蛋白抗体(Vim)(1：200)、抗细胞角蛋白抗体(PCK)(1：200)、抗白细胞CD45抗体(CD45)(1：200)、抗第Ⅷ因子相关抗体(F8)(1：200)，在湿盒内于4℃下过夜：

(7)用PBS振洗3次，每次3min；

(8)滴加生物素标记的羊抗兔/属二抗，在湿盒内37℃，20min；

(9)滴加HRP标记的链霉亲和素，在湿盒内37℃，15min；

(10)用PBS振洗3次，每次3min；

(11)滴加新鲜配置的DAB(1：40)显色溶液，在显微镜下观察，一般5min；

(12)用UP水洗5min；

(13)细胞核复染：侵入苏木素染液染色5min，水洗；迅速过盐酸酒精溶液，水洗；过氨水溶液，水洗；

(14)逐级脱水；过75％，95％各1次，100％酒精2次，每次5min；

(15)透明：过二甲苯溶液1次，5min；

(16)拍照：于显微镜下观察，拍照如图19所示。

从图19中可以看出，第一代细胞在免疫组化鉴定下，呈现如下结果：抗波形蛋白抗体(Vim)、抗细胞角蛋白抗体(PCK)呈阳性，抗白细胞CD45抗体(CD45)、抗第Ⅷ因子相关抗体(F8)呈阴性，证明本发明提供的方法培养出的细胞均为腹膜间皮细胞。

实施例2

于仔猪腹部中线附近用手术刀竖向依次划开皮肤、肌肉层、脂肪层，找到腹膜层，将腹膜层周围脂肪组织剥离后，迅速割下一块腹膜(约10×15cm)，浸泡于灭菌好的预冷PBS溶液(0℃)中，运至无菌实验室，备用。

取出上述备用的腹膜，清除掉所述腹膜表面残余的脂肪，于无菌环境下，用37℃的PBS反复冲洗所述腹膜的正反面，得清理后的腹膜。将清理后的腹膜平铺于培养皿中，加入0.25％胰酶-EDTA细胞消化液25ml使所述腹膜被完全浸没，将培养皿置于恒温培养震荡器中，于37℃消化30min，得消化液；向所述消化液中加入4ml胎牛血清终止消化，弃去所述腹膜，得原代细胞悬液。将原代细胞悬液以1500rpm/min转速离心15min，弃去上清液，保留沉淀，再将沉淀用上述原代培养液重悬，然后移入细胞培养瓶中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养，33h之后进行首次更换原代培养液，随后，每隔22h更换一次原代培养液，记为P0(原代)。

原代细胞培养3～7天时，培养皿中细胞数骤增，期间，当观察细胞(P0，对应图7、8)，当原代细胞密度达到80％～90％时，按以下步骤消化传代：用无菌枪头吸取原代培养液，弃去；加入PBS润洗1～2次，弃去；加入2ml0.25％胰酶-EDTA细胞消化液，放入CO₂培养箱中消化2min，加入2ml传代培养液终止消化，得混合悬液；吹打混合悬液至细胞悬浮后，以1000rpm/min转速离心8min，弃去上清液，加入传代培养液重悬浮，然后分瓶培养，并记为P1(第一代)。细胞培养4天时，当观察细胞(P1，对应图9)，当细胞长满细胞瓶时，进行第二次传代，并记为P2(第二代)；细胞培养4天时，当观察细胞(P2，对应图10)，当细胞长满细胞瓶时，进行第三次传代，并记为P3(第三代)，细胞培养4天时，观察细胞(P3，对应图11)。

上述原代培养液的组成为：20％(v/v)胎牛血清、78.73％(v/v)DMEM/F-12基础培养基、1.1％(v/v)青链霉素混合液、0.05％(v/v)EGF以及0.12％％(v/v)ITS。

上述传代培养液的组成为：15％(v/v)胎牛血清、83.73％(v/v)DMEM/F-12基础培养基、1.1％(v/v)青链霉素混合液、0.05％(v/v)EGF以及0.12％％(v/v)ITS。

上述观察细胞时，采用倒置式生物显微镜拍摄出培养皿中细胞状态，其中图7为培养3天时P0代的细胞状态图；图8为培养7天时P0代的细胞状态图；图9为P1代的细胞状态图；图10为P2代的细胞状态图；图11为P3代的细胞状态图；图7～11的放大倍数为100倍。

观察图7、图8，可以看出，在本实施例中，原代细胞培养至3天时，出现杂细胞较少，培养至7天时，即长满培养皿，形成铺路鹅卵石状，说明培养时间短、细胞获得率高，且均呈典型的腹膜间皮细胞形状，大小形态较为一致。

观察图9～11，可以看出，图9、图10中细胞形态与图8比较接近，说明形态变化较小，图11中部分细胞的形态开始变为长梭形，说明本发明提供的培养方法培养出的细胞可传2～3代。

实施例3

于仔猪腹部中线附近用手术刀竖向依次划开皮肤、肌肉层、脂肪层，找到腹膜层，将腹膜层周围脂肪组织剥离后，迅速割下一块腹膜(约10×15cm)，浸泡于灭菌好的预冷PBS溶液(0℃)中，运至无菌实验室，备用。

取出上述备用的腹膜，清除掉所述腹膜表面残余的脂肪，于无菌环境下，用37℃的PBS反复冲洗所述腹膜的正反面，得清理后的腹膜。将清理后的腹膜平铺于培养皿中，加入0.25％胰酶-EDTA细胞消化液25ml使所述腹膜被完全浸没，将培养皿置于恒温培养震荡器中，于37℃消化25min，得消化液；向所述消化液中加入5ml胎牛血清终止消化，弃去所述腹膜，得原代细胞悬液。将原代细胞悬液以1800rpm/min转速离心12min，弃去上清液，保留沉淀，再将沉淀用上述原代培养液重悬，然后移入细胞培养瓶中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养，30h之后进行首次更换原代培养液，随后，每隔23h更换一次原代培养液，记为P0(原代)。

原代细胞培养3～7天时，培养皿中细胞数骤增，期间，当观察细胞(P0，对应图12、13)，当原代细胞密度达到80％～90％时，按以下步骤消化传代：用无菌枪头吸取原代培养液，弃去；加入PBS润洗1～2次，弃去；加入2ml0.25％胰酶-EDTA细胞消化液，放入CO₂培养箱中消化4min，加入2ml传代培养液终止消化，得混合悬液；吹打混合悬液至细胞悬浮后，以1500rpm/min转速离心6min，弃去上清液，加入传代培养液重悬浮，然后分瓶培养，并记为P1(第一代)。细胞培养4天时，当观察细胞(P1，对应图14)，当细胞长满细胞瓶时，进行第二次传代，并记为P2(第二代)；细胞培养4天时，当观察细胞(P2，对应图15)，当细胞长满细胞瓶时，进行第三次传代，并记为P3(第三代)，细胞培养4天时，观察细胞(P3，对应图16)。

上述原代培养液的组成为：18％(v/v)胎牛血清、80.85％(v/v)DMEM/F-12基础培养基、1％(v/v)青链霉素混合液、0.04％(v/v)EGF以及0.11％(v/v)ITS。

上述传代培养液的组成为：12％(v/v)胎牛血清、86.97％(v/v)DMEM/F-12基础培养基、0.9％(v/v)青链霉素混合液、0.04％(v/v)EGF以及0.09％(v/v)ITS。

上述观察细胞时，采用倒置式生物显微镜拍摄出培养皿中细胞状态，其中图12为培养3天时P0代的细胞状态图；图13为培养7天时P0代的细胞状态图；图14为P1代的细胞状态图；图15为P2代的细胞状态图；图16为P3代的细胞状态图；图12～16的放大倍数为100倍。

观察图12、图13，可以看出，在本实施例中，原代细胞培养至3天时，出现杂细胞较少，培养至7天时，即长满培养皿，形成铺路鹅卵石状，说明培养时间短、细胞获得率高，且均呈典型的腹膜间皮细胞形状，大小形态较为一致。

观察图14～16，可以看出，图14、图15中细胞形态与图13比较接近，说明形态变化较小，图16中部分细胞的形态开始变为长梭形，说明本发明提供的培养方法培养出的细胞可传2～3代。

对比例

于仔猪腹部中线附近用手术刀竖向依次划开皮肤、肌肉层、脂肪层，找到腹膜层，将腹膜层周围脂肪组织剥离后，迅速割下一块腹膜(约10×15cm)，浸泡于灭菌好的预冷PBS溶液(0℃)中，运至无菌实验室，备用。

取出上述备用的腹膜，于无菌培养皿内，用pH7.3的4℃PBS洗涤3次后，剪碎；加入0.25％胰酶-EDTA细胞消化液25ml，于恒温培养震荡器中，在37℃下消化30min后，以1000rpm/min转速离心10min，弃去上清液，再用100目不锈钢筛过滤细胞至另一离心管中；以含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基洗涤细胞，再以1000rpm/min转速离心10min，弃去上清液，加入完全培养液5ml(20％胎牛血清、79.95％RPMI-1640培养基、0.05％氢化可的松)，补充青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，吹打至细胞悬浮后，移入细胞培养瓶中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养，3天后进行首次更换完全培养液，随后，每隔3天更换一次完全培养液，记为P0(原代)，培养8～9天后，原代细胞密度达到80％～90％。期间，原代细胞培养至7天时，采用倒置式生物显微镜拍摄出培养皿中P0细胞状态，即图17(放大倍数为100倍)。

当原代细胞密度达到80％～90％时，按以下步骤消化传代：用无菌枪头吸取培养液，弃去；加入PBS润洗1～2次，弃去；加入2ml0.25％胰酶-EDTA细胞消化液消化，加入4ml含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液终止消化，得混合悬液；吹打混合悬液至细胞悬浮后，以1000rpm/min转速离心5min，弃去上清液，加入传代培养液重悬浮，然后分瓶培养，并记为P1(第一代)。细胞培养4天时，采用倒置式生物显微镜拍摄出培养皿中P1细胞状态，即图18(放大倍数为100倍)。

将图17与上述各实施例中原代培养7天时的细胞状态(图3、图8、图13)进行对比，可以看出，对比例原代培养7天时的细胞获得率较低，生长状态比实施例差，且呈现出的细胞形状一致性差。

此外，对比图17和图18，可以看出，采用对比例方法培养出的细胞传代一代后细胞形态已经开始变为长梭形，说明对比例方法培养的猪腹膜间皮细胞传代能力较差。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种猪腹膜间皮细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

将清理后的腹膜平铺于培养皿中进行酶解消化，得原代细胞悬液；

将所述原代细胞悬液离心，保留沉淀物，并将所述沉淀物用原代培养液重悬，筛选得原代细胞；

待所述原代细胞密度达到80％～90％时，使用传代培养液对所述原代细胞进行传代，得传代细胞；

其中，所述原代培养液包含DMEM/F-12基础培养基、15％～20％(v/v)胎牛血清、0.8％～1.1％(v/v)青链霉素混合液、0.03～0.05％(v/v)EGF以及0.05％～0.12％(v/v)ITS；

所述传代培养液包含DMEM/F-12基础培养基、10％～15％(v/v)胎牛血清、0.8％～1.1％(v/v)青链霉素混合液、0.03～0.05％(v/v)EGF以及0.05％～0.12％(v/v)ITS。

2.如权利要求1所述的猪腹膜间皮细胞的培养方法，其特征在于，将清理后的腹膜平铺于培养皿中进行酶解消化，得原代细胞悬液的步骤之前，还包括：

取猪的腹膜，清除掉所述腹膜表面残余的脂肪，于无菌环境下，用PBS反复冲洗所述腹膜的正反面，得清理后的腹膜。

3.如权利要求1所述的猪腹膜间皮细胞的培养方法，其特征在于，将清理后的腹膜平铺于培养皿中进行酶解消化，得原代细胞悬液的步骤包括：

将清理后的腹膜平铺于培养皿中，加入胰酶-EDTA细胞消化液使所述腹膜被完全浸没，于恒温培养震荡器中消化20～30min，得消化液；

向所述消化液中加入胎牛血清终止消化，弃去所述腹膜，得原代细胞悬液；

其中，所述胎牛血清的加入量为所述胰酶-EDTA细胞消化液的加入量的15％～20％(v/v)。

4.如权利要求1所述的猪腹膜间皮细胞的培养方法，其特征在于，将所述原代细胞悬液离心，保留沉淀物，并将所述沉淀物用原代培养液重悬，筛选得原代细胞的步骤包括：

将所述原代细胞悬液以1500～2000rpm转速离心10～15min，弃去上清液，保留沉淀；

将所述沉淀用原代培养液重悬，移入细胞培养瓶中，于CO2培养箱中培养，得原代细胞。

5.如权利要求4所述的猪腹膜间皮细胞的培养方法，其特征在于，将所述沉淀用原代培养液重悬，移入细胞培养瓶中，于CO₂培养箱中培养，得原代细胞的步骤中，所述于CO₂培养箱中培养时，开始培养后的第30～36h首次更换所述原代培养液，之后，每隔22～24h更换一次所述原代培养液。

6.如权利要求1所述的猪腹膜间皮细胞的培养方法，其特征在于，待所述原代细胞密度达到80％～90％时，使用传代培养液对所述原代细胞进行传代，得传代细胞的步骤包括：

待所述原代细胞密度达到80％～90％时，用PBS润洗所述原代细胞，然后加入胰酶-EDTA细胞消化液，于CO₂培养箱中消化2～6min后，加入传代培养液终止消化，得混合悬液；

吹打所述混合悬液至细胞悬浮后，以800～1500rpm转速离心6～10min，弃去上清液，加入所述传代培养液重悬浮，然后分瓶培养，得传代细胞。

7.如权利要求6所述的猪腹膜间皮细胞的培养方法，其特征在于，待所述原代细胞密度达到80％～90％时，用PBS润洗所述原代细胞，然后加入胰酶-EDTA细胞消化液，于CO₂培养箱中消化2～6min后，加入传代培养液终止消化，得混合悬液的步骤中，

所述传代培养液的加入量与所述胰酶-EDTA细胞消化液的加入量相等。

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