CN105687244A - 一种制剂、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制剂，其包括：脐血单个核细胞、脐带干细胞外泌体、营养组分和医学上可接受的溶剂，所述脐带干细胞外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养与提取得到，所述营养组分为脐血血浆或白蛋白。本申请所述制剂中的脐血单个核细胞中含有大量的造血干细胞，造血干细胞可定向分化形成各类型的血细胞，全方位修复血液系统，是造血重建的主要成分；外泌体中含有多种细胞因子，其可刺激促进造血干细胞的分化增殖，对迅速恢复血液系统起到不可替代的作用；脐血浆或人血白蛋白起到提供营养的作用，其对维持造血干细胞的活率起到根本性作用。本申请还提供了所述制剂的制备方法以及其作为预防和/或治疗造血重建的应用。

Description

一种制剂、其制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及再生医学和生物学技术领域，尤其涉及一种制剂、其制备方法及其应用。

背景技术

再生障碍性贫血(再障)是指骨髓造血衰竭所致的全血细胞减少的一种严重而难治的综合症。再生障碍性贫血的发病机制目前认为有三种：造血干细胞异常、造血微循环损伤以及免疫机制异常，因此再生障碍性贫血的治疗必须从这三方面着手；后两者均可使用药物治疗，而前者必须补充造血干细胞可达根治目的。

目前，临床上移植所用的造血干细胞主要来源于脐血。脐血单个核细胞中除了含有大量造血干/祖细胞，而脐血血浆中还含有蛋白质、各种激素、免疫球蛋白以及丰富的造血刺激因子，如GM-CSF、IL-3、IL-6、EPO、TPO等，国外曾有报导脐血用作治疗再生障碍性贫血效果较好，它与骨髓的造血干细胞相比，具有在体内植入率高的优点，并且来源丰富，采集方便，移植物抗宿主反应发生率低，适用于临床治疗，是治疗干细胞缺陷引起再障的最佳方法，且能根治。

外泌体(exosomes)是一种由真核细胞的多泡内涵体(multivesicularbodies，MVBs)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的纳米量级的膜性小囊泡，可由多种类型细胞分泌，其内含有不同种类的蛋白质、脂质、mRNAs、microRNAs以及信号分子等具有生物学活性的物质，较易与邻近细胞的细胞膜发生融合，将生物学活性物质选择性地递送至受体细胞，在不同细胞间进行信息传递，调节细胞间的信号传导，发挥多种生物学功能。

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供一种制剂，本申请提供的制剂可用于造血重建。

有鉴于此，本申请提供了一种制剂，包括：脐血单个核细胞、脐带干细胞外泌体、营养组分和医学上可接受的溶剂，所述脐带干细胞外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养与提取得到，所述营养组分为脐血血浆或白蛋白。

优选的，所述溶剂选自生理盐水或5％葡萄糖注射溶液。

优选的，所述脐带干细胞外泌体由脐带干细胞经过传代培养2～5代后提取得到。

优选的，在100ml制剂中，所述营养组分的浓度为5vol％～10vol％，所述外泌体的含量为1×10⁷～5×10⁷脐带干细胞中所提取出来的外泌体总量，所述脐带单个核细胞的数量为3×10⁸～5×10⁸个。

优选的，在100ml制剂中，所述外泌体的含量为2×10⁷脐带干细胞中所提取出来的外泌体总量。

本申请还提供了一种制剂的制备方法，包括以下步骤：

在医学上可接受的溶剂中添加营养组分，再加入脐带干细胞外泌体；

在得到的溶液中添加脐血单个核细胞，得到制剂；所述脐带干细胞外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养与提取得到，所述营养组分为脐血血浆或白蛋白。

优选的，所述溶剂选自生理盐水或5％葡萄糖注射溶液。

本申请还提供了上述方案所述的或上述方案所述的制备方法所制备的制剂在预防和/或治疗造血重建中的应用。

本申请提供了一种制剂，其包括：脐血单个核细胞、脐带干细胞外泌体、营养组分和医学上可接受的溶剂，所述脐带干细胞外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养与提取得到，所述营养组分为脐血血浆或白蛋白。本申请所述制剂中的脐血单个核细胞中含有大量的造血干细胞，造血干细胞可定向分化形成各类型的血细胞，全方位修复血液系统，是造血重建的主要成分；外泌体中含有多种细胞因子，其可刺激促进造血干细胞的分化增殖，对迅速恢复血液系统起到不可替代的作用；脐血浆或人血白蛋白起到提供营养的作用，其对维持造血干细胞的活率起到根本性作用，因此本申请提供的制剂可用于造血重建。

附图说明

图1为造血干细胞对照组的流式检测图；

图2为本申请传代后的造血干细胞的流式检测图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明实施例公开了一种制剂，包括：脐血单个核细胞、脐带干细胞外泌体、营养组分和医学上可接受的溶剂，所述脐带干细胞外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养与提取得到，所述营养组分为脐血血浆或白蛋白。

本申请所述制剂中包括脐血单个核细胞、脐带干细胞外泌体、营养组分与医学上可接受的溶剂，本申请所述制剂用于造血重建可保证细胞活率，还能提高机体造血重建的效果。

按照本发明，所述制剂中的脐带干细胞外泌体是由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养与提取制备得到。所述脐带干细胞的原代培养按照本领域技术人员熟知的方式进行。所述脐带干细胞经过原代培养后进行传代培养，所述传代培养的方式为本领域技术人员熟知的，本申请不进行特别的限制。作为优选方案，本申请所采用的脐带干细胞均为P2～P5代。所述脐带干细胞经过传代培养后进行提取，得到外泌体。本申请所述外泌体的提取优选按照invitrogen试剂盒说明书提取。脐带干细胞经过传代培养后提取，得到了外泌体。将所述外泌体进行保存以备用。

本申请所述制剂中的脐血单个核细胞按照本领域技术人员熟知的方式进行分离提取，对此本申请没有特别的限制，所述脐血单个核细胞中含有大量的造血干细胞，造血干细胞可定向分化形成各类型的血细胞，全方位修复血液系统，是造血重建的主要成分。

所述营养组分中的脐血血浆与所述白蛋白按照本领域技术人员熟知的方式进行分离提取，对此本申请没有特别的限制；所述营养组分优选为脐血血浆，其具有提供营养的作用，对维持造血干细胞的活率起到根本性作用。

本申请所述制剂的溶剂选自生理盐水或5％葡萄糖注射溶液，在实施例中，所述制剂的溶剂选自生理盐水。

按照本发明，在100ml制剂中，所述脐血血浆或人血白蛋白的浓度优选为5vol％～10vol％，更优选为5.5vol％～9.5vol％，具体的，所述脐血血浆或人血白蛋白的浓度更优选为6vol％、6.4vol％、6.8vol％、7.2vol％、7.8vol％、8.0vol％、8.5vol％或9vol％。本申请所述脐血血浆或白蛋白的浓度过大则不利于脐带单个核细胞的存活。所述外泌体的含量为1×10⁷～5×10⁷脐带干细胞中所提取出来的外泌体总量，更优选为2×10⁷脐带干细胞中所提取出来的外泌体总量。本领域技术人员熟知的，临床应用外泌体时，不会计算外泌体的具体数量，只对提取外泌体的细胞数目进行控制，这是由于用于提取外泌体的培养基都是基础培养基，其不含血清等营养物质，目的就是为了让细胞不再分裂增殖，使细胞“同步化”；在营养相对缺少的微环境下，干细胞自身会分泌很多的活性因子到胞外，即外泌体。所以，当细胞性质一致时，同种类型、相同数量的细胞分泌的外泌体的数量差异不大。

所述脐血单个核细胞的含量优选为3×10⁸～5×10⁸个，更优选为3.5×10⁸～4.5×10⁸个。

本申请还提供了一种制剂的制备方法，包括以下步骤：

在医学上可接受的溶剂中添加营养组分，再加入脐带干细胞外泌体；

在得到的溶液中添加脐血单个核细胞；所述脐带干细胞外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养与提取得到，所述营养组分为脐血血浆或白蛋白。

按照上述方法制备的制剂可使制剂中的溶剂、营养组分、脐血单个核细胞与脐带干细胞外分泌体混合均匀。本申请将得到的制剂置于4℃环境中备用等待回输。本申请所述制剂的剂型为本领域技术人员熟知的，对此本申请没有特别的限制。

本申请还提供了上述方案所述或上述方案所制备的制剂在预防和/或治疗造血重建中的应用。

本申请提供了一种制剂，其包括：脐血单个核细胞、脐带干细胞外泌体、营养组分和医学上可接受的溶剂，所述脐带干细胞外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养与提取得到，所述营养组分为脐血血浆或白蛋白。本申请所述制剂中的脐血单个核细胞中含有大量的造血干细胞，造血干细胞可定向分化形成各类型的血细胞，全方位修复血液系统，是造血重建的主要成分；外泌体中含有多种细胞因子，其可刺激促进造血干细胞的分化增殖，对迅速恢复血液系统起到不可替代的作用；脐血浆或人血白蛋白，是起到提供营养的作用，其对维持造血干细胞的活率起到根本性作用。另一方面，本申请选用新鲜的脐血提取单个核细胞，在低温环境中对脐血单个核细胞进行提取保存，尽可能的提取出活性高的造血干细胞，优选采用P2～P5带的脐血干细胞用于提取外泌体，使脐带干细胞外泌体的数量与活性较高；并且营养成分脐血血浆，提供了脐血单个核细胞类似于原有的生理环境，保证单个核细胞能够长时间保存。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的制剂、其制备方法及其应用进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。

实施例1

1)脐带干细胞原代培养

取健康足月剖腹产婴儿的脐带，于超净台中进行无菌清洗，剥离脐带羊膜和动静脉，取出沃顿胶，用手术剪进行剪碎，用DMEM+10％FBS完全培养基重悬后接种至15cm平皿中，转移至5％CO₂，37℃的环境中培养。

于5天后补液，直至细胞爬出，弃去组织块，补充新的完全培养基继续培养，待细胞形成较大的克隆，即可传代。

2)脐带干细胞传代培养

①取可传代的P0代细胞，弃掉皿内原培养液，加入10mlPBS缓冲液轻轻冲洗细胞生长面，弃去洗液。

②加入2mL0.25％胰蛋白酶，左右摇晃平皿使胰酶均匀覆盖于皿底；显微镜下观察可见细胞间隙增大，胞质回缩；当长梭形细胞变圆变亮时，立即加入10倍体积的完全培养基终止消化。

③反复吹打，直至细胞全部脱落成单细胞悬液，将悬液转移至离心管中，室温离心l5OOrpm/5min。

④弃上清，加入DMEM+10％FBS完全培养基重悬细胞，按密度为1×10⁵cells传代培养。将培养瓶置于37℃、5％二氧化碳、饱和湿度的细胞培养箱中培养。

⑤待细胞生长至融合时，重复操作⑤进行细胞扩增培养。如无说明，本研究中所用人脐带干细胞均为P2至P5代。图1和图2分别为脐带干细胞对照组与本实施例传代培养的脐带干细胞的流式检测图，由图1和图2可知，本实施例传代培养的脐带干细胞是合格的。

3)外泌体的分离

收集P2-P5代UC-MSCs培养上清，按照invitrogen试剂盒说明书提取外泌体。具体步骤为：

将培养上清转至高速离心管中，4℃，2000g离心30min，去除细胞碎片。取上清，转移至新的高速离心管中，以细胞上清液:试剂＝2:1的比例加入试剂，用祸旋器充分混匀后，置于冰箱中4℃过夜孵育。在4℃坏境中10000g离心60min，弃去上清，用500μL4℃的PBS溶液缓冲液重悬即为外泌体悬液，置于-20℃保存。

4)脐带血血浆分离及单个核细胞分离提取

在超净台中，把脐血均分至50mL离心管中，2000r/min离心10min，用巴氏吸管把上层血浆移至新的50mL离心管中，置于4℃环境中备用。

剩余血液采用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离脐带血单个核细胞：先将脐带血与生理盐水等量稀释，将稀释后的脐带血缓慢加在淋巴细胞分离液(广州斯佳生物技术有限公司)上，脐带血与Ficoll的体积比例为2：1，2000r/min离心25min，然后吸取中间的白膜层，生理盐水洗涤3次(1500r/min离心10min)，置于4℃环境中备用。

实施例2

从-20℃取出实施例1制备的外泌体，4℃环境中溶解后，按组成：外泌体+造血干细胞+脐血浆+生理盐水混匀，充分混匀后置于4℃环境中保存备用。

外泌体的含量为：1×10⁷～5×10⁷cells所提取出来的外泌体总量，其中优选用量为2×10⁷cells所提取出来的外泌体总量。

配制具体步骤：

①往生理盐水中添加脐血浆，使其终体积浓度为5％，配制5vol％脐血浆的生理盐水体积为80～100ml。

②往含有5％脐血浆的生理盐水中添加体积为100μl、2×10⁷cells所提取出来的外泌体总量。

③往含有脐血浆和外泌体的生理盐水中，添加3×10⁸～5×10⁸个脐血单个核细胞，充分混匀后置于4℃环境中备用等待回输。

实施例3

①按照实施例2的方法配制如下含量的制剂(制剂的总体积为100ml)，检测细胞的活率。

A：外泌体(2×10⁷cells)+3×10⁸～5×10⁸单个核细胞+1％脐血浆+生理盐水；

B：外泌体(2×10⁷cells)+3×10⁸～5×10⁸单个核细胞+5％脐血浆+生理盐水

C：外泌体(2×10⁷cells)+3×10⁸～5×10⁸单个核细胞+10％脐血浆+生理盐水

表1不同组别细胞活率数据表

组别	A	B	C
				实验1	85.46％±3.4％	92.55％±2.2％*	93.27％±2.8％*
实验2	86.72％±5.1％	93.46％±1.8％*	92.23％±2.6％*
				实验3	87.79％±3.8％	91.73％±1.9％*	93.68％±1.2％*

*表示与其余两组具有显著性差异，P<0.05。

组别A中3次实验获得的细胞活率约为86％；组别B的约为92％；组别C的约为93％。组别A低于另外两组，说明了1％的脐血浆，浓度低，不利于脐血单个核细胞的活力维持。

②造血重建效果(考察外泌体的量对造血重建的影响)

选取具有造血障碍的裸鼠80只，随机分成4组，每组20只。分别注射下面四种制剂，分别于1个月和3个月后抽取血液进行血细胞成分分析，评估造血重建的效果，如表2与3所示。以下制剂的总体积为100ml；

A：外泌体(1×10⁷cells)+3×10⁸～5×10⁸单个核细胞+5％脐血浆+生理盐水；

B：外泌体(2×10⁷cells)+3×10⁸～5×10⁸单个核细胞+5％脐血浆+生理盐水；

C：外泌体(5×10⁷cells)+3×10⁸～5×10⁸单个核细胞+5％脐血浆+生理盐水；

D：3×10⁸～5×10⁸单个核细胞+5％脐血浆+生理盐水

表2一个月后不同组别造血重建效果数据表

组别	A	B	C	D
					WBC>1.0	12	18	20	10
ANC>0.5	18	18	19	11
					MPV>6.4	7	12	13	7

表3三个月后不同组别造血重建效果数据表

组别	A	B	C	D
					WBC>1.0	15	20	20	11
ANC>0.5	17	18	20	12
					MPV>6.4	9	13	18	7

上述结果说明了采用了单个核细胞回输，各实验组均出现了不同程度的血液重建。其中组别A中，白细胞计数合格的为12只以上，改善情况超过70％；组别C中，超过90％的裸鼠血液系统恢复，说明了外泌体的量较多，使得造血重建效果更为明显；D组中，恢复造血重建的仍维持50％左右，造血重建效果一般。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种制剂，包括：脐血单个核细胞、脐带干细胞外泌体、营养组分和医学上可接受的溶剂，所述脐带干细胞外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养与提取得到，所述营养组分为脐血血浆或白蛋白。

2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述溶剂选自生理盐水或5％葡萄糖注射溶液。

3.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述脐带干细胞外泌体由脐带干细胞经过传代培养2～5代后提取得到。

4.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，在100ml制剂中，所述营养组分的浓度为5vol％～10vol％，所述外泌体的含量为1×10⁷～5×10⁷脐带干细胞中所提取出来的外泌体总量，所述脐带单个核细胞的数量为3×10⁸～5×10⁸个。

5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，在100ml制剂中，所述外泌体的含量为2×10⁷脐带干细胞中所提取出来的外泌体总量。

6.一种制剂的制备方法，包括以下步骤：

在医学上可接受的溶剂中添加营养组分，再加入脐带干细胞外泌体；

在得到的溶液中添加脐血单个核细胞，得到制剂；所述脐带干细胞外泌体由脐带干细胞依次经过原代培养、传代培养与提取得到，所述营养组分为脐血血浆或白蛋白。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂选自生理盐水或5％葡萄糖注射溶液。

8.权利要求1～5任一项所述的或权利要求6～7任一项所述的制备方法所制备的制剂在造血重建中的应用。