CN116445407B - 一种胎盘巨噬细胞的提取和扩增培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于再生医学和生物学技术领域，具体涉及一种胎盘巨噬细胞的提取和扩增培养方法，所述方法采用较为温和的酶解液充分消化胎盘组织，可使巨噬细胞迅速提取出来而不被伤害，有效提高巨噬细胞的活率和数量，可在短时间内获得数量充足的巨噬细胞，显著提高分离提取效率，在体外扩增培养阶段采用混合贴壁细胞培养基和悬浮细胞培养基，为巨噬细胞提供充足的营养供给，大大缩短原代培养周期，且能成功实现细胞的传代培养，解决了巨噬细胞获取难度大、培养周期长的问题，为胎盘巨噬细胞的体外扩增培养提供了新途径。
Description
技术领域
本发明属于再生医学和生物学技术领域，具体涉及一种胎盘巨噬细胞的提取和扩增培养方法。
背景技术
巨噬细胞是一类重要的天然免疫细胞，来源于外周血中的单核细胞，具有吞噬降解细菌、释放炎症介质、介导炎性细胞趋化、抗原提呈等活性，在抗感染、抗肿瘤免疫中发挥着非常重要的作用。因此研究巨噬细胞的功能，对于深入理解机体免疫防御和免疫调节机制具有重要意义。
作为胎盘中的主要免疫细胞，巨噬细胞通过吞噬及分泌炎性因子等方式，在抵抗病原体入侵及炎症反应过程中起到了重要的作用，并且随着孕期进展，胎盘中巨噬细胞数逐渐增多，并且在胎盘绒毛间质间自由移动。研究发现，子痫前期、妊娠期糖尿病、早产及流产等多种妊娠期疾病的发生发展都与胎盘巨噬细胞功能异常或减退相关。
巨噬细胞占胎盘免疫细胞总数的 20%～30%。研究证明，巨噬细胞通过分泌抗炎因子在胎盘组织中起着免疫抑制作用，并调控着胎盘滋养细胞的侵袭能力。最新研究发现，巨噬细胞在母胎界面的表型转换和活化与胎盘局部的微环境有关，其活化异常与妊娠期疾病发生密切相关。目前常用的巨噬细胞模型是从腹腔液或血液中提取，但无论哪一种模型都无法完全替代胎盘原代巨噬细胞。
目前从腹腔或血液中提取出来的巨噬细胞数量有限，且细胞潜伏期比较长，细胞的体外增殖时间长。培养体系有限，不能为刚酶解细胞提供充足的营养成分，原代培养周期过长，且巨噬细胞的体外培养，仅限原代培养，暂未见巨噬细胞的体外传代培养体系。
发明内容
基于上述技术背景，本发明提供一种胎盘巨噬细胞的提取和扩增培养方法，创造性的采用胰蛋白酶替代物和中性酶提取胎盘巨噬细胞，大大的提高了巨噬细胞的活率，使提取的细胞数量和活力高，短时间内即可获得数量巨大的巨噬细胞，且提取出的细胞污染率低，可显著提高分离提取效率。此外，本发明采用581基础培养基和αMEM基础培养基，同时添加细胞培养添加剂，混合了贴壁细胞培养基和悬浮细胞培养基，为巨噬细胞提供了两种类型的成分供给，使提取出的巨噬细胞在第2天即可进入细胞增殖期，且能够成功传代，解决了巨噬细胞获取难度大、培养周期过长的问题，同时实现了巨噬细胞的传代培养，从而完成本发明。
本发明在于提供一种胎盘巨噬细胞的提取和扩增培养方法，所述提取和扩增培养方法包括以下步骤：
步骤1、将足月分娩的胎盘进行清洗后，除去大血管、结缔组织、小血管和纤维连接成分，然后将胎盘组织剪碎，向其中加入由胰蛋白酶替代物、中性蛋白酶和基础培养基组成的消化液，经搅拌消化、过滤，得到过滤液，向其中加入血清替代品终止消化，然后离心、弃上清液，随后加入预冷红细胞裂解液进行冰浴，再次离心，弃上清液后进行洗涤，最后经过离心、弃上清液、加培养基重悬细胞，得到重悬细胞混合液；
步骤2、将重悬细胞混合液缓慢添加至淋巴细胞分离液上层，经离心后，用吸管将处于基础培养基和淋巴细胞分离液交界面处的巨噬细胞吸出，然后向巨噬细胞中添加基础培养基，经离心后，弃上清液，得到提取纯化的巨噬细胞；
步骤3、将步骤2提取纯化的巨噬细胞接种于扩增培养基中进行培养，接种培养48h后，弃上清液，得到扩增培养的巨噬细胞。
进一步地，步骤1中，所述消化液中胰蛋白酶替代物的质量浓度为0.04～0.1%，中性蛋白酶的浓度为0.05～0.2g/mL。
进一步地，步骤1中，搅拌消化的次数为2～5次，每次搅拌消化的时间为5～15min。
进一步地，步骤1中，第一次离心的条件为：于3～5℃、800～1200g离心5～15min；
所述冰浴时间为20～45min。
进一步地，步骤1中，第二次离心温度为3～5℃，离心转速为800～1200r/min，离心时间为3～10min；
第三次离心温度为2～5℃，离心转速为900～1200r/min，离心时间为4～10min。
进一步地，步骤2中，第一次离心温度为2～4℃，离心转速为400～700g，离心时间为10～30min；
第二次离心条件为：温度3～5℃，离心转速为400～600g，离心时间为5～20min。
进一步地，步骤3中，所述扩增培养基包括混合基础培养基和细胞培养添加剂，所述混合基础培养基为581基础培养基和αMEM基础培养基组成的混合基础培养基，所述细胞培养添加剂包括血清替代品、谷氨酰胺和NEAA。
更进一步地，所述581基础培养基和αMEM基础培养基的体积比为（1～2）:1。
所述扩增培养基中含有4～7wt%的血清替代品、0.002mol/L的谷氨酰胺和0.1mmol/L的NEAA。
本发明所具有的有益效果：
（1）本发明创造性的采用双酶法提取胎盘巨噬细胞，该方法操作步骤简单，提取和扩增培养时间短，细胞获取量大、获取率高，提取的细胞数量足够、细胞活率高，提取得到的细胞污染率极低，此外，本发明优化了巨噬细胞的培养体系，大大缩短了细胞的原代培养周期，同时可实现巨噬细胞的传代培养；
（2）本发明选用健康分娩的胎盘，采用低温胎盘保存液对胎盘进行保存，在24小时后进入试验流程，提取出的巨噬细胞活性高；
（3）胎盘组织采用双酶法进行酶解，不采用胰酶和DNA酶等酶解作用强烈的酶解液进行酶解，而采用胰酶替代物和中性酶两种酶解液充分消化胎盘组织，使得巨噬细胞能迅速提取出来而不被伤害，酶解液中采用581基础培养基作为溶剂，在酶解过程中为细胞提供很好的营养供给，保证了细胞的活性。
附图说明
图1示出实施例1提取培养得到胎盘巨噬细胞原代及传代细胞增殖曲线。
具体实施方式
下面将对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。
本发明第一方面在于提供一种胎盘巨噬细胞的提取和扩增培养方法，所述提取和扩增培养方法包括以下步骤：
步骤1、将足月分娩的胎盘进行清洗后，除去大血管、结缔组织、小血管和纤维连接成分，然后将胎盘组织剪碎，向其中加入由胰蛋白酶替代物、中性蛋白酶和基础培养基组成的消化液，经搅拌消化、过滤，得到过滤液，向其中加入血清替代品终止消化，然后离心、弃上清液，随后加入预冷红细胞裂解液进行冰浴，再次离心，弃上清液后进行洗涤，最后经过离心、弃上清液、加培养基重悬细胞，得到重悬细胞混合液；
步骤2、将重悬细胞混合液缓慢添加至淋巴细胞分离液上层，经离心后，用吸管将处于基础培养基和淋巴细胞分离液交界面处的巨噬细胞吸出，然后向巨噬细胞中添加基础培养基，经离心后，弃上清液，得到提取纯化的巨噬细胞；
步骤3、将步骤2提取纯化的巨噬细胞接种于扩增培养基中进行培养，接种培养48h后，弃上清液，得到扩增培养的巨噬细胞。
以下对上述步骤进行具体描述：
步骤1中、将足月分娩的胎盘优选采用含有1×抗生素的PBS进行清洗，清洗至胎盘呈胶白色。
清洗后将胎盘浸泡于胎盘保存液中，胎盘运输保存的温度不超过4℃。
将胎盘组织剪碎至1～5mm3，优选剪碎至1～3mm3。
每10g胎盘组织需要消化液80～120mL，优选地，每10g胎盘组织需要消化液100mL。
所述基础培养基优选为581基础培养基，所述消化液中581基础培养基作为消化液的溶剂，所述消化液中胰蛋白酶替代物的质量浓度为0.04～0.1%，中性蛋白酶的浓度为0.05～0.2g/mL。
优选地，所述消化液中胰蛋白酶替代物的质量浓度为0.05%，中性蛋白酶的浓度为0.1 g/mL。
现有技术中，常用胶原酶和胰酶获取胎盘巨噬细胞，但存在提取细胞数量少、活力低的缺点。本发明采用胰蛋白酶替代物和中性酶组成的较为温和的酶解液，大大维持了巨噬细胞的活率，在短时间内即可获得数量充足的细胞，此外，本方法提取出来的巨噬细胞污染率极低，可显著提高分离提取效率和巨噬细胞的存活率，解决了巨噬细胞获取难度大的问题，同时还解决了异基因巨噬细胞临床治疗的问题。
所述搅拌消化经多次搅拌消化，搅拌消化的次数为2～5次，优选3次，使胎盘组织充分消化。
每次搅拌消化的时间为5～15min，优选10min。每次消化后过滤，过滤优选采用100目细胞过滤网过滤，收集过滤液。
所述血清替代品优选为helios血清替代品。
第一次离心的条件为：于3～5℃、800～1200g离心5～15min，优选地，于4℃、1000g离心10min。
所述冰浴时间为20～45min，优选30min。
第二次离心温度为3～5℃，离心转速为800～1200r/min，离心时间为3～10min，优选地，离心温度为4℃，离心转速为1000r/min，离心时间为5min。
所述洗涤采用PBS进行洗涤，洗涤次数优选为3次。
第三次离心温度为2～5℃，离心转速为900～1200r/min，离心时间为4～10min，优选地，离心温度为4℃，离心转速为1000r/min，离心时间为5min。
重悬优选采用581基础培养基进行重悬细胞。
步骤2中、所述基础培养基优选为581基础培养基。
所述淋巴细胞分离液优选为Ficoll泛影葡胺淋巴细胞分离液。
第一次离心温度为2～4℃，离心转速为400～700g，离心时间为10～30min，优选地，离心温度为4℃，离心转速为500g，离心时间为20min。
第二次离心条件为：温度3～5℃，离心转速为400～600g，离心时间为5～20min，优选地，离心温度为4℃，离心转速为500g，离心时间为10min。
步骤3中、所述扩增培养基包括混合基础培养基和细胞培养添加剂，所述混合培养基为581基础培养基和αMEM基础培养基组成的混合基础培养基，所述细胞培养添加剂包括血清替代品、谷氨酰胺和NEAA（非必须氨基酸）。所述血清替代品优选为helios血清替代品。
优选地，所述581基础培养基和αMEM基础培养基的体积比为（1～2）:1，所述扩增培养基中含有4～7wt%的helios血清替代品、0.002mol/L（1×）的谷氨酰胺和0.1mmol/L（1×）的NEAA。
更优选地，所述581基础培养基和αMEM基础培养基的体积比为1:1，所述扩增培养基中含有5wt%的helios血清替代品。
本发明所述培养基混合了贴壁细胞培养基和悬浮细胞培养基，为巨噬细胞提供了两种类型的成分供给，使提取出来的巨噬细胞在第二天就进入细胞增殖期，并且能够成功传代2代细胞。
实施例
以下通过具体实例进一步阐述本发明，这些实施例仅限于说明本发明，而不用于限制本发明范围。
实施例中采用的培养基和细胞培养添加剂等均为市售产品。
实施例1
胎盘用含有1×抗生素的PBS（聚丁二酸丁二酯）清洗后，浸泡于胎盘保存液中，4℃保存运输，分娩后24小时内进入实验程序。
取约100g胎盘组织，置于玻璃盘，用无菌剪刀将胎盘组织分离除去大血管、结缔组织，采用PBS充分洗涤，直到胎盘组织呈胶白色，尽可能去除肉眼可见的小血管和纤维连接成分，将组织剪碎至 1～3mm3。添加胰蛋白酶替代物、中性蛋白酶和581基础培养基（购自重庆华雅思创生物医药科技有限公司）组成的消化液，消化液中胰蛋白酶替代物的浓度为0.05%、中性蛋白酶为0.1g/mL，每10g胎盘组织需消化液100mL，室温匀速搅拌10min，共消化3次。每次消化完后，消化液经100目细胞过滤网过滤，收集过滤液，向其中添加helios血清替代品终止消化，于4℃、1000g条件下离心10min，弃上清，加预冷红细胞裂解液，冰浴30min，然后于4℃、1000r /min离心5min，弃上清，采用PBS 洗涤细胞3次，随后于4℃、1000r/min离心5min，弃上清，加4mL的581基础培养基重悬细胞，得到重悬细胞混合液。
向15mL离心管中加入5ml Ficoll泛影葡胺淋巴细胞分离液(密度1.007g /L)，将重悬细胞混合液缓慢加至Ficoll泛影葡胺淋巴细胞分离液上层，于4℃、500g条件下离心20min。离心完成后，液体分3层，巨噬细胞处于581基础培养基与Ficoll泛影葡胺淋巴细胞分离液的交界面上。用吸管将巨噬细胞吸出转移至15mL离心管中，向其中加4mL的581基础培养基洗涤巨噬细胞，于4℃、500g离心10min，弃上清液，得到提取纯化的巨噬细胞。
将提取纯化的巨噬细胞接种于扩增培养基中，扩增培养基由αMEM基础培养基（购自重庆华雅思创生物医药科技有限公司）、581基础培养基、helios血清替代品、谷氨酰胺和NEAA组成，其中，αMEM基础培养基和581基础培养基的体积比为1:1，扩增培养基中含有5wt%的helios血清替代品、0.002mol/L（1×）的谷氨酰胺、0.1mmol/L（1×）的NEAA细胞培养添加剂，接种培养48h后，弃上清液，贴壁的即为扩增培养的巨噬细胞，取一皿细胞进行贴壁率计算。
实施例2
胎盘用含有1×抗生素的PBS（聚丁二酸丁二酯）清洗后，浸泡于胎盘保存液中，4℃保存运输，分娩后24小时内进入实验程序。
取约100g胎盘组织，置于玻璃盘，用无菌剪刀将胎盘组织分离除去大血管、结缔组织，采用PBS充分洗涤，直到胎盘组织呈胶白色，尽可能去除肉眼可见的小血管和纤维连接成分，将组织剪碎至 1～3mm3。添加胰蛋白酶替代物、中性蛋白酶和581基础培养基组成的消化液，消化液中胰蛋白酶替代物的浓度为0.04%、中性蛋白酶为0.05g/mL，每10g胎盘组织需消化液80mL，室温匀速搅拌5min，共消化2次。每次消化完后，消化液经100目细胞过滤网过滤，收集过滤液，向其中添加helios血清替代品终止消化，于4℃、800g条件下离心5min，弃上清，加预冷红细胞裂解液，冰浴 20min，然后于4℃、800r /min离心3min，弃上清，采用PBS 洗涤细胞3次，随后于4℃、900r /min离心4min，弃上清，加4mL的581基础培养基重悬细胞，得到重悬细胞混合液。
向15mL离心管中加入5ml Ficoll泛影葡胺淋巴细胞分离液(密度1.007g /L)，将重悬细胞混合液缓慢加至Ficoll泛影葡胺淋巴细胞分离液上层，于4℃、400g条件下离心10min。离心完成后，液体分3层，巨噬细胞处于581基础培养基与Ficoll泛影葡胺淋巴细胞分离液的交界面上。用吸管将巨噬细胞吸出转移至15mL离心管中，向其中加4mL的581基础培养基洗涤巨噬细胞，于4℃、400g离心5min，弃上清液，得到提取纯化的巨噬细胞。
将提取纯化的巨噬细胞接种于扩增培养基中，扩增培养基由αMEM基础培养基、581基础培养基、helios血清替代品、谷氨酰胺和NEAA组成，其中，αMEM基础培养基和581基础培养基的体积比为1:2，扩增培养基中含有4wt%的helios血清替代品、0.002mol/L（1×）的谷氨酰胺、0.1mmol/L（1×）的NEAA细胞培养添加剂，接种培养48h后，弃上清液，贴壁的即为扩增培养的巨噬细胞，取一皿细胞进行贴壁率计算。
实施例3
胎盘用含有1×抗生素的PBS（聚丁二酸丁二酯）清洗后，浸泡于胎盘保存液中，4℃保存运输，分娩后24小时内进入实验程序。
取约100g胎盘组织，置于玻璃盘，用无菌剪刀将胎盘组织分离除去大血管、结缔组织，采用PBS充分洗涤，直到胎盘组织呈胶白色，尽可能去除肉眼可见的小血管和纤维连接成分，将组织剪碎至 1～3mm3。添加胰蛋白酶替代物、中性蛋白酶和581基础培养基组成的消化液，消化液中胰蛋白酶替代物的浓度为0.1%、中性蛋白酶为0.2g/mL，每10g胎盘组织需消化液120mL，室温匀速搅拌15min，共消化5次。每次消化完后，消化液经100目细胞过滤网过滤，收集过滤液，向其中添加helios血清替代品终止消化，于4℃、1200g条件下离心15min，弃上清，加预冷红细胞裂解液，冰浴 45min，然后于4℃、1200r /min离心10min，弃上清，采用PBS 洗涤细胞3次，随后于4℃、1200r /min离心10min，弃上清，加4mL的581基础培养基重悬细胞，得到重悬细胞混合液。
向15mL离心管中加入5ml Ficoll泛影葡胺淋巴细胞分离液(密度1.007g /L)，将重悬细胞混合液缓慢加至Ficoll泛影葡胺淋巴细胞分离液上层，于4℃、700g条件下离心30min。离心完成后，液体分3层，巨噬细胞处于581基础培养基与Ficoll泛影葡胺淋巴细胞分离液的交界面上。用吸管将巨噬细胞吸出转移至15mL离心管中，向其中加4mL的581基础培养基洗涤巨噬细胞，于4℃、600g离心20min，弃上清液，得到提取纯化的巨噬细胞。
将提取纯化的巨噬细胞接种于扩增培养基中，扩增培养基由αMEM基础培养基、581基础培养基、helios血清替代品、谷氨酰胺和NEAA组成，其中，αMEM基础培养基和581基础培养基的体积比为1:1，扩增培养基中含有7wt%的helios血清替代品、0.002mol/L（1×）的谷氨酰胺、0.1mmol/L（1×）的NEAA细胞培养添加剂，接种培养48h后，弃上清液，贴壁的即为扩增培养的巨噬细胞，取一皿细胞进行贴壁率计算。
实验例
实验例1细胞的数量提取及活力检测
对实施例1扩增培养得到的巨噬细胞的数量和活率进行检测，测试结果如表1所示：
表1
从表1可以看出，通过本发明实施例1提取出来的巨噬细胞数量为3.18×107cells，细胞活率为89.93%左右，表明本发明所述酶解法提取出来的巨噬细胞数量大，活率高、活力好。
实验例2 巨噬细胞传代
对实施例1培养1天、2天、3天、4天、5天和7天的巨噬细胞数量进行检测，测试结果如表2和图1所示。
表2
P1为第一代巨噬细胞，P2为第二代巨噬细胞，从表2和图1可以看出，本发明所述培养方法中巨噬细胞的增殖周期为5天，第七天进入平台期。其中，巨噬细胞能够成功传代至P2代，具备大规模扩增的种子细胞质量。
实验例3 细胞表面抗原检测
对实施例1制得的巨噬细胞进行表面抗原检测，测试过程如下：待细胞长至融合度达85%时进行流式检测：取实施例1细胞悬液用含10%FBS（胎牛血清）的PBS（聚丁二酸丁二酯）清洗两遍；分成两管细胞（1.53×106cells/管），向离心管中加200μL 1× PBS-BSA（牛血清白蛋白）-抗巨噬细胞抗体(FITC标记)将细胞染色，向另一离心管中加200μL 1×PBS-BSA作为对照，室温避光孵育45min，用于检测。测试结果如表3所示：
表3
由表3可以看出，实施例1培养得到的巨噬细胞的非特异性抗原达到96%以上。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。本发明的保护范围以所附权利要求为准。
Claims (2)
1.一种胎盘巨噬细胞的提取和扩增培养方法，其特征在于，所述提取和扩增培养方法包括以下步骤：
步骤1、将足月分娩的胎盘进行清洗后，除去大血管、结缔组织、小血管和纤维连接成分，然后将胎盘组织剪碎，向其中加入由胰蛋白酶替代物、中性蛋白酶和基础培养基组成的消化液，经搅拌消化、过滤，得到过滤液，向其中加入血清替代品终止消化，然后于4℃、800g条件下离心5min，或于4℃、1200g条件下离心15min，弃上清液，随后加入预冷红细胞裂解液进行冰浴20min或45min，再次于4℃、800r /min离心3min，或于4℃、1200r /min离心10min，弃上清液后进行洗涤，最后于4℃、900r /min离心4min，或于4℃、1200r /min离心10min，弃上清液、加培养基重悬细胞，得到重悬细胞混合液；
所述消化液中胰蛋白酶替代物的质量浓度为0.04%或0.1%，中性蛋白酶的浓度为0.05g/mL或0.2g/mL；
步骤2、将重悬细胞混合液缓慢添加至淋巴细胞分离液上层，于4℃、400g条件下离心10min，或于4℃、700g条件下离心30min，用吸管将处于基础培养基和淋巴细胞分离液交界面处的巨噬细胞吸出，然后向巨噬细胞中添加基础培养基，于4℃、400g离心5min，或于4℃、600g离心20min，弃上清液，得到提取纯化的巨噬细胞；
步骤3、将步骤2提取纯化的巨噬细胞接种于扩增培养基中进行培养，接种培养48h后，弃上清液，得到扩增培养的巨噬细胞；
所述扩增培养基包括混合基础培养基和细胞培养添加剂，所述混合基础培养基为581基础培养基和αMEM基础培养基组成的混合基础培养基，所述细胞培养添加剂包括血清替代品、谷氨酰胺和NEAA；
所述581基础培养基和αMEM基础培养基的体积比为2:1或1:1;
所述扩增培养基中含有4wt%或7wt%的血清替代品、0.002mol/L的谷氨酰胺和0.1mmol/L的NEAA。
2.根据权利要求1所述的提取和扩增培养方法，其特征在于，步骤1中，
搅拌消化的次数为2～5次，每次搅拌消化的时间为5～15min。
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