WO2011062244A1 - キャリア、その製造方法およびその用途 - Google Patents

キャリア、その製造方法およびその用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2011062244A1
WO2011062244A1 PCT/JP2010/070624 JP2010070624W WO2011062244A1 WO 2011062244 A1 WO2011062244 A1 WO 2011062244A1 JP 2010070624 W JP2010070624 W JP 2010070624W WO 2011062244 A1 WO2011062244 A1 WO 2011062244A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
drug
carrier
membrane vesicle
producing
Prior art date
Application number
PCT/JP2010/070624
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
雅彦 黒田
正視 田中
隆之 水谷
正勝 高梨
徳彦 池田
慎一郎 大野
しのぶ 上田
Original Assignee
Kuroda Masahiko
Tanaka Masami
Mizutani Takayuki
Takanashi Masakatsu
Ikeda Norihiko
Ohno Shinichiro
Ueda Shinobu
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kuroda Masahiko, Tanaka Masami, Mizutani Takayuki, Takanashi Masakatsu, Ikeda Norihiko, Ohno Shinichiro, Ueda Shinobu filed Critical Kuroda Masahiko
Publication of WO2011062244A1 publication Critical patent/WO2011062244A1/ja

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5063—Compounds of unknown constitution, e.g. material from plants or animals
    • A61K9/5068—Cell membranes or bacterial membranes enclosing drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Definitions

  • the present invention relates to a carrier for delivering a drug, a production method thereof, and an application thereof.
  • nucleic acid drugs such as siRNA (small interfering RNA) and miRNA (micro RNA) have attracted attention as pharmaceuticals for treating various diseases, and various researches are being promoted for their practical use. .
  • Non-Patent Documents 1 to 8 Known carriers for introducing the nucleic acid agent into the target cell include viral vectors that express siRNA or miRNA, introduction agents such as lipofectamine, and the like.
  • the former virus vector is regarded as a problem of safety to living bodies.
  • the latter introduction agent may be degraded in vivo before, for example, siRNA or miRNA is introduced into the target cell.
  • nucleic acid drugs face the problem that they are difficult to put into practical use from the viewpoint of delivery systems, despite their proven efficacy against various diseases. Such a problem also applies to drugs other than nucleic acid drugs.
  • an object of the present invention is to provide a carrier capable of delivering a drug with excellent safety, a manufacturing method thereof, and a use thereof.
  • the carrier of the present invention is a carrier for delivering a drug, and includes a membrane vesicle for encapsulating the drug.
  • the medicament of the present invention includes the carrier of the present invention, and the membrane vesicles contained in the carrier contain a drug.
  • the method for producing a carrier of the present invention is characterized by including a step of introducing the drug into membrane vesicle-producing cells.
  • the present inventors have clarified that when the drug is introduced into the cell producing the membrane vesicle, the membrane vesicle encapsulating the drug is released outside the cell. Further, when the membrane vesicle encapsulating the drug is brought into contact with the target cell, the target cell takes up the membrane vesicle, and the drug in the membrane vesicle is released in the cell Got. From these findings, according to the membrane vesicle, for example, the present invention has been completed on the assumption that the drug can be introduced into cells. In addition, according to the carrier of the present invention, for example, the drug can be prevented from being decomposed, and the drug can be introduced into the target cell by the membrane vesicle, which is excellent in safety. For this reason, the present invention can be said to be an extremely useful technique in the practical application of nucleic acid drugs as pharmaceuticals.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between the amount of miRNA in a cell line and the amount of miRNA in a medium at a predetermined time in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a photograph showing an observation result of a rhodamine signal in Example 2 of the present invention.
  • FIG. 3 is a photograph showing a fluorescence microscope observation result of HeLa cells transferred with PKH67-positive exosomes in Example 3 of the present invention.
  • the carrier of the present invention is a carrier for delivering a drug, and includes a membrane vesicle for encapsulating the drug.
  • the membrane vesicle is a membrane-like substance secreted by cells, and its size is, for example, 5 to 200 nm in diameter, preferably 10 to 100 nm.
  • the membrane vesicle is, for example, an exosome.
  • the exosome is, for example, a nano-order vesicle secreted extracellularly among vesicles of an inner membrane.
  • membrane vesicle examples include membrane vesicles released from various cells.
  • the cells are not particularly limited, for example, erythrocytes, dendritic cells, leukocytes, adipocytes, epithelial cells, tumor cells, megakaryocytes, platelets, placenta-derived cells, amniotic cells, chorionic cells, mesenchymal stem cells, Examples include hematopoietic stem cells, neural stem cells, induced pluripotent stem cells (Induced pluripotent stem cells: iPS cells), embryonic stem cells, cord blood-derived cells, umbilical vein endothelial cells, and umbilical artery endothelial cells.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • the cells may be, for example, cells collected from a living body or cultured cells. Examples of the latter include all established cultured cells including tumor cells.
  • the cells also include, for example, the above-described cell induction cells, undifferentiated cells, and differentiated cells. Examples of the leukocytes include lymphocytes (B cells, T cells, etc.), neutrophils, eosinophils, eosinophils, and monocytes.
  • the cells may be leukocytes other than monocytes, for example.
  • the membrane vesicle and the cell may be any animal species, for example.
  • exosomes examples include exosomes released from various cells, and the cells are as described above, for example.
  • examples of the exosome include texosomes, dexosomes, and endosomes.
  • the texosome is, for example, a vesicle derived from the tumor cell
  • the dexosome is, for example, a vesicle derived from dendritic cell.
  • the carrier of the present invention may contain the membrane vesicle.
  • the carrier of the present invention may contain, for example, membrane vesicles released from the cells, or may contain membrane vesicles existing in the cells. That is, the latter may include cells having the membrane vesicles.
  • Such cells include, for example, the cells as described above.
  • the cell having the membrane vesicle includes, for example, the meaning of a cell that forms a membrane vesicle after being administered to a living body, in addition to the cell enclosing the membrane vesicle.
  • the membrane vesicle preferably contains the drug.
  • the membrane vesicle preferably contains the drug.
  • the drug preferably has, for example, an effect on a disease, an effect on an in vivo reaction causing the disease, and the like.
  • the drug can be selected according to the purpose and is not particularly limited. Specific examples include drugs having effects such as anticancer action and antiallergic action. In the present invention, since the drug can be delivered by the membrane vesicle, the type and efficacy of the drug are not limited at all.
  • the drug is not particularly limited, and examples thereof include nucleic acids and low molecular compounds.
  • the nucleic acid drug is also referred to as a nucleic acid drug, for example.
  • the kind of the nucleic acid drug is not particularly limited, and examples thereof include DNA, RNA, artificial nucleic acid and the like.
  • Examples of the RNA include non-coding RNA such as miRNA, siRNA and shRNA, mRNA, tRNA, rRNA, ribozyme, antisense RNA and the like.
  • the low molecular weight compound is not limited at all, and examples thereof include known anticancer agents and antiallergic agents.
  • the drug may be naturally derived, for example, or may be produced by an organic synthesis method or a genetic engineering method.
  • the carrier of the present invention can be used to introduce the drug into a target cell.
  • it can be used to introduce the drug into a target cell in vivo.
  • the method of using the carrier of the present invention is not particularly limited, and for example, it may be used in any of in vivo, in vitro, and ex vivo. Since the carrier of the present invention is taken into cells as described above, it is preferable to use the carrier in contact with target cells.
  • the carrier of the present invention may be brought into contact with the target cell.
  • the carrier of the present invention and the target cell are, for example, What is necessary is just to coexist in liquids, such as a culture medium.
  • the carrier of the present invention can be taken into the target cells.
  • the target cell treated in the same manner as in vitro may be returned to the living body.
  • an administration method may be selected according to the type of the target cell, and the carrier of the present invention may be administered in vivo.
  • the administration method include oral administration and parenteral administration.
  • parenteral administration include intravenous, arterial, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous injection, and subcutaneous tissue administration.
  • the type of cell into which the carrier of the present invention is introduced, its origin, etc. are not limited at all. Further, the type of living body into which the carrier of the present invention is introduced is not limited at all, and examples thereof include humans and non-human mammals.
  • the carrier production method of the present invention is not particularly limited, and can be produced, for example, by the carrier production method of the present invention described below.
  • the carrier production method of the present invention is characterized by including the step of introducing the drug into membrane vesicle-producing cells.
  • the drug can be obtained from the membrane vesicle-producing cells. Encapsulated membrane vesicles can be obtained.
  • the membrane vesicle-producing cell is not particularly limited as long as it is a cell that produces the membrane vesicle, and among them, a cell that produces the exosome is preferable.
  • the membrane vesicle producing cell include the aforementioned cells. Specific examples include, for example, red blood cells, dendritic cells, white blood cells, adipocytes, epithelial cells, tumor cells, megakaryocyte cells, platelets, placenta-derived cells, amniotic cells, chorionic cells, mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • embryonic stem cells cord blood-derived cells, umbilical vein endothelial cells, and umbilical artery endothelial cells.
  • the cells may be, for example, cells collected from a living body or cultured cells. Examples of the latter include all established cultured cells including tumor cells.
  • the cells also include the aforementioned induced cells, undifferentiated cells and differentiated cells. Examples of the leukocytes include lymphocytes (B cells, T cells, etc.), neutrophils, eosinophils, eosinophils, and monocytes.
  • the cells may be leukocytes other than monocytes, for example.
  • the membrane vesicle and the cell may be any animal species, for example.
  • the type of the drug is not particularly limited, and examples thereof include nucleic acids and low molecular compounds as described above.
  • the type of the nucleic acid drug is not particularly limited, and examples thereof include nucleic acids such as DNA, RNA, and artificial nucleic acid.
  • Examples of the RNA include non-coding RNA such as miRNA, siRNA and shRNA, mRNA, tRNA, rRNA, ribozyme, antisense RNA and the like.
  • the drug may be naturally derived, for example, or may be produced by an organic synthesis method or a genetic engineering method.
  • the nucleic acid drug can be prevented from being decomposed and introduced into a target cell.
  • the nucleic acid drug may be introduced directly or indirectly into the membrane vesicle producing cell, for example.
  • the method for producing a carrier of the present invention preferably includes, for example, a step of introducing the nucleic acid drug or an expression reagent that expresses the nucleic acid drug into the membrane vesicle-producing cell.
  • the direct introduction includes, for example, a method of introducing the nucleic acid drug itself into the membrane vesicle-producing cell
  • the indirect introduction includes, for example, the nucleic acid agent into the membrane vesicle-producing cell. Examples thereof include a method of introducing an expression reagent that expresses a drug.
  • the introduction method is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the type of the cell, the type of the nucleic acid drug, and the like.
  • Specific examples of the introduction method include, for example, calcium phosphate method, polyethylene glycol method, lipofection method using liposomes such as lipofectamine and cationic liposome, electroporation method, ultrasonic nucleic acid introduction method, gene gun introduction method, DEAE-dextran Method, direct injection method using micro glass tube, hydrodynamic method, cationic liposome method, method using introduction adjuvant such as atelocollagen, nanoparticles and polymer, method of introducing as conjugate with nucleic acid such as aptamer, etc. Can be given.
  • the type of the expression reagent is not particularly limited.
  • the expression reagent include an expression reagent containing a precursor of the nucleic acid drug, an expression reagent containing an expression vector, and the like.
  • examples of the precursor of the nucleic acid drug include a siRNA precursor that releases siRNA, a miRNA precursor that releases miRNA, and the like.
  • a method for introducing the expression reagent containing the precursor into the membrane vesicle-producing cell is not particularly limited, and examples thereof include the method exemplified in the method for introducing a nucleic acid drug.
  • the type of the expression vector is not particularly limited as long as the target nucleic acid drug can be expressed in cells, for example.
  • the type of the expression vector can be appropriately determined according to, for example, the type of membrane vesicle-producing cell, the type of nucleic acid drug, and the like.
  • Specific examples of the expression vector include a plasmid vector, a phage vector, and a virus vector.
  • the virus vector include a retrovirus vector, a DNA virus vector, and an RNA virus vector.
  • the retroviral vector include lentiviral vectors such as immunodeficiency virus (HIV).
  • DNA virus vector examples include adenovirus vectors, adeno-associated vectors (AAV vectors), herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, box virus vectors, poliovirus vectors, symbis virus vectors, Sendai virus vectors, SV40. Etc.
  • RNA viral vector examples include lentiviral vectors such as immunodeficiency virus (HIV).
  • the expression vector preferably has a nucleic acid sequence for expressing the nucleic acid drug, for example, depending on the type of the nucleic acid drug.
  • the expression vector preferably has a nucleic acid sequence that expresses primary-miRNA (prim-miRNA), for example.
  • primary-miRNA primary-miRNA
  • a pri-miRNA corresponding to the target nucleic acid drug is generated in the membrane vesicle-producing cell, and a precursor-miRNA (pre-miRNA) having a stem-loop structure is generated by Drosha, and further by Dicer. A loop part is cut
  • an expression vector for example, a commercially available miRNA expression vector, siRNA expression vector, or the like can be used.
  • the method for introducing the expression vector into the membrane vesicle-producing cell is not particularly limited, and examples thereof include the method exemplified in the method for introducing a nucleic acid drug.
  • the carrier production method of the present invention may further include, for example, a step of culturing the membrane vesicle-producing cells after the introduction of the drug.
  • the culture conditions are not particularly limited, and can be appropriately set according to the type of the membrane vesicle-producing cells.
  • the method for producing a carrier of the present invention further includes, for example, a step of culturing membrane vesicle-producing cells after introduction of the drug and then collecting the cells, and / or the membrane vesicles produced by the cells May be included.
  • the carrier of the present invention may be a cell having the membrane vesicle. For this reason, the cells can be collected and used as a carrier.
  • the membrane vesicle-producing cell into which the drug has been introduced releases the membrane vesicle encapsulating the nucleic acid drug to the outside of the cell. For this reason, for example, after the culture of the membrane vesicle-producing cells, the culture supernatant is recovered, whereby the membrane vesicle can be recovered and used as a carrier.
  • the membrane vesicles can be collected by, for example, filter filtration, centrifugation, or the like.
  • the membrane vesicle can be fractionated based on, for example, its diameter, and as a specific example, the exosome can be fractionated based on, for example, a diameter of 30 to 100 nm.
  • Specific examples of the recovery method include, for example, centrifuging the culture solution (for example, 500 ⁇ g, 10 minutes), recovering the supernatant, and filtering the supernatant (for example, using a 0.22 ⁇ m filter).
  • the supernatant is subjected to ultracentrifugation (for example, 100,000 ⁇ g to 120,000 ⁇ g, 70 minutes) and recovered as a precipitate fraction.
  • a density gradient may be created using a specific gravity carrier such as sucrose, and density gradient centrifugation may be performed. Nat. Cell. Biol. 2007 Jun; 9 (6): p. 654-659 and Epub 2007 May 7. , PMID: 17486113, etc., and can be collected.
  • the medicament of the present invention contains the carrier of the present invention, and the membrane vesicle contained in the carrier contains the drug.
  • the pharmaceutical of this invention should just contain the said membrane vesicle containing the said chemical
  • the method of use is the same as described above unless otherwise specified.
  • the method for producing the medicament of the present invention is not limited at all except that the membrane vesicle containing the drug is used.
  • the efficacy of the medicament of the present invention can be appropriately determined depending on, for example, the type of the drug.
  • the drug includes a drug exhibiting anticancer activity
  • the medicament of the present invention can be referred to as an anticancer drug.
  • the medicament of the present invention is not limited to this, and other examples include antiallergic agents and the like depending on the kind of the drug.
  • the medicament of the present invention may be, for example, a pharmaceutical composition.
  • the treatment method of the present invention is characterized in that the medicament of the present invention is administered to a living body or a sample collected from the living body.
  • the treatment method of the present invention is characterized by using the medicament of the present invention, and the other conditions are not limited at all.
  • the medicament of the present invention may be, for example, a cell having the membrane vesicle or may include any of the membrane vesicles released from the cell. In the former case, the cells may be administered.
  • the administration method of the medicament of the present invention is not limited at all, and can be appropriately determined according to the tissue to be treated, for example, as described above, intravenous, arterial, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous, etc. injection, oral Administration, subcutaneous tissue administration and the like.
  • the therapeutic method of the present invention can be said to be a preventive method depending on, for example, the type of the nucleic acid drug and the purpose of administration. Examples of the sample collected from the living body include tissues and cells.
  • Pre-miR-199a-1 template according to the instruction manual on the multi-cloning site of a vector for expression of Precursor-microRNA (Pre-miRNA) (trade name pMIW-cGFP-Zeo, manufactured by B-Bridge)
  • Pre-miRNA Precursor-microRNA
  • pMIW-cGFP-Zeo trade name pMIW-cGFP-Zeo, manufactured by B-Bridge
  • the obtained recombinant vector was transfected into a chronic megakaryoblastic leukemia cell line MEG-01s (IFO50473) using a transfection reagent (trade name: FuGene, manufactured by Roche).
  • the transfection was performed by using RPMI1640 medium containing 10% fetal calf serum and culturing at 37 ° C. for a predetermined time (24 hours, 48 hours, and 72 hours).
  • RNA was recovered using the trade name ISOGEN (manufactured by Nippon Gene) as an RNA extraction reagent.
  • ISOGEN manufactured by Nippon Gene
  • the separated medium was further subjected to a 0.22 ⁇ m filter, and the filtrate was collected.
  • RNA was collect
  • miR-199a was measured by reverse transcription PCR (RT-PCR) using brand name TaqMan (trademark) MicroRNA Kit (made by Applied Biosystems).
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between the amount of miRNA in the cell line and the amount of miRNA in the medium at a predetermined time.
  • the X axis indicates the amount of miRNA in the cell line
  • the Y axis indicates the amount of miRNA in the medium. The plots in the figure are the results for 24 hours, 48 hours and 72 hours from the left.
  • MEG-01s (control) in which the recombinant vector has not been introduced originally does not have miR-199a, but by introduction of the recombinant vector, the cell line and the In the medium, an increase in miR-199a was confirmed over time. Further, as shown in FIG. 1, when the results of the cell line and the medium were compared for MEG-01s into which the recombinant vector was introduced, the results were proportional to the amount of miR-199a in the cell line. It was found that the amount of miR-199a in the medium increased. It is clear that when miRNA is added to the RPMI 1640 medium, it is immediately degraded.
  • the fact that miRNA is detected from the medium by RNA extraction indicates that the miRNA is not released as it is from the cells. That is, it can be said that membrane vesicles encapsulating miRNA are formed by culture and released from the cells.
  • Example 2 In this example, miRNA movement between cells was confirmed.
  • the labeled miRNA, miR-92a (SEQ ID NO: 3) labeled with rhodamine was adjusted to 100 nmol / L.
  • the labeled oligonucleotide was introduced into 1 ⁇ 10 6 K562 (human leukemia cell-derived strain) using a transfection reagent (trade name HiperFect, manufactured by Qiagen) and cultured overnight.
  • K562 was cultured in a medium containing 10% FCS-RMI1640, 0.1 mg streptomycin and 100 U penicillin under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the K562 was washed twice with PBS.
  • the concentration of K562 was adjusted with an EBM-2 medium (Cat. CC-3156, manufactured by Lonza Japan), which is a medium for endothelial cells, so that the number of K562 was 5 ⁇ 10 5 per well.
  • HUVEC manufactured by Lonza Japan
  • HUVEC human umbilical vein-derived vascular endothelial cell
  • EBM-2 medium which is a medium for endothelial cells
  • 37 ° C. and cultured under the conditions of 5% CO 2.
  • the medium was removed from the wells and 500 ⁇ L of fresh EBM-2 medium was added.
  • a film having a mesh of 0.45 ⁇ m (trade name Intercell, product number ST, manufactured by Kurabo Industries Co., Ltd.) is placed in the well, 200 ⁇ L of the K562 adjusted in concentration is added, and conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 are added.
  • the cells were cultured for 48 hours. After 48 hours of culture, the culture supernatant and the film were removed, and HUVEC were washed twice with PBS. Next, HUVEC was fixed at room temperature for 15 minutes using the 2% paraformaldehyde and washed 3 times with PBS.
  • DAPI manufactured by Dojindo Laboratories
  • 1 ⁇ g / mL DAPI manufactured by Dojindo Laboratories
  • the cover glass to which the cells were attached was peeled off, placed on a slide glass and sealed with a water-soluble mounting agent to prepare a preparation.
  • the preparation was observed for rhodamine and DAPI signals by a fluorescence microscope.
  • K562 in which a labeled oligonucleotide was not introduced was used, and the same treatment was performed for observation.
  • FIG. 2 shows the observation results of rhodamine and DAPI signals with a fluorescence microscope.
  • the upper diagram shows the rhodamine signal
  • the lower diagram shows the DAPI signal.
  • the main part in which the rhodamine signal (red fluorescence) was confirmed was surrounded by a white circle.
  • the left lane is the control
  • the right lane is the result of using K562 into which labeled miR-92a was introduced.
  • red fluorescence indicating rhodamine was not confirmed in the control.
  • FIG. 3 shows the result of observation of the signal of PKH67 using a fluorescence microscope.
  • green fluorescence was confirmed at the locations indicated by arrows. From this result, it was confirmed that exosomes stained with PKH67 (PKH67-positive exosomes) were introduced into HeLa cells.
  • Example 4 In this example, the transfer of luciferase siRNA into cells by exosomes was confirmed and evaluated in vitro using luciferase activity as an index.
  • DMEM containing 10% pretreated FBS was used for cell culture.
  • the pretreated FBS was prepared by ultracentrifugating untreated FBS at 10,000 ⁇ g for 70 minutes to remove exosomes contained in the FBS.
  • Luciferase siRNA 5'-cuuacgcugaguacuucgatt-3 '(SEQ ID NO: 4) 5'-ucgaaguacucagcguaagtt-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • the Luc / HeLa cells were adjusted to 1 ⁇ 10 5 cells / well with 1 mL of the medium and cultured overnight. 120 ⁇ L of the purified exosome (exo.1 or exo.2) was added thereto and further cultured overnight. As a control, the Luc / HeLa was cultured overnight under the condition where the supernatant and the exosome were not added.
  • luciferin reagent 100 ⁇ L was added to the Luc / HeLa after the culture, and the luciferase activity in the cells was measured using an in vivo imaging system (trade name IVIS Lumina, manufactured by XENOGEN).
  • the luciferin reagent was prepared by diluting luciferin (trade name D-luciferin potassium salt, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., hereinafter the same) with PBS so as to be 150 ⁇ g / mL.
  • the relative value of luciferase activity was determined for each cultured cell, with the control luciferase activity as 1. These results are shown in Table 3 below.
  • luciferase activity in Luc / HeLa was reduced by culturing in the presence of supernatant or exosome. From this result, it was found that an exosome was introduced into Luc / HeLa, and the luciferase siRNA in the introduced exosome was released and functioned.
  • Example 5 transfer of luciferase siRNA into cells by exosome was confirmed in vitro using luciferase activity as an index.
  • control 293T cells were cultured in the same manner except that the luciferase siRNA was not introduced, and the culture supernatant was collected.
  • the culture supernatant of 293T into which luciferase siRNA has been introduced is referred to as luciferase siRNA / exosome solution (Luc-siRNA-exosome)
  • control exosome solution control-exosome
  • luciferin reagent 200 ⁇ L was added to the cultured HCC70, and intracellular luciferase activity was measured using an in vivo imaging system (trade name IVIS Lumina, manufactured by XENOGEN). The same luciferin reagent as in Example 4 was used. And the relative value of the luciferase activity at the time of Luc-siRNA-exosome use was calculated
  • the luciferase activity in HCC70 was reduced by culturing in the presence of Luc-siRNA-exosome. Moreover, the luciferase activity decreased more by increasing the addition amount of Luc-siRNA-exosome. From this result, it was found that exosome was introduced into the HCC70, and the luciferase siRNA in the introduced exosome was released and functioned.
  • Example 6 transfer of luciferase siRNA into cells by exosome was confirmed in vivo using luciferase activity as an index.
  • luciferin diluted with PBS was administered into the abdominal cavity of the mouse under conditions of luciferin 150 mg / 20 g body.
  • the mice were anesthetized with isoflurane (trade name Isoflu, manufactured by Abbott Co., Ltd.) 20 minutes after the start of anesthesia, and then in vivo imaging system (trade name: IVIS Lumina, manufactured by XENOGEN).
  • IVIS Lumina manufactured by XENOGEN
  • the luciferase activity was measured.
  • the relative value of the luciferase activity on the 6th day was determined with the luciferase activity on the 5th day as 1 for the abdomen of the mouse administered with Luc-siRNA-exosome.
  • the relative value of the luciferase activity on the 6th day was determined from the abdomen of the mouse administered with control-exosome, assuming the luciferase activity on the 5th day as 1.
  • mice administered with control-exosome showed higher luciferase activity on the 6th day than on the 5th day.
  • mice administered with Luc-siRNA-exosome had a lower luciferase activity on day 6 than on day 5. . From this result, it can be seen that luciferase siRNA was released from Luc-siRNA-exosome, the expression of luciferase in mice was inhibited, and the luciferase activity was reduced.
  • the nucleic acid drug can be introduced into the target cells while suppressing the degradation of the drug.
  • the carrier of the present invention is also excellent in safety. For this reason, this invention is very useful, for example in the practical use as a pharmaceutical of a nucleic acid agent.

Abstract

　優れた安全性で、薬剤をデリバリー可能なキャリア、その製造方法およびその用途を提供する。　薬剤をデリバリーするためのキャリアとして、膜小胞を使用する。膜小胞産生細胞に、前記薬剤を導入して、培養した後、前記細胞から産生された膜小胞を回収することによって、前記薬剤を内包した膜小胞を得ることができる。この膜小胞を、前記薬剤を含むキャリアとして使用する。前記膜小胞は、例えば、エキソソームがあげられる。前記薬剤は、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ等の核酸薬剤があげられる。

Description

キャリア、その製造方法およびその用途
　本発明は、薬剤をデリバリーするためのキャリア、その製造方法およびその用途に関する。
　近年、種々の疾患を治療するための医薬品として、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ　ＲＮＡ）等の核酸薬剤が注目されており、その実用化に向けて、様々な研究が進められている。
　前記核酸薬剤の医薬品としての実用化は、特に、デリバリーシステムの確立が大きな課題となっている（非特許文献１～８）。前記核酸薬剤を目的の細胞に導入するためのキャリアは、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを発現するウイルスベクター、リポフェクタミン等の導入剤等が知られている。しかしながら、前者のウイルスベクターは、生体への安全性が問題視されている。また、後者の導入剤は、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが目的の細胞に導入される前に、生体内で分解されるおそれがある。このため、核酸薬剤は、種々の疾患に対する効能が証明されているにもかかわらず、デリバリーシステムの点から、実用化が困難という問題に直面している。このような問題は、核酸薬剤以外の薬剤についても、同様である。
Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００８　Ｍａｙ；２６（５）：ｐ．５６１－５６９．、Ｅｐｕｂ　２００８　Ａｐｒ　２７．、ＰＭＩＤ：　１８４３８４０１ ＲＮＡ、２００７　Ａｐｒ；１３（４）：ｐ．４３１－４５６．、Ｅｐｕｂ　２００７　Ｆｅｂ　２８．Ｒｅｖｉｅｗ．、ＰＭＩＤ：　１７３２９３５５ Ｉｔａｋａ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００７　Ｓｅｐ；１５（９）：ｐ．１６５５－１６６２．、Ｅｐｕｂ　２００７　Ｊｕｎ　５ Ｈａｒａｄａ－Ｓｈｉｂａ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２００９　Ｊａｎ　１２；１０（１）：ｐ．１１９－１２７． Ｚｈｏｕ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００８　Ａｕｇ；１６（８）：ｐ．１４８１－１４８９．、Ｅｐｕｂ　２００８　Ｍａｙ　６． Ｚｈｏｕ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００９；９（１２）：ｐ．１１４４－１１５７． Ｍｅｙｅｒ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．、２００９　Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．、６、ｐ．７５２－７６２ Ｍｅｙｅｒ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．、２００８、Ｊ．ＡＭ．Ｃｈｅ．Ｓｏｃ．、１３０，ｐ．３２７２－３２７２
　そこで、本発明は、優れた安全性で薬剤をデリバリー可能なキャリア、その製造方法およびその用途の提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明のキャリアは、薬剤をデリバリーするためのキャリアであって、前記薬剤を内包するための膜小胞を含むことを特徴とする。
　本発明の医薬は、前記本発明のキャリアを含み、前記キャリアに含まれる膜小胞が、薬剤を含むことを特徴とする。
　本発明のキャリアの製造方法は、膜小胞産生細胞に、前記薬剤を導入する工程を含むことを特徴とする。
　本発明者らは、前記膜小胞を産生する細胞内に、前記薬剤を導入すると、前記細胞外に、前記薬剤を内包する膜小胞が放出されることを明らかにした。さらに、前記薬剤を内包する膜小胞を、目的の細胞に接触させると、前記目的の細胞が前記膜小胞を取り込み、前記細胞内で前記膜小胞中の薬剤が放出されるとの知見を得た。これらの知見から、前記膜小胞によれば、例えば、前記薬剤を細胞に導入可能であるとして、本発明を完成させるに到った。また、本発明のキャリアによれば、例えば、前記薬剤の分解を防止し、前記膜小胞によって、前記薬剤を目的の細胞に導入でき、安全性にも優れる。このため、本発明は、例えば、核酸薬剤の医薬品としての実用化において、極めて有用な技術といえる。
図１は、本発明の実施例１において、所定時間における細胞株中のｍｉＲＮＡ量と培地中のｍｉＲＮＡ量との関係を示すグラフである。 図２は、本発明の実施例２において、ローダミンのシグナルの観察結果を示す写真である。 図３は、本発明の実施例３において、ＰＫＨ６７陽性エキソソームをトランスファーさせたＨｅＬａ細胞の、蛍光顕微鏡観察結果を示す写真である。
　本発明のキャリアは、前述のように、薬剤をデリバリーするためのキャリアであって、前記薬剤を内包するための膜小胞を含むことを特徴とする。
　前記膜小胞は、細胞が分泌する膜状物質であって、その大きさは、例えば、直径５～２００ｎｍ、好ましくは１０～１００ｎｍである。前記膜小胞は、例えば、エキソソームである。前記エキソソームは、例えば、細胞内膜の小胞の中でも、細胞外に分泌されるナノオーダーの小胞である。
　前記膜小胞は、例えば、種々の細胞より放出される膜小胞があげられる。前記細胞は、特に制限されず、例えば、赤血球、樹状細胞、白血球、脂肪細胞、上皮細胞、腫瘍細胞、巨核球細胞、血小板、胎盤由来細胞、羊膜細胞、絨毛膜細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、人工多能性幹細胞(Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞)、胚性幹細胞、臍帯血由来細胞、臍帯静脈内皮細胞、臍帯動脈内皮細胞があげられる。また、前記細胞は、例えば、生体から採取した細胞でもよいし、培養細胞でもよく、後者は、例えば、腫瘍細胞を含む全ての株化された培養細胞等があげられる。また、前記細胞は、例えば、前述した細胞の誘導細胞、未分化細胞および分化細胞も含む。前記白血球は、例えば、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞等）、好中球、好塩球、好酸球、単球があげられ、前記細胞は、例えば、単球を除く白血球でもよい。また、前記膜小胞および前記細胞は、例えば、動物種を問わない。
　前記エキソソームは、例えば、種々の細胞より放出されるエキソソームがあげられ、細胞は、例えば、前述の通りである。前記エキソソームは、例えば、テキソソーム、デキソソーム、エンドソーム等がある。前記テキソソームは、例えば、前記腫瘍細胞から誘導される小胞であり、前記デキソソームは、例えば、樹状細胞から誘導される小胞である。
　本発明のキャリアは、前述のように、前記膜小胞を含んでいればよい。本発明のキャリアは、例えば、前記細胞から放出された膜小胞を含んでもよいし、前記細胞内に存在する膜小胞を含んでもよい。すなわち、後者は、前記膜小胞を有する細胞を含んでもよい。このような細胞は、例えば、前述のような細胞があげられる。本発明において、前記膜小胞を有する細胞とは、例えば、前記膜小胞を内包する細胞の他に、生体に投与した後、膜小胞を生成する細胞の意味も含む。前記膜小胞を有する細胞において、前記膜小胞は、前記薬剤を内包することが好ましい。
　本発明のキャリアにおいて、前記膜小胞は、前記薬剤を含むことが好ましい。
　前記薬剤は、例えば、疾患に対する効能、疾患の原因となる生体内反応に対する効能等を有していることが好ましい。前記薬剤は、例えば、目的に応じて選択でき、特に制限されないが、具体例としては、抗ガン作用、抗アレルギー作用等の効能を有する医薬があげられる。本発明においては、前記膜小胞によって、前記薬剤をデリバリー可能であることが特徴であるため、前記薬剤の種類および効能は、何ら制限されない。
　前記薬剤は、特に制限されず、例えば、核酸、低分子化合物等があげられる。前記核酸薬剤は、例えば、核酸医薬ともいう。前記核酸薬剤の種類は、特に制限されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸等があげられる。前記ＲＮＡは、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等のノンコーディングＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ等があげられる。前記低分子化合物は、何ら制限されず、例えば、公知の抗ガン剤、抗アレルギー剤等があげられる。前記薬剤は、例えば、天然由来でもよいし、有機合成法または遺伝子工学的手法により製造したものでもよい。
　本発明のキャリアは、前述のように、前記薬剤を目的の細胞に導入するために使用でき、例えば、生体内において、前記薬剤を目的の細胞に導入するために使用できる。本発明のキャリアの使用方法は、特に制限されず、例えば、ｉｎ　ｖｉｖｏ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｅｘ　ｖｉｖｏのいずれで使用してもよい。前記本発明のキャリアは、前述のように、細胞に取り込まれることから、目的の細胞に接触する状態で使用することが好ましい。前記本発明のキャリアをｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、例えば、前記本発明のキャリアと目的の細胞を接触させればよく、具体的には、例えば、前記本発明のキャリアと目的の細胞とを、培地等の液体中で共存させればよい。これによって、前記本発明のキャリアを前記目的の細胞に取り込ませることができる。また、前記本発明のキャリアをｅｘ　ｖｉｖｏで使用する場合は、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏと同様に処理した前記目的の細胞を、生体内に戻せばよい。前記本発明のキャリアをｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合は、例えば、前記目的の細胞の種類に応じて、投与方法を選択し、前記本発明のキャリアを生体内に投与すればよい。前記投与方法は、例えば、経口投与および非経口投与があげられ、非経口投与は、例えば、静脈、動脈、筋肉内、腹腔内、皮下等への注射、皮下組織投与等があげられる。
　本発明のキャリアを導入する細胞の種類、その由来等は、何ら制限されない。また、前記本発明のキャリアを導入する生体の種類も何ら制限されず、例えば、ヒト、非ヒト哺乳類等があげられる。
　本発明のキャリアの製造方法は、特に制限されず、例えば、以下に示す本発明のキャリアの製造方法によって、製造できる。
　本発明のキャリアの製造方法は、前述のように、膜小胞産生細胞に、前記薬剤を導入する工程を含むことを特徴とする。このように、前記膜小胞産生細胞に、前記薬剤を導入することによって、前記薬剤を内包した膜小胞を有する細胞を得ることができ、また、前記膜小胞産生細胞から、前記薬剤を内包した膜小胞を得ることができる。
　前記膜小胞産生細胞は、前記膜小胞を生成する細胞であればよく、特に制限されないが、中でも、前記エキソソームを生成する細胞であることが好ましい。前記膜小胞産生細胞は、例えば、前述した細胞があげられる。具体例として、例えば、赤血球、樹状細胞、白血球、脂肪細胞、上皮細胞、腫瘍細胞、巨核球細胞、血小板、胎盤由来細胞、羊膜細胞、絨毛膜細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、人工多能性幹細胞(Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞)、胚性幹細胞、臍帯血由来細胞、臍帯静脈内皮細胞、臍帯動脈内皮細胞があげられる。また、前記細胞は、例えば、生体から採取した細胞でもよいし、培養細胞でもよく、後者は、例えば、腫瘍細胞を含む全ての株化された培養細胞等があげられる。また、前記細胞は、前述した細胞の誘導細胞、未分化細胞および分化細胞も含む。前記白血球は、例えば、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞等）、好中球、好塩球、好酸球、単球があげられ、前記細胞は、例えば、単球を除く白血球でもよい。また、前記膜小胞および前記細胞は、例えば、動物種を問わない。
　前記薬剤の種類は、特に制限されず、前述のように、例えば、核酸、低分子化合物等があげられる。前記核酸薬剤の種類は、特に制限されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸等の核酸があげられる。前記ＲＮＡは、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等のノンコーディングＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ等があげられる。前記薬剤は、例えば、天然由来でもよいし、有機合成法または遺伝子工学的手法により製造したものでもよい。
　前記薬剤が前記核酸薬剤の場合、本発明によれば、例えば、前記核酸薬剤の分解を防止して、目的の細胞に導入可能である。前記核酸薬剤は、例えば、前記膜小胞産生細胞に、直接的に導入してもよいし、間接的に導入してもよい。この場合、本発明のキャリアの製造方法は、例えば、前記膜小胞産生細胞に、前記核酸薬剤または前記核酸薬剤を発現する発現試薬を導入する工程を含むことが好ましい。すなわち、前記直接的な導入は、例えば、前記膜小胞産生細胞に、前記核酸薬剤そのものを導入する方法があげられ、前記間接的な導入は、例えば、前記膜小胞産生細胞に、前記核酸薬剤を発現する発現試薬を導入する方法があげられる。
　前記膜小胞産生細胞に前記核酸薬剤を導入する場合、その導入方法は、特に制限されず、例えば、前記細胞の種類、前記核酸薬剤の種類等に応じて、適宜決定できる。前記導入方法の具体例は、例えば、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等のリポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、遺伝子銃による導入法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等の導入補助剤を用いる方法、アプタマー等の核酸とのコンジュゲートとして導入する方法等があげられる。
　また、前述のように、前記膜小胞産生細胞に前記発現試薬を導入する場合、前記発現試薬の種類は、特に制限されない。前記発現試薬は、例えば、前記核酸薬剤の前駆体を含む発現試薬、発現ベクターを含む発現試薬等があげられる。
　前者の発現試薬において、前記核酸薬剤の前駆体は、例えば、ｓｉＲＮＡを遊離するｓｉＲＮＡ前駆体、ｍｉＲＮＡを遊離するｍｉＲＮＡ前駆体等があげられる。この場合、前記膜小胞産生細胞に、前記前駆体を含む発現試薬を導入する方法は、特に制限されず、例えば、前記核酸薬剤の導入方法において例示した方法があげられる。
　後者の発現試薬において、前記発現ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、細胞内で目的の前記核酸薬剤を発現できればよい。前記発現ベクターの種類は、例えば、前記膜小胞産生細胞の種類、核酸薬剤の種類等に応じて適宜決定できる。前記発現ベクターの具体例は、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記ウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスベクター、ＤＮＡウイルスベクター、ＲＮＡウイルスベクター等があげられる。前記レトロウイルスベクターは、例えば、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のレンチウイルスベクター等があげられる。前記ＤＮＡウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶベクター；adeno　associated　virus）、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ボックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シンビスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ＳＶ４０等があげられる。前記ＲＮＡウイルスベクターは、例えば、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のレンチウイルスベクター等があげられる。
　前記発現ベクターは、例えば、前記核酸薬剤の種類に応じて、前記核酸薬剤を発現するための核酸配列を有することが好ましい。前記核酸薬剤がｍｉＲＮＡの場合、前記発現ベクターは、例えば、ｐｒｉｍａｒｙ－ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）を発現する核酸配列を有することが好ましい。これによって、前記膜小胞産生細胞内で、目的の核酸薬剤に対応するｐｒｉ－ｍｉＲＮＡが生成され、これからＤｒｏｓｈａによりステムループ構造を持つｐｒｅｃｕｒｓｏｒ－ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）が生成され、さらに、Ｄｉｃｅｒによりループ部分が切断されて、目的のｍａｔｕｒｅ　ｍｉＲＮＡが製造される。このような発現ベクターは、例えば、市販のｍｉＲＮＡ発現用ベクター、ｓｉＲＮＡ発現用ベクター等が使用できる。前記発現ベクターの前記膜小胞産生細胞への導入方法は、特に制限されず、例えば、前記核酸薬剤の導入方法において例示した方法があげられる。
　本発明のキャリアの製造方法は、例えば、さらに、前記薬剤を導入した後の膜小胞産生細胞を、培養する工程を含んでもよい。前記培養条件は、特に制限されず、前記膜小胞産生細胞の種類等に応じて、適宜設定できる。
　本発明のキャリアの製造方法は、例えば、さらに、前記薬剤を導入後の膜小胞産生細胞を培養した後、前記細胞を回収する工程、および／または、前記細胞により生成された前記膜小胞を回収する工程を含んでもよい。前述のように、本発明のキャリアは、前記膜小胞を有する細胞でもよい。このため、前記細胞を回収して、キャリアとして使用できる。また、前述のように、前記薬剤を導入した前記膜小胞産生細胞は、前記核酸薬剤を内包する膜小胞を、細胞外に放出する。このため、例えば、前記膜小胞産生細胞の培養後、その培養上清を回収することで、前記膜小胞を回収し、キャリアとして使用できる。
　前記膜小胞の回収は、例えば、フィルターろ過、遠心分離等によって行うことができる。前記膜小胞は、例えば、その直径に基づいて分画可能であり、具体例として、前記エキソソームは、例えば、３０～１００ｎｍの直径に基づいて分画可能である。回収方法の具体例は、例えば、培養液を遠心処理（例えば、５００×ｇ、１０分）して上清を回収し、前記上清をろ過後（例えば、０．２２μｍのフィルター使用）、この上清を超遠心処理（例えば、１００，０００×ｇ～１２０，０００×ｇ、７０分）し、沈殿画分として回収する方法等があげられる。また、さらに、ショ糖等の比重担体を用いて密度勾配をつくり、密度勾配遠心を行ってもよい。また、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２００７　Ｊｕｎ；９（６）：ｐ．６５４－６５９およびＥｐｕｂ　２００７　Ｍａｙ　７．、ＰＭＩＤ：　１７４８６１１３等の文献を参照して、回収できる。
　本発明の医薬は、前述のように、本発明のキャリアを含み、前記キャリアに含まれる前記膜小胞が、前記薬剤を含むことを特徴とする。本発明の医薬は、前記薬剤を含む前記膜小胞を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。その使用方法も、特に示さない限り、前述と同様である。本発明の医薬の製造方法は、前記薬剤を含む前記膜小胞を用いる以外は、何ら制限されない。
　本発明の医薬の効能は、例えば、前記薬剤の種類によって、適宜決定できる。前記薬剤として、例えば、抗ガン作用を示す薬剤を含む場合、本発明の医薬は、抗ガン剤ということができる。本発明の医薬は、これには制限されず、この他にも、前記薬剤の種類によって、抗アレルギー剤等があげられる。本発明の医薬は、例えば、医薬組成物でもよい。
　本発明の治療方法は、生体または生体から採取した試料に、本発明の医薬を投与することを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の医薬を使用することが特徴であり、その他の条件については、何ら制限されない。前記本発明の医薬は、前述のように、例えば、前記膜小胞を有する細胞でもよいし、細胞から放出された前記膜小胞のいずれを含んでもよい。前者の場合、前記細胞を投与すればよい。前記本発明の医薬の投与方法は、何ら制限されず、例えば、治療対象の組織に応じて適宜決定でき、前述と同様に、静脈、動脈、筋肉内、腹腔内、皮下等への注射、経口投与、皮下組織投与等があげられる。本発明の治療方法は、例えば、前記核酸薬剤の種類および投与の目的によって、予防方法ともいえる。前記生体から採取した試料は、例えば、組織、細胞等があげられる。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例により制限されない。細胞の培養条件は、特に示さない限り、３７℃、５％ＣＯ２とした。
［実施例１］
　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ（Ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）発現用ベクター（商品名ｐＭＩＷ－ｃＧＦＰ－Ｚｅｏ、株式会社Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ製）のマルチクローニングサイトに、使用説明書に準じて、Ｐｒｅ－ｍｉＲ－１９９ａ－１の鋳型となる二本鎖のオリゴヌクレオチドを挿入した。前記二本鎖は、Ｐｒｅ－ｍｉＲ－１９９ａ－１の部分配列を含む、配列番号１に示すオリゴヌクレオチドと配列番号２に示すオリゴヌクレオチドとの二本鎖とした。そして、得られた組換えベクターを、トランスフェクション試薬（商品名ＦｕＧｅｎｅ、ロシュ製）を用いて、慢性巨核芽球性白血病細胞株ＭＥＧ－０１ｓ（ＩＦＯ５０４７３）にトランスフェクションした。前記トランスフェクションは、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、３７℃で所定時間（２４時間、４８時間および７２時間）培養することによって行った。
（配列番号１）
　５’－taacccagtgttcagactacctgttcaggaggctctcaatgtgtacagtagtctgcacattggttag－３’
（配列番号２）
　５’－ctagctaaccaatgtgcagactactgtacacattgagagcctcctgaacaggtagtctgaacactgggttaat－３’
　そして、前記トランスフェクション後の培養液を遠心分離して、培養した細胞株と、培地とに分離した。前記遠心分離の条件は、５００×ｇ、１０分間とした。前記細胞株については、ＲＮＡ抽出試薬として、商品名ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン製）を用いて、ＲＮＡを回収した。前記分離した培地については、さらに０．２２μｍのフィルターに供し、ろ液を回収した。そして、前記ろ液から、ＲＮＡ抽出試薬として、ｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ＰＡＲＩＳ（登録商標）を用いて、ＲＮＡを回収した。得られた各ＲＮＡ画分について、商品名ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ製）を用いて、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）により、ｍｉＲ－１９９ａを測定した。また、コントロールとして、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを未挿入の前記発現用ベクターをトランスフェクションした以外は、同様にして、前記細胞株を培養し、ｍｉＲ－１９９ａを測定した。これらの結果を、下記表１および表２に示す。表１は、前記細胞株中のｍｉＲＮＡ量の結果であり、表２は、前記培地中のｍｉＲＮＡ量の結果である。また、図１に、所定時間における前記細胞株中のｍｉＲＮＡ量と前記培地中のｍｉＲＮＡ量との関係をグラフに示す。図１において、Ｘ軸が、前記細胞株中のｍｉＲＮＡ量を示し、Ｙ軸が、前記培地中のｍｉＲＮＡ量を示す。また、同図におけるプロットは、左から２４時間、４８時間および７２時間の結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　前記表１および表２に示すように、前記組換えベクター未導入のＭＥＧ－０１ｓ（コントロール）は、本来、ｍｉＲ－１９９ａを有さないが、前記組換えベクターの導入によって、前記細胞株および前記培地において、経時的にｍｉＲ－１９９ａの増加が確認された。また、図１に示すように、前記組換えベクターを導入したＭＥＧ－０１ｓについて、前記細胞株と前記培地との結果を比較したところ、前記細胞株中のｍｉＲ－１９９ａ量に比例して、前記培地中のｍｉＲ－１９９ａ量が増加することがわかった。なお、前記ＲＰＭＩ１６４０培地中にｍｉＲＮＡを添加した場合、ただちに分解されることが明らかとなっている。このため、本実施例において、前記培地からＲＮＡ抽出によりｍｉＲＮＡが検出されているということは、細胞からｍｉＲＮＡがそのまま放出されているのではないことがわかる。すなわち、培養によって、ｍｉＲＮＡを内包する膜小胞が形成されて、細胞から細胞外に放出されているといえる。
［実施例２］
　本実施例では、細胞間におけるｍｉＲＮＡの移動を確認した。
　標識化ｍｉＲＮＡ、ローダミンで標識化したｍｉＲ－９２ａ（配列番号３）を、１００ｎｍｏｌ／Ｌに調整した。前記標識化オリゴヌクレオチドを、トランスフェクション試薬（商品名ＨｉｐｅｒＦｅｃｔ、キアゲン社製）を用いて、Ｋ５６２（ヒト白血病細胞由来株）１×１０６個に導入し、一晩培養した。Ｋ５６２の培養は、１０％　ＦＣＳ－ＲＭＩ１６４０、０．１ｍｇ　ストレプトマイシンおよび１００Ｕ　ペニシリンを含む培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行った。
ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ（配列番号３）
　　５’－uauugcacuugucccggccugu－３’
　培養後、前記Ｋ５６２をＰＢＳで２回洗浄した。そして、Ｋ５６２を、ウェルあたり５×１０５個となるように、内皮細胞用培地であるＥＢＭ－２培地（Ｃａｔ．ＣＣ－３１５６、ロンザジャパン社製）で濃度調節した。
　他方、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞であるＨＵＶＥＣ（ロンザジャパン社製）を、丸形カバーガラスを入れた２４ウェルプレートに、１×１０４個／ウェルとなるように播種した。培地は、内皮細胞用培地であるＥＢＭ－２培地を使用した。そして、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。前記ウェルから、前記培地を除去し、新たなＥＢＭ－２培地を５００μＬ加えた。
　つぎに、前記ウェルに、０．４５μｍのメッシュを有するフィルム（商品名Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ、製品番号ＳＴ、クラボウ社製）を配置し、濃度調整した前記Ｋ５６２　２００μＬを加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４８時間培養した。培養４８時間後、培養上清と前記フィルムを除去し、ＨＵＶＥＣをＰＢＳで２回洗浄した。つぎに、前記２％パラフォルムアルデヒドを用いて、ＨＵＶＥＣを、室温で１５分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。さらに、核染色のため、１μｇ／ｍＬ　ＤＡＰＩ（同仁化学研究所製）を加え、室温で５分間、遮光して反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、細胞が付着した前記カバーガラスを剥がし、スライドガラス上に乗せて水溶性封入剤で封入し、プレパラートとした。前記プレパラートを、蛍光顕微鏡により、ローダミンおよびＤＡＰＩのシグナルを観測した。また、コントロールとして、標識化オリゴヌクレオチドを未導入のＫ５６２を使用し、同様に処理し、観測を行った。
　図２の写真に、蛍光顕微鏡による、ローダミンおよびＤＡＰＩのシグナルの観察結果を示す。図２において、上の図が、ローダミンのシグナルを示し、下の図が、ＤＡＰIのシグナルを示す。図２において、ローダミンのシグナル（赤い蛍光）が確認された主要な部分は、白線の丸で囲んだ。図２において、左のレーンが、コントロール、右のレーンが、標識化ｍｉＲ－９２ａを導入したＫ５６２を使用した結果である。図２に示すように、コントロールでは、ローダミンを示す赤い蛍光が確認されなかった。これに対して、標識化ｍｉＲ－９２ａを導入したＫ５６２とＨＵＶＥＣとを培養することによって、ＨＵＶＥＣにおいて、ｍｉＲＮＡの標識であるローダミンが赤い蛍光として多数検出された。この結果から、Ｋ５６２に導入された標識化ｍｉＲＮＡが、ＨＵＶＥＣ内に導入されたことがわかる。なお、図２の下図において、細胞が存在することは確認済みである。
［実施例３］
　本実施例では、細胞内へのエキソソームのトランスファーを確認した。
（１）エキソソームの回収
　ＨｅＬａ細胞の脂質二重層を、蛍光色素（商品名ＰＫＨ６７、シグマアルドリッチジャパン社製）を用いて染色し、１０％　ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地４ｍＬ／ｄｉｓｈを用いて、３７℃で一晩培養した。培養液から上清をピペットで回収し、以下のプロトコールに従って遠心を行い、エキソソームを精製回収した。
（ａ）前記上清を、２，０００×ｇで１５ｍｉｎ遠心分離し、上清を回収
（ｂ）得られた前記上清を、１０，０００×ｇで３５ｍｉｎ遠心分離し、上清を回収
（ｃ）得られた前記上清を、１００，０００×ｇで７０ｍｉｎ遠心分離し、沈殿を回収
（ｄ）得られた前記沈殿を、１０ｍＬ　ＰＢＳに浮遊させ、１００，０００×ｇで７０ｍｉｎ遠心分離し、沈殿を回収
（ｅ）得られた前記沈殿を、エキソソームとして、ＰＢＳに浮遊させる
（２）エキソソームのトランスファー
　ＨｅＬａ細胞１×１０５個を、１０％　ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地１ｍＬを用いて、３７℃で一晩培養し、そこへ、得られた前記エキソソームの浮遊液０．５ｍＬを添加し、さらに、一晩培養した。培養後、前記ＨｅＬa細胞をＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡観察を行った。
　図３の写真に、蛍光顕微鏡による、ＰＫＨ６７のシグナルの観察結果を示す。図３において、矢印で示す箇所で、緑色の蛍光が確認された。この結果から、ＨｅＬａ細胞内に、ＰＫＨ６７で染色されたエキソソーム（ＰＫＨ６７陽性エキソソーム）が導入されたことが確認された。
［実施例４］
　本実施例では、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、ルシフェラーゼ活性を指標として、エキソソームによる細胞内へのルシフェラーゼｓｉＲＮＡのトランスファーを確認および評価した。細胞の培養には、前処理したＦＢＳを１０％含有するＤＭＥＭを使用した。前記前処理ＦＢＳは、未処理のＦＢＳを、１０，０００×ｇで７０分間超遠心し、前記ＦＢＳに含まれているエキソソームを除去して調製した。
（１）ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを内包するエキソソームの回収
　５×１０６個／ｄｉｓｈの２９３Ｔ（ＣＤ６３－ＧＦＰキメラ遺伝子を発現させたヒト胎児腎上皮細胞株、以下同様）に、１００ｎｍｏｌ／Ｌ　ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを、トランスフェクション試薬（商品名ＨｉｐｅｒＦｅｃｔ、キアゲン社製）を用いて導入し、一晩培養した。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡは、ルシフェラーゼの発現を阻害する二本鎖ｓｉＲＮＡである。前記ルシフェラーゼｓｉＲＮＡの各鎖の配列を、配列番号４および５に示す。
ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ
　　５’－cuuacgcugaguacuucgatt－３’　（配列番号４）
　　５’－ucgaaguacucagcguaagtt－３’　（配列番号５）
　培養後、２９３ＴをＰＢＳで３回洗浄し、前記培地４ｍＬ／ｄｉｓｈで一晩培養した。そして、培養液から上清をピペットで回収し、前記実施例３と同様のプロトコールにより、エキソソーム（ｅｘｏ．１）を精製回収した。前記上清を回収した後の２９３Ｔに、再度、前記培地４ｍＬを加え、さらに一晩培養した。この培養液から、前述と同様にして、上清を回収し、前記プロトコールにより、エキソソーム（ｅｘｏ．２）を精製回収した。
（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのエキソソームによるルシフェラーゼ活性の抑制
　前記回収したエキソソームの存在下で、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞（Ｌｕｃ／ＨｅＬａ）を培養し、ルシフェラーゼ活性を確認した。
　すなわち、前記Ｌｕｃ／ＨｅＬａ細胞を、前記培地１ｍＬで、１×１０５個／ウェルとなるように調整し、一晩培養した。そこに、精製した前記エキソソーム（ｅｘｏ．１またはｅｘｏ．２）１２０μＬを添加し、さらに一晩培養した。コントロールとして、前記上清および前記エキソソーム無添加の条件下で、前記Ｌｕｃ／ＨｅＬａを一晩培養した。
　そして、培養後の前記Ｌｕｃ／ＨｅＬａに、ルシフェリン試薬１００μＬを添加し、ｉｎ　ｖｉｖｏイメージングシステム（商品名ＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ、ＸＥＮＯＧＥＮ社製）を用いて、細胞内におけるルシフェラーゼ活性を測定した。前記ルシフェリン試薬は、１５０μｇ／ｍＬとなるようにルシフェリン（商品名Ｄ－ルシフェリンカリウム塩、和光純薬社製、以下同様）をＰＢＳで希釈して調製した。そして、コントロールのルシフェラーゼ活性を１として、各培養細胞について、ルシフェラーゼ活性の相対値を求めた。これらの結果を下記表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　前記表３に示すように、上清またはエキソソームの存在下で培養することによって、前記Ｌｕｃ／ＨｅＬａ内におけるルシフェラーゼ活性が低下した。この結果から、前記Ｌｕｃ／ＨｅＬａ内にエキソソームが導入され、導入された前記エキソソーム内のルシフェラーゼｓｉＲＮＡが放出されて機能したことがわかった。
［実施例５］
　本実施例では、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、ルシフェラーゼ活性を指標として、エキソソームによる細胞内へのルシフェラーゼｓｉＲＮＡのトランスファーを確認した。
（１）ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを内包するエキソソームの回収
　５×１０６個／ｄｉｓｈの２９３Ｔを、１０％　ＦＣＳ、０．１ｍｇ　ストレプトマイシンおよび１００Ｕ　ペニシリンを含有するＤＭＥＭ培地で一晩培養した。培養した２９３Ｔに、５０ｎｍｏｌ／Ｌ　ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを、トランスフェクション試薬（商品名ＨｉｐｅｒＦｅｃｔ、キアゲン社製）を用いて導入した。前記ルシフェラーゼｓｉＲＮＡは、前記実施例４と同じ二本鎖ｓｉＲＮＡを使用した。ＨｉｐｅｒＦｅｃｔを用いて導入し、一晩培養した。
　培養後、上清を除き、２９３ＴをＰＢＳで３回洗浄し、さらに一晩培養した。培養には、６本の７５Ｔフラスコを使用し、それぞれ、０．１ｍｇ　ストレプトマイシンおよび１００Ｕ　ペニシリンを含むＧｌｕｔａｍａｘ入りＤＭＥＭ（商品名、インビトロゲン社製）４ｍＬを使用した。培養液（約２４ｍＬ）を回収し、２０００×ｇ、４℃で１５分遠心分離して、上清を回収した。前記上清を、０．２２μｍのフィルターで濾過し、４℃で保存した。他方、コントロールとして、前記ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを未導入とした以外は、同様にして、２９３Ｔ細胞を培養し、培養上清を回収した。以下、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを導入した前記２９３Ｔの培養上清を、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ／エキソソーム液（Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅ）とし、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ未導入の２９３Ｔ細胞の培養上清を、コントロールエキソソーム液（ｃｏｎｔｒｏｌ-ｅｘｏｓｏｍｅ）とした。
（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのエキソソームによるルシフェラーゼ活性の抑制
　ルシフェラーゼを発現するＨＣＣ７０（ヒト乳がん細胞株）を、９６ウェルプレートに１×１０３個／培地５０μＬ／ウェルとなるように播種し、一晩培養した。前記培地は、１０％　ＦＣＳ、０．１ｍｇ　ストレプトマイシンおよび１００Ｕ　ペニシリンを含有するＤＭＥＭ培地を使用した。前記ウェルに、さらに、前記Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅまたは前記ｃｏｎｔｒｏｌ-ｅｘｏｓｏｍｅを、５０μＬまたは１００μＬを添加し、さらに一晩培養した。
　そして、培養後のＨＣＣ７０に、ルシフェリン試薬２００μＬを添加し、ｉｎ　ｖｉｖｏイメージングシステム（商品名ＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ、ＸＥＮＯＧＥＮ社製）を用いて、細胞内におけるルシフェラーゼ活性を測定した。前記ルシフェリン試薬は、前記実施例４と同じものを使用した。そして、エキソソーム添加量５０μＬの結果について、ｃｏｎｔｒｏｌ-ｅｘｏｓｏｍｅ使用時のルシフェラーゼ活性を１として、Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅ使用時のルシフェラーゼ活性の相対値を求めた。また、エキソソーム添加量１００μＬの結果について、ｃｏｎｔｒｏｌ-ｅｘｏｓｏｍｅ使用時のルシフェラーゼ活性を１として、Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅ使用時のルシフェラーゼ活性の相対値を求めた。これらの結果を下記表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　前記表４に示すように、Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅの存在下で培養することによって、前記ＨＣＣ７０内におけるルシフェラーゼ活性が低下した。また、Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅの添加量を増加させることによって、ルシフェラーゼ活性はより低下した。この結果から、前記ＨＣＣ７０内にエキソソームが導入され、導入された前記エキソソーム内のルシフェラーゼｓｉＲＮＡが放出されて機能したことがわかった。
［実施例６］
　本実施例では、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、ルシフェラーゼ活性を指標として、エキソソームによる細胞内へのルシフェラーゼｓｉＲＮＡのトランスファーを確認した。
（１）ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを内包するエキソソームの回収
　実施例５と同様にして、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ／エキソソーム液（Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅ）およびコントロールエキソソーム液（ｃｏｎｔｒｏｌ-ｅｘｏｓｏｍｅ）を調製した。
（２）ｉｎ　ｖｉｖｏでのエキソソームによるルシフェラーゼ活性の抑制
　ルシフェラーゼを発現するＨＣＣ７０　２×１０６個を、マウス（Ｒａｇ２－／－／Ｂ６マウス、メス、１２週齢）の腹腔内に投与した。前記マウスの腹腔内に、前記Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅまたは前記ｃｏｎｔｒｏｌ-ｅｘｏｓｏｍｅを、毎日１ｍＬ、連続６日間投与した。
　つぎに、前記マウスの腹腔内に、ＰＢＳで希釈したルシフェリンを、ルシフェリン１５０ｍｇ／２０ｇ　ｂｏｄｙの条件で投与した。投与５日目および６日目に、前記マウスを、イソフルラン（商品名イソフル、アボット社製）による麻酔下で、麻酔開始２０分後、ｉｎ　ｖｉｖｏ　イメージングシステム（商品名ＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ、ＸＥＮＯＧＥＮ社製）で、ルシフェラーゼ活性を測定した。そして、Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅを投与したマウスの腹部について、５日目のルシフェラーゼ活性を１として、６日目のルシフェラーゼ活性の相対値を求めた。また、ｃｏｎｔｒｏｌ-ｅｘｏｓｏｍｅを投与したマウスの腹部について、５日目のルシフェラーゼ活性を１として、６日目のルシフェラーゼ活性の相対値を求めた。これらの結果を下記表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　前記表５に示すように、ｃｏｎｔｒｏｌ-ｅｘｏｓｏｍｅを投与したマウスは、６日目において、５日目よりも高いルシフェラーゼ活性を示した。これに対して、６日目Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅの存在下で培養することによって、Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅを投与したマウスは、６日目において、５日目よりもルシフェラーゼ活性が低下していた。この結果から、Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅからルシフェラーゼｓｉＲＮＡが放出され、マウスにおけるルシフェラーゼの発現が阻害され、ルシフェラーゼ活性が低下したことがわかる。
　本発明のキャリアによれば、例えば、前記薬剤の分解を抑制して、目的の細胞に前記核酸薬剤を導入可能である。また、本発明のキャリアは、安全性にも優れる。このため、本発明は、例えば、核酸薬剤の医薬品としての実用化において、極めて有用である。
　以上、実施形態および実施例を参照して、本発明を説明したが、本発明は、上記発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
　本出願は、２００９年１１月１８日に出願された日本出願特願２００９－２６２９３８を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

Claims (22)

  1. 薬剤をデリバリーするためのキャリアであって、
    前記薬剤を内包するための膜小胞を含むことを特徴とするキャリア。
  2. 前記膜小胞が、エキソソームである、請求項１記載のキャリア。
  3. 前記膜小胞が、細胞から生成された膜小胞である、請求項１記載のキャリア。
  4. 前記細胞が、赤血球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩球、好酸球、脂肪細胞、上皮細胞、腫瘍細胞、血小板、巨核球細胞、血小板、胎盤由来細胞、羊膜細胞、絨毛膜細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、臍帯血由来細胞、臍帯静脈内皮細胞および臍帯動脈内皮細胞からなる群から選択された少なくとも一つの細胞である、請求項３記載のキャリア。
  5. 前記キャリアが、前記膜小胞を有する細胞を含む、請求項１記載のキャリア。
  6. 前記細胞が、赤血球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩球、好酸球、脂肪細胞、上皮細胞、腫瘍細胞、血小板、巨核球細胞、血小板、胎盤由来細胞、羊膜細胞、絨毛膜細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、臍帯血由来細胞、臍帯静脈内皮細胞および臍帯動脈内皮細胞からなる群から選択された少なくとも一つの細胞である、請求項５記載のキャリア。
  7. 前記膜小胞が、前記薬剤を含む、請求項１記載のキャリア。
  8. 前記薬剤が、核酸薬剤である、請求項７記載のキャリア。
  9. 前記核酸薬剤が、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項８記載のキャリア。
  10. 前記薬剤が、抗ガン作用を示す薬剤である、請求項７記載のキャリア。
  11. 請求項１記載のキャリアを含み、
    前記キャリアに含まれる膜小胞が、薬剤を含むことを特徴とする医薬。
  12. 請求項１記載のキャリアの製造方法であって、
    膜小胞産生細胞に、前記薬剤を導入する工程を含むことを特徴とするキャリアの製造方法。
  13. 前記膜小胞が、エキソソームである、請求項１２記載のキャリアの製造方法。
  14. 前記膜小胞産生細胞が、赤血球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩球、好酸球、脂肪細胞、上皮細胞、腫瘍細胞、血小板、巨核球細胞、血小板、胎盤由来細胞、羊膜細胞、絨毛膜細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、臍帯血由来細胞、臍帯静脈内皮細胞および臍帯動脈内皮細胞からなる群から選択された少なくとも一つの細胞である、請求項１２記載のキャリアの製造方法。
  15. 前記薬剤が、核酸薬剤である、請求項１２記載の製造方法。
  16. 前記核酸薬剤が、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項１５記載のキャリアの製造方法。
  17. 前記薬剤が、抗ガン作用を示す薬剤である、請求項１２記載のキャリアの製造方法。
  18. 前記薬剤を導入する工程が、前記核酸薬剤または前記核酸薬剤を発現する発現試薬を導入する工程である、請求項１５記載の製造方法。
  19. 前記発現試薬が、前記核酸薬剤を発現する発現ベクターを含む、請求項１８記載のキャリアの製造方法。
  20. 前記ベクターが、プラスミド、ファージおよびウイルスからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項１９記載のキャリアの製造方法。
  21. さらに、前記薬剤を導入後の膜小胞産生細胞を培養する工程を含む、請求項１２記載のキャリアの製造方法。
  22. さらに、前記膜小胞産生細胞の培養上清から、前記膜小胞を回収する工程を含む、請求項２１記載のキャリアの製造方法。
PCT/JP2010/070624 2009-11-18 2010-11-18 キャリア、その製造方法およびその用途 WO2011062244A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009262938 2009-11-18
JP2009-262938 2009-11-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2011062244A1 true WO2011062244A1 (ja) 2011-05-26

Family

ID=44059717

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2010/070624 WO2011062244A1 (ja) 2009-11-18 2010-11-18 キャリア、その製造方法およびその用途

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2011062244A1 (ja)

Cited By (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102302784A (zh) * 2011-08-22 2012-01-04 湖北盛齐安生物科技有限公司 一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法
WO2012091136A1 (ja) * 2010-12-28 2012-07-05 学校法人東京医科大学 発現ベクター、それを用いたキャリアの製造方法およびその用途
CN102876666A (zh) * 2011-07-15 2013-01-16 内蒙古弘泰医学科技有限公司 Rna胞体及其用途
WO2013150303A1 (en) * 2012-04-03 2013-10-10 Reneuron Limited Stem cell microparticles
WO2014013258A1 (en) * 2012-07-19 2014-01-23 Reneuron Limited Stem cell microparticles
WO2014054588A1 (ja) * 2012-10-01 2014-04-10 国立大学法人京都大学 ナノゲル/エキソソーム複合体とｄｄｓ
US8772030B2 (en) 2003-07-31 2014-07-08 Universita Degli Studi Di Roma “La Sapienza” Cardiac stem cells and methods for isolation of same
WO2014125276A1 (en) * 2013-02-12 2014-08-21 Reneuron Limited Stem cell microparticles and mirna
WO2014125277A1 (en) * 2013-02-12 2014-08-21 Reneuron Limited Method of producing microparticles
WO2015052527A1 (en) * 2013-10-09 2015-04-16 Reneuron Limited Microparticles, mirna and wound therapy
US9249392B2 (en) 2010-04-30 2016-02-02 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for maintaining genomic stability in cultured stem cells
EP2878679A4 (en) * 2012-07-24 2016-03-30 Inst Zoology Cas METHOD FOR THE NON-DESTRUCTIVE DETECTION OF MIRNA EXPRESSION IN CELLS AND FOR DETERMINING A CELL TYPE AND STATUS
CN105687244A (zh) * 2016-02-02 2016-06-22 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种制剂、其制备方法及其应用
JP2017505753A (ja) * 2013-10-24 2017-02-23 エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ 低分子量の有機双性イオンを用いたエキソソーム回収方法
US9828603B2 (en) 2012-08-13 2017-11-28 Cedars Sinai Medical Center Exosomes and micro-ribonucleic acids for tissue regeneration
US9845457B2 (en) 2010-04-30 2017-12-19 Cedars-Sinai Medical Center Maintenance of genomic stability in cultured stem cells
US9884076B2 (en) 2012-06-05 2018-02-06 Capricor, Inc. Optimized methods for generation of cardiac stem cells from cardiac tissue and their use in cardiac therapy
US10406182B2 (en) 2013-10-09 2019-09-10 Reneuron Limited Stem cell microparticles and miRNA
US11253551B2 (en) 2016-01-11 2022-02-22 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of heart failure with preserved ejection fraction
US11351200B2 (en) 2016-06-03 2022-06-07 Cedars-Sinai Medical Center CDC-derived exosomes for treatment of ventricular tachyarrythmias
US11357799B2 (en) 2014-10-03 2022-06-14 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of muscular dystrophy
US11541078B2 (en) 2016-09-20 2023-01-03 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and their extracellular vesicles to retard or reverse aging and age-related disorders
US11660355B2 (en) 2017-12-20 2023-05-30 Cedars-Sinai Medical Center Engineered extracellular vesicles for enhanced tissue delivery
US11660317B2 (en) 2004-11-08 2023-05-30 The Johns Hopkins University Compositions comprising cardiosphere-derived cells for use in cell therapy
US11759482B2 (en) 2017-04-19 2023-09-19 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for treating skeletal muscular dystrophy

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007126386A1 (en) * 2006-05-03 2007-11-08 Loetvall Jan Olof Exosome transfer of nucleic acids to cells

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007126386A1 (en) * 2006-05-03 2007-11-08 Loetvall Jan Olof Exosome transfer of nucleic acids to cells

Cited By (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8772030B2 (en) 2003-07-31 2014-07-08 Universita Degli Studi Di Roma “La Sapienza” Cardiac stem cells and methods for isolation of same
US8846396B2 (en) 2003-07-31 2014-09-30 Universita Degli Studi Di Roma “La Sapienza” Methods for the isolation of cardiac stem cells
US11660317B2 (en) 2004-11-08 2023-05-30 The Johns Hopkins University Compositions comprising cardiosphere-derived cells for use in cell therapy
US9845457B2 (en) 2010-04-30 2017-12-19 Cedars-Sinai Medical Center Maintenance of genomic stability in cultured stem cells
US9249392B2 (en) 2010-04-30 2016-02-02 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for maintaining genomic stability in cultured stem cells
WO2012091136A1 (ja) * 2010-12-28 2012-07-05 学校法人東京医科大学 発現ベクター、それを用いたキャリアの製造方法およびその用途
CN102876666B (zh) * 2011-07-15 2015-02-04 内蒙古弘泰医学科技有限公司 Rna胞体及其用途
CN102876666A (zh) * 2011-07-15 2013-01-16 内蒙古弘泰医学科技有限公司 Rna胞体及其用途
WO2013010406A1 (zh) * 2011-07-15 2013-01-24 内蒙古弘泰医学科技有限公司 Rna胞体及其用途
WO2013026268A1 (zh) * 2011-08-22 2013-02-28 湖北盛齐安生物科技有限公司 一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法
CN102302784A (zh) * 2011-08-22 2012-01-04 湖北盛齐安生物科技有限公司 一种肿瘤化疗药物制剂及其制备方法
US9351931B2 (en) 2011-08-22 2016-05-31 Hubei Soundny Biotechnology Co., Ltd. Pharmaceutical preparation for tumor chemotherapy and method for producing the same
EP3470073A1 (en) * 2012-04-03 2019-04-17 Reneuron Limited Stem cell microparticles
CN104321062A (zh) * 2012-04-03 2015-01-28 兰诺龙有限公司 干细胞微粒
WO2013150303A1 (en) * 2012-04-03 2013-10-10 Reneuron Limited Stem cell microparticles
JP2015513906A (ja) * 2012-04-03 2015-05-18 リニューロン・リミテッドＲｅＮｅｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ 幹細胞微粒子
JP2020072718A (ja) * 2012-04-03 2020-05-14 リニューロン・リミテッドＲｅＮｅｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ 幹細胞微粒子
CN104321062B (zh) * 2012-04-03 2018-09-25 兰诺龙有限公司 干细胞微粒
US9884076B2 (en) 2012-06-05 2018-02-06 Capricor, Inc. Optimized methods for generation of cardiac stem cells from cardiac tissue and their use in cardiac therapy
JP2015529450A (ja) * 2012-07-19 2015-10-08 リニューロン・リミテッドＲｅＮｅｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ 幹細胞微粒子
CN104703609A (zh) * 2012-07-19 2015-06-10 兰诺龙有限公司 干细胞微粒
WO2014013258A1 (en) * 2012-07-19 2014-01-23 Reneuron Limited Stem cell microparticles
CN104703609B (zh) * 2012-07-19 2019-02-19 兰诺龙有限公司 干细胞微粒
EP2878679A4 (en) * 2012-07-24 2016-03-30 Inst Zoology Cas METHOD FOR THE NON-DESTRUCTIVE DETECTION OF MIRNA EXPRESSION IN CELLS AND FOR DETERMINING A CELL TYPE AND STATUS
US10457942B2 (en) 2012-08-13 2019-10-29 Cedars-Sinai Medical Center Exosomes and micro-ribonucleic acids for tissue regeneration
US11220687B2 (en) 2012-08-13 2022-01-11 Cedars-Sinai Medical Center Exosomes and micro-ribonucleic acids for tissue regeneration
US9828603B2 (en) 2012-08-13 2017-11-28 Cedars Sinai Medical Center Exosomes and micro-ribonucleic acids for tissue regeneration
JPWO2014054588A1 (ja) * 2012-10-01 2016-08-25 国立大学法人京都大学 ナノゲル／エキソソーム複合体とｄｄｓ
WO2014054588A1 (ja) * 2012-10-01 2014-04-10 国立大学法人京都大学 ナノゲル/エキソソーム複合体とｄｄｓ
WO2014125276A1 (en) * 2013-02-12 2014-08-21 Reneuron Limited Stem cell microparticles and mirna
CN105142646A (zh) * 2013-02-12 2015-12-09 兰诺龙有限公司 产生微粒的方法
EP2956146B1 (en) 2013-02-12 2018-11-07 Reneuron Limited Stem cell microparticles and mirna
WO2014125277A1 (en) * 2013-02-12 2014-08-21 Reneuron Limited Method of producing microparticles
JP2016513095A (ja) * 2013-02-12 2016-05-12 リニューロン・リミテッドＲｅＮｅｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ 幹細胞微粒子及びｍｉＲＮＡ
JP2016507550A (ja) * 2013-02-12 2016-03-10 リニューロン・リミテッドＲｅＮｅｕｒｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ 微粒子の製造方法
WO2015052527A1 (en) * 2013-10-09 2015-04-16 Reneuron Limited Microparticles, mirna and wound therapy
US10406182B2 (en) 2013-10-09 2019-09-10 Reneuron Limited Stem cell microparticles and miRNA
JP2017505753A (ja) * 2013-10-24 2017-02-23 エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ 低分子量の有機双性イオンを用いたエキソソーム回収方法
US11357799B2 (en) 2014-10-03 2022-06-14 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of muscular dystrophy
US11253551B2 (en) 2016-01-11 2022-02-22 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of heart failure with preserved ejection fraction
US11872251B2 (en) 2016-01-11 2024-01-16 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of heart failure with preserved ejection fraction
CN105687244B (zh) * 2016-02-02 2019-05-10 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种制剂、其制备方法及其应用
CN105687244A (zh) * 2016-02-02 2016-06-22 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种制剂、其制备方法及其应用
US11351200B2 (en) 2016-06-03 2022-06-07 Cedars-Sinai Medical Center CDC-derived exosomes for treatment of ventricular tachyarrythmias
US11541078B2 (en) 2016-09-20 2023-01-03 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and their extracellular vesicles to retard or reverse aging and age-related disorders
US11759482B2 (en) 2017-04-19 2023-09-19 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for treating skeletal muscular dystrophy
US11660355B2 (en) 2017-12-20 2023-05-30 Cedars-Sinai Medical Center Engineered extracellular vesicles for enhanced tissue delivery

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2011062244A1 (ja) キャリア、その製造方法およびその用途
Menon et al. miRNA: a promising therapeutic target in cancer
Abd-Aziz et al. Development of microRNAs as potential therapeutics against cancer
Chen et al. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: challenges and strategies
Lee et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal
CA2997811C (en) Exosome packaging of nucleic acids
US7745419B2 (en) Pharmaceutical composition for treating cancer
Bardin et al. Emerging microRNA therapeutic approaches for cystic fibrosis
WO2012055971A1 (en) Microvesicles derived from atheroprotective endothelial cells for the treatment and prevention of atherosclerotic diseases
Raue et al. Therapeutic targeting of MicroRNAs in the tumor microenvironment
US20210355492A1 (en) Cargo loaded extracellular vesicles
US20230050813A1 (en) Nucleic acid loaded red blood cell extracellular vesicles
Jeong et al. Exosome-based antisense locked nucleic acid delivery for inhibition of type II collagen degradation in chondrocyte
US20220411785A1 (en) Library of barcoded extracellular vesicles
US20120264805A1 (en) Medicament for the treatment and prevention of liver failure
Yao et al. Mesenchymal stem cells as novel micro‐ribonucleic acid delivery vehicles in kidney disease
JP2010285426A (ja) 核酸導入方法
WO2012091136A1 (ja) 発現ベクター、それを用いたキャリアの製造方法およびその用途
WO2020246380A1 (ja) 癌治療剤
EP2592145A1 (en) Medicament for the treatment of cardiac disease
Heidel Targeted, systemic non-viral delivery of small interfering RNA in vivo
Dosil et al. MicroRNAs in T cell-immunotherapy
Mun et al. Efficient self-assembled microRNA delivery system consisting of cholesterol-conjugated microRNA and PEGylated polycationic polymer for tumor treatment
US20180008641A1 (en) Use of MicroRNA 375 in Augmenting Stem Cell Based and Endogenous Ischemic Tissue Repair
WO2016190899A1 (en) Pri-mirna libraries and methods for making and using pri-mirna libraries

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10831637

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10831637

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP