WO2012091136A1 - 発現ベクター、それを用いたキャリアの製造方法およびその用途 - Google Patents

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carrier
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peptide
cell
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雅彦 黒田
慎一郎 大野
正勝 高梨
しのぶ 上田
隆之 水谷
徳彦 池田
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学校法人東京医科大学
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a carrier for delivering a drug and its use.
  • nucleic acid drugs such as siRNA (small interfering RNA) and miRNA (micro RNA) have attracted attention as pharmaceuticals for treating various diseases, and various researches are being promoted for their practical use. .
  • Non-Patent Documents 1 to 8 Non-Patent Documents 1 to 8
  • Known carriers for introducing the nucleic acid agent into the target cell include viral vectors that express siRNA or miRNA, introduction agents such as lipofectamine, and the like.
  • the former virus vector is regarded as a problem of safety to living bodies.
  • the latter introduction agent may be degraded in vivo before, for example, siRNA or miRNA is introduced into the target cell.
  • nucleic acid drugs face the problem that they are difficult to put into practical use from the viewpoint of delivery systems, despite their proven efficacy against various diseases. Such a problem also applies to drugs other than nucleic acid drugs such as low molecular weight compounds.
  • the present invention aims to provide a carrier capable of delivering a drug with excellent safety, a method for producing the same, and a use thereof, and more specifically, a carrier capable of efficiently delivering the drug to target cells, and the production thereof.
  • the object is to provide a method and its use.
  • the expression vector of the present invention is characterized by having a nucleic acid sequence encoding a binding peptide capable of binding to a membrane protein of a target cell.
  • the carrier-producing cell of the present invention is a carrier-producing cell that produces a carrier for delivering a drug, and is a membrane vesicle-producing cell having the expression vector of the present invention.
  • the method for producing a carrier-producing cell of the present invention is a method for producing a carrier-producing cell that produces a carrier for delivering a drug, the method comprising introducing the expression vector of the present invention into a membrane vesicle-producing cell. It is characterized by including.
  • the carrier of the present invention is a carrier for delivering a drug, and is characterized by being a membrane vesicle having a binding peptide capable of binding to a membrane protein of a target cell as a membrane peptide.
  • the method for producing a carrier of the present invention is a method for producing a carrier for delivering a drug, and includes the step of culturing the carrier-producing cells of the present invention.
  • the medicament of the present invention comprises at least one of the carrier-producing cells of the present invention into which a drug is introduced and the carrier of the present invention in which the drug is encapsulated.
  • the membrane vesicle that contains the drug When the drug is introduced into a cell that produces the membrane vesicle, the membrane vesicle that contains the drug is released outside the cell, and the membrane vesicle that contains the drug is released. It has been found that when brought into contact with cells, the cells take up the membrane vesicles and release the drug in the membrane vesicles within the cells. Further, the present inventors have found that the membrane vesicle can be efficiently bound to the target cell by presenting the binding peptide capable of binding to the membrane protein of the target cell of interest to the membrane vesicle, thereby completing the present invention. I came to let you.
  • a cell producing the membrane vesicle presenting the binding peptide can be obtained. And, if the membrane vesicle presenting the binding peptide is used as a drug carrier, the binding peptide binds to the membrane protein of the target cell, so that the drug can be efficiently administered to the target cell, and it is safe. Excellent in properties.
  • the membrane vesicle encapsulates the drug, for example, the membrane vesicle can be prevented from being decomposed until it binds to the target cell and is released into the cell. For this reason, the present invention can be said to be a very useful technique for practical use of drugs such as nucleic acid drugs as pharmaceuticals.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between the amount of miRNA in a cell line and the amount of miRNA in a medium at a predetermined time in Reference Example 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a photograph showing the observation results of rhodamine signals in Reference Example 2 of the present invention.
  • FIG. 3 is a photograph showing a fluorescence microscope observation result of HeLa cells to which PKH67-positive exosomes were transferred in Reference Example 3 of the present invention.
  • FIG. 4 is an electron micrograph showing the appearance of HCC cultured in the presence of a conditioning medium containing exosomes in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the luciferase activity of HCC cultured in the presence of a conditioning medium containing exosomes in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the luciferase activity of HCC cultured in the presence of a conditioning medium containing exosomes in Example 2 of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of analysis by flow cytometry in Example 3 of the present invention.
  • FIG. 8 (A) is a photograph showing the in vivo imaging result of the mouse in Example 4 of the present invention, and FIG. 8 (B) is a graph showing the fluorescence intensity in the tumor part of the mouse.
  • FIG. 8 (A) is a photograph showing the in vivo imaging result of the mouse in Example 4 of the present invention
  • FIG. 8 (B) is a graph showing the fluorescence intensity in the tumor part of the mouse.
  • FIG. 10 (A) is a photograph showing the in vivo imaging result of the mouse in Example 5 of the present invention
  • FIG. 10 (B) is a graph showing the fluorescence intensity in the tumor part of the mouse.
  • the expression vector of the present invention is characterized by having a nucleic acid sequence encoding a binding peptide that can bind to a membrane protein of a target cell.
  • the expression vector of the present invention can be used in the method for producing the carrier-producing cell as described above. For this reason, the expression vector of the present invention only needs to be able to express the nucleic acid sequence in the production cell of the membrane vesicle into which the vector is introduced.
  • the target cell means a target cell into which the membrane vesicle produced from the membrane vesicle-producing cell is introduced, and examples thereof include a cell to which delivery of the drug is desired.
  • the target cell is not particularly limited, and examples thereof include cancer cells, tumor cells, hepatocytes, nerve cells, pancreatic Langhans cells, muscle cells, bone tissue, cartilage tissue, stem cells and the like.
  • the stem cells include mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, embryonic stem cells and the like as described later.
  • the cancer cells are not particularly limited, and examples thereof include breast cancer cells, lung cancer cells, blood cancer cells such as leukocytes, colon cancer cells, rectal cancer cells, gastric cancer cells, and prostate cancer cells.
  • the membrane protein of the target cell is not particularly limited and can be appropriately set according to the type of the target cell.
  • the membrane protein include EGFR (Epidmal growth factor receptor), c-kit, Bcr-Abl, CD20, and G protein-coupled receptor.
  • the binding peptide that can bind to the membrane protein is not particularly limited, and can be appropriately set depending on the type of the membrane protein.
  • the membrane protein is EGFR
  • examples of the binding peptide include EGF (Epidmal growth factor), a partial peptide thereof, and a GE11 peptide.
  • the coding sequence of the binding peptide may be determined from the amino acid sequence of the peptide, for example, or may be based on base sequence information such as a database.
  • the expression vector of the present invention may further have, for example, at least one of a nucleic acid sequence encoding a transmembrane peptide and a nucleic acid sequence encoding a signal peptide.
  • the nucleic acid sequence encoding the transmembrane peptide and It has a nucleic acid sequence encoding the signal peptide.
  • the signal peptide is not particularly limited, and examples thereof include an Ig ⁇ chain leader sequence and the like, and specifically, a mouse Ig ⁇ chain VJ2-C signal peptide and the like.
  • the coding sequence of the signal peptide for example, a known sequence can be adopted, and it may be determined from the amino acid sequence of the peptide or based on base sequence information such as a database.
  • the transmembrane peptide is not particularly limited, and examples thereof include a transmembrane domain of PDGFR (Platelet-derived growth factor receptor).
  • PDGFR Platinum-derived growth factor receptor
  • the coding sequence of the transmembrane peptide for example, a known sequence can be adopted, and it can be determined from the amino acid sequence of the peptide, or based on base sequence information such as a database.
  • the expression vector of the present invention may have, for example, the various nucleic acid sequences as chimeric nucleic acid sequences.
  • the chimeric nucleic acid sequence includes, for example, a chimeric nucleic acid sequence encoding a chimeric peptide including the binding peptide and the transmembrane peptide, a chimeric nucleic acid sequence encoding a chimeric peptide including the binding peptide and the signal peptide, and the binding peptide And a chimeric nucleic acid sequence encoding a chimeric peptide comprising the transmembrane peptide and the signal peptide.
  • the arrangement order of the various nucleic acid sequences is not particularly limited.
  • the expression vector preferably has, for example, from the 5 'side, the signal peptide coding sequence, the binding peptide coding sequence, and the transmembrane peptide coding sequence.
  • These various nucleic acid sequences are preferably, for example, chimeric nucleic acid sequences as described above. Based on such a chimeric nucleic acid sequence, for example, a chimeric peptide having the signal peptide on the N-terminal side of the binding peptide and having the transmembrane peptide added on the C-terminal side of the binding peptide can be expressed. .
  • the coding sequence of the binding peptide, the coding sequence of the transmembrane peptide, and the coding sequence of the signal peptide may be linked directly or via a linker or the like. Good.
  • the expression vector of the present invention may further have other nucleic acid sequences, for example.
  • the other nucleic acid sequences include peptide tag coding sequences.
  • the peptide tag is not particularly limited, and examples thereof include an HA tag, myc tag, His tag, FLAG tag, HQ tag, HN tag, and HAT tag.
  • As the coding sequence of the peptide tag for example, a known sequence can be adopted, and it can be determined from the amino acid sequence of the peptide, or based on base sequence information such as a database.
  • the expression vector of the present invention has the chimeric nucleic acid sequence
  • the chimeric nucleic acid sequence may further have the other nucleic acid sequence, for example.
  • the other nucleic acid sequence is preferably inserted into the chimeric nucleic acid sequence so that a chimeric peptide containing the binding peptide, the signal peptide and the binding peptide can be expressed, for example.
  • the chimeric nucleic acid sequence may have, for example, a peptide tag coding sequence between the coding sequence of the transmembrane peptide and the coding sequence of the binding peptide.
  • the chimeric nucleic acid sequence may have, for example, a peptide tag coding sequence between the binding peptide coding sequence and the signal peptide coding sequence.
  • the expression vector of the present invention may be inserted into the vector so that the various nucleic acid sequences can be expressed, for example.
  • the type of the vector can be appropriately set according to, for example, the type of the membrane vesicle producing cell described below.
  • the vector include non-viral vectors and viral vectors.
  • the non-viral vector include a plasmid vector and a phage vector.
  • the virus vector include a retrovirus vector, a DNA virus vector, and an RNA virus vector.
  • the retroviral vector include lentiviral vectors such as immunodeficiency virus (HIV).
  • DNA virus vector examples include adenovirus vectors, adeno-associated vectors (AAV vectors), herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, box virus vectors, poliovirus vectors, symbis virus vectors, Sendai virus vectors, SV40. Etc.
  • RNA viral vector examples include lentiviral vectors such as immunodeficiency virus (HIV).
  • the expression vector may further contain, for example, a regulatory sequence that regulates the expression of the various nucleic acid sequences.
  • the regulatory sequences include, for example, a promoter derived from cytomegalovirus (CMV), rous sarcoma virus (RSV), simian virus-40 (SV-40), muscle ⁇ -actin promoter, herpes simplex virus (HSV), etc. Examples thereof include tissue-specific promoters such as thymidine kinase promoter, growth hormone-regulated promoters, promoters under the control of the lac operon sequence, inducible promoters such as zinc-inducible metallothionein promoter, and regulatable promoters.
  • CMV cytomegalovirus
  • RSV-40 rous sarcoma virus
  • SV-40 simian virus-40
  • HSV herpes simplex virus
  • tissue-specific promoters such as thymidine kinase promoter, growth hormone-regulated promoters, promoters under the
  • the regulatory sequence may be arranged at a site capable of functionally regulating the expression of the various nucleic acid sequences based on a known method.
  • an enhancer sequence, a polyadenylation signal, an origin of replication sequence (ori) and the like may be included.
  • the expression vector may further include a selection marker coding sequence, for example.
  • a selection marker include drug resistance markers, fluorescent protein markers, enzyme markers, cell surface receptor markers, and the like.
  • the carrier-producing cell of the present invention is a carrier-producing cell that produces a carrier for delivering a drug, and is a membrane vesicle-producing cell having the expression vector of the present invention.
  • the membrane vesicle is a membrane-like substance secreted by cells, and its size is, for example, 5 to 200 nm in diameter, preferably 10 to 100 nm.
  • the membrane vesicle is, for example, an exosome.
  • the exosome is, for example, a nano-order vesicle secreted extracellularly among vesicles of an inner membrane. Examples of the exosome include texosomes, dexosomes, and endosomes.
  • the texosome is, for example, a vesicle derived from the tumor cell, and the dexosome is, for example, a vesicle derived from dendritic cell.
  • the production cell of the membrane vesicle is not particularly limited, for example, erythrocyte, dendritic cell, leukocyte, adipocyte, epithelial cell, tumor cell, megakaryocyte cell, platelet, placenta-derived cell, amniotic cell, chorioblast cell, Examples include mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic stem cells, cord blood-derived cells, umbilical vein endothelial cells, and umbilical artery endothelial cells.
  • the cells may be, for example, cells collected from a living body or cultured cells. Examples of the latter include all established cultured cells including tumor cells.
  • the cells also include, for example, the above-described cell induction cells, undifferentiated cells, and differentiated cells.
  • the leukocytes include lymphocytes (B cells, T cells, etc.), neutrophils, eosinophils, eosinophils, and monocytes.
  • the membrane vesicle and the cell may be any animal species, for example.
  • the membrane vesicle-producing cell may further be a cell into which a drug is introduced.
  • carrier-producing cells for example, cells having membrane vesicles encapsulating the drug, cells capable of releasing membrane vesicles encapsulating the drug, and membrane vesicles encapsulating the drug are obtained. be able to.
  • the drug preferably has, for example, an effect on a disease, an effect on an in vivo reaction causing the disease, and the like.
  • the drug can be selected according to the purpose and is not particularly limited. Specific examples of the drug include drugs having efficacy such as anticancer action and antiallergic action.
  • Examples of the drug include nucleic acids and low molecular compounds.
  • the type of the nucleic acid drug is not particularly limited, and examples thereof include nucleic acids such as DNA, RNA, and artificial nucleic acid.
  • Examples of the RNA include non-coding RNA such as miRNA, siRNA and shRNA, mRNA, tRNA, rRNA, ribozyme, antisense RNA and the like.
  • the drug may be naturally derived, for example, or may be produced by an organic synthesis method or a genetic engineering method.
  • an expression reagent that expresses the nucleic acid drug may be introduced.
  • the expression reagent is, for example, as described later.
  • the carrier-producing cells of the present invention can be produced, for example, by the method for producing carrier-producing cells of the present invention.
  • the method for producing a carrier-producing cell of the present invention is a method for producing a carrier-producing cell that produces a carrier for delivering a drug, wherein the expression vector of the present invention is used as a production cell for membrane vesicles.
  • the method includes a step of introducing into the above.
  • the method for introducing the expression vector into the membrane vesicle producing cell is not particularly limited.
  • the introduction method can be determined as appropriate according to, for example, the type of cell producing the membrane vesicle.
  • Examples of the introduction method include a calcium phosphate method, a polyethylene glycol method, a lipofection method using liposome, an electroporation method, an ultrasonic nucleic acid introduction method, a gene gun introduction method, a DEAE-dextran method, and a direct glass tube method.
  • Examples thereof include an injection method, a hydrodynamic method, a cationic liposome method, and a method using an introduction aid.
  • liposome examples include lipofectamine and cationic liposome
  • introduction aid examples include atelocollagen, nanoparticles, and polymers.
  • the introduction into the production cell may be, for example, in vivo or in vitro .
  • the production method of the present invention may further include a step of introducing a drug into the production cell of the membrane vesicle.
  • a drug for example, carrier-producing cells having membrane vesicles encapsulating the drug, carrier-producing cells capable of releasing membrane vesicles encapsulating the drug, and released from the carrier-producing cells, A membrane vesicle or the like encapsulating a drug can be obtained.
  • the drug is, for example, as described above.
  • the drug may be introduced directly or indirectly into the membrane vesicle-producing cell. That is, in the method for producing a carrier of the present invention, the step of introducing the drug may be, for example, a process of introducing the nucleic acid drug, or a process of introducing an expression reagent that expresses the nucleic acid drug.
  • the direct introduction include a method of introducing the nucleic acid drug itself into the production cell of the membrane vesicle.
  • Examples of the indirect introduction include a method of introducing an expression reagent that expresses the nucleic acid drug into the production cell of the membrane vesicle.
  • the introduction method is not particularly limited, and can be appropriately determined according to, for example, the type of membrane vesicle producing cell, the type of the nucleic acid agent, and the like.
  • Examples of the introduction method include the same methods as those for the expression vector described above.
  • the expression reagent is not particularly limited as long as it expresses the nucleic acid drug.
  • Examples of the expression reagent include an expression reagent containing a precursor of the nucleic acid drug, an expression reagent including an expression vector for expressing the nucleic acid drug, and the like.
  • examples of the precursor of the nucleic acid drug include a siRNA precursor that releases siRNA, a miRNA precursor that releases miRNA, and the like.
  • the method for introducing the expression reagent containing the precursor into the production cell of the membrane vesicle is not particularly limited, and for example, is the same as the method for introducing the nucleic acid drug.
  • the type of the expression vector is not particularly limited as long as the target nucleic acid drug can be expressed in cells, for example.
  • the expression vector may be inserted into the vector so that a nucleic acid sequence for expressing the nucleic acid drug can be expressed, for example.
  • the type of the vector can be appropriately determined according to, for example, the type of cell that produces the membrane vesicle, the type of the nucleic acid drug, and the like.
  • the vector for example, the non-viral vector and the viral vector as described above can be used, and specific examples are as described above.
  • the expression vector preferably has a nucleic acid sequence that expresses primary-miRNA (prim-miRNA), for example.
  • primary-miRNA primary-miRNA
  • a pri-miRNA corresponding to the target nucleic acid drug is generated in the membrane vesicle-producing cell, and a precursor-miRNA (pre-miRNA) having a stem-loop structure is generated by Drosha, and further by Dicer.
  • a loop part is cut
  • a commercially available miRNA expression vector, siRNA expression vector, or the like can be used.
  • the method for introducing the expression vector into the membrane vesicle producing cell is not particularly limited, and examples thereof include the method exemplified in the method for introducing a nucleic acid drug.
  • the carrier of the present invention is a carrier for delivering a drug, and includes a membrane vesicle having a binding peptide capable of binding to a membrane protein of a target cell as a membrane peptide.
  • the membrane vesicle preferably contains the drug.
  • the drug is, for example, as described above.
  • the carrier of the present invention may contain the membrane vesicle.
  • the membrane vesicle may be, for example, a membrane vesicle present in the carrier-producing cell. That is, the present invention may include a cell having the membrane vesicle, and examples of the cell include the carrier-producing cell of the present invention.
  • the cell having the membrane vesicle includes, for example, the meaning of the cell that produces the membrane vesicle after being administered to a living body, in addition to the cell enclosing the membrane vesicle.
  • the membrane vesicle preferably contains the drug.
  • Examples of the membrane vesicle include exosomes released from various cells, and the cell is, for example, a production cell of the membrane vesicle as described above.
  • Examples of the exosome include texosomes, dexosomes, and endosomes.
  • the membrane vesicle may further contain, for example, at least one of the transmembrane peptide and the signal peptide as the membrane peptide, and preferably has the transmembrane peptide and the signal peptide.
  • the membrane peptide includes the transmembrane peptide and / or the signal peptide
  • the membrane peptide is preferably a chimeric peptide including the binding peptide, the transmembrane peptide, and / the signal peptide.
  • the arrangement of the various peptides is not particularly limited.
  • the signal peptide is provided on the N-terminal side of the binding peptide, and the transmembrane peptide is added on the C-terminal side of the binding peptide.
  • the chimera peptide made can be illustrated.
  • the membrane vesicle may further contain, for example, another peptide as the membrane peptide, and examples of the other peptide include a peptide tag as described above.
  • the membrane peptide is preferably a chimeric peptide containing, for example, the binding peptide, the transmembrane peptide and / or the signal peptide, and the peptide tag.
  • the arrangement of each peptide in the chimeric peptide is not particularly limited, and for example, the order described in the description of the expression vector can be used.
  • the peptide tag may be, for example, between the transmembrane peptide and the binding peptide, or between the binding peptide and the signal peptide.
  • the carrier of the present invention can be manufactured, for example, by the method for manufacturing the carrier of the present invention.
  • the method for producing a carrier of the present invention is a method for producing a carrier for delivering a drug, and includes the step of culturing the carrier-producing cells of the present invention.
  • the carrier production method of the present invention may include, for example, a step of producing the carrier-producing cells by the aforementioned method for producing carrier-producing cells prior to the culturing step.
  • the method for producing the carrier-producing cells is as described above.
  • the carrier-producing cells are preferably the carrier-producing cells into which the drug has been introduced, for example, as described above.
  • the manufacturing method of the carrier of this invention further includes the process of introduce
  • the culturing conditions are not particularly limited, and can be set as appropriate according to the type of the production cell of the membrane vesicle.
  • the method for producing a carrier of the present invention may further include, for example, a step of recovering the cell after culturing the carrier-producing cell and / or a step of recovering the membrane vesicle produced by the cell.
  • the carrier of the present invention may be a cell having the membrane vesicle. For this reason, the cells can be collected and used as a carrier.
  • the carrier-producing cells into which the drug has been introduced release the membrane vesicle encapsulating the drug to the outside of the cell. For this reason, for example, after culturing the carrier-producing cells, the culture supernatant is recovered, whereby the membrane vesicles can be recovered and used as a carrier.
  • the membrane vesicles can be collected by, for example, filter filtration, centrifugation, or the like.
  • the membrane vesicle can be fractionated based on, for example, its diameter, and as a specific example, the exosome can be fractionated based on, for example, a diameter of 30 to 100 nm.
  • Specific examples of the recovery method include, for example, centrifuging the culture solution (for example, 500 ⁇ g, 10 minutes), recovering the supernatant, and filtering the supernatant (for example, using a 0.22 ⁇ m filter).
  • the supernatant is subjected to ultracentrifugation (for example, 100,000 ⁇ g to 120,000 ⁇ g, 70 minutes) and recovered as a precipitate fraction.
  • a density gradient may be created using a specific gravity carrier such as sucrose, and density gradient centrifugation may be performed. Nat. Cell. Biol. 2007 Jun; 9 (6): p. 654-659 and Epub 2007 May 7. , PMID: 17486113, etc., and can be collected.
  • the carrier of the present invention can be used, for example, to introduce the drug into a target cell.
  • the carrier can be used to introduce the drug into a target cell.
  • the method of using the carrier of the present invention is not particularly limited, and for example, it may be used in any of in vivo , in vitro , and ex vivo . Since the carrier of the present invention is taken into cells as described above, it is preferable to use the carrier in contact with target cells. When the carrier of the present invention is used in vitro , for example, the carrier of the present invention and the target cell may be contacted.
  • the carrier of the present invention and the target cell are What is necessary is just to coexist in liquids, such as a culture medium.
  • the carrier of the present invention can be taken into the target cells.
  • the target cell treated in the same manner as in vitro may be returned to the living body.
  • an administration method may be selected according to the type of the target cell, and the carrier of the present invention may be administered in vivo. Examples of the administration method include oral administration and parenteral administration. Examples of parenteral administration include intravenous, arterial, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous injection, and subcutaneous tissue administration.
  • the type of cell into which the carrier of the present invention is introduced, its origin, etc. are not limited at all. Further, the type of living body into which the carrier of the present invention is introduced is not limited, and examples thereof include humans and non-human animals. Examples of the non-human animal include non-human primates, rodents, dogs and cats.
  • the medicament of the present invention comprises at least one of the carrier-producing cells of the present invention into which the drug is introduced and the carrier of the invention in which the drug is encapsulated.
  • the method of using the medicament of the present invention is the same as described above unless otherwise specified.
  • the efficacy of the medicament of the present invention can be appropriately determined depending on, for example, the type of the drug.
  • the medicament of the present invention can be referred to as an anticancer drug.
  • the medicament of the present invention is not limited to this, and other examples include antiallergic agents and the like depending on the kind of the drug.
  • the medicament of the present invention may be, for example, a pharmaceutical composition.
  • the treatment method of the present invention is characterized in that the medicament of the present invention is administered to a living body or a sample collected from the living body.
  • the treatment method of the present invention is characterized by using the medicament of the present invention, and the other conditions are not limited at all.
  • the medicine when the medicine is administered to a sample collected from a living body, for example, the sample after administration may be returned to the patient.
  • the medicament of the present invention may be, for example, a cell having the membrane vesicle or may include any of the membrane vesicles released from the cell. In the former case, the cells may be administered.
  • the administration method of the medicament of the present invention is not limited at all, and can be appropriately determined according to the tissue to be treated, for example, as described above, intravenous, arterial, intramuscular, intraperitoneal, subcutaneous, etc. injection, oral Administration, subcutaneous tissue administration and the like.
  • the therapeutic method of the present invention can be said to be a preventive method depending on, for example, the type of the nucleic acid drug and the purpose of administration. Examples of the sample collected from the living body include tissues and cells.
  • the present invention can be used not only for medical purposes such as treatment, but also for purposes other than medical purposes, for example.
  • Example 1 Exosomes presenting EGF or GE11 as a membrane peptide were prepared, and the affinity for breast cancer cell line HCC70, which is an EGFR-presenting cell, was confirmed.
  • Morphological observation pDisplay (registered trademark) Vector (trade name, manufactured by Invitrogen) having a signal peptide (Ig ⁇ chain leader sequence) coding sequence and a transmembrane peptide (PDGFR transmembrane domain) coding sequence was used.
  • the EGF protein coding sequence or the GE11 peptide coding sequence shown below is inserted into the multi-cloning site of this pDisplay (registered trademark) Vector (between the coding sequence of the signal peptide and the coding sequence of the transmembrane peptide) to express EGF Vector and GE11 expression vector were constructed.
  • pDisplay (registered trademark) Vector in which the coding sequence was not inserted was used.
  • Each expression vector was transfected into fibroblast cell line HEK293 using a transfection reagent (trade name FuGene, manufactured by Roche). The transfection was performed using a D-MEM (10% FCS) medium at 37 ° C. for 24 hours.
  • the conditioning medium EGF using the EGF expression vector includes an exosome (EGF-exosome) in which EGF is displayed as a membrane protein on the surface, and the conditioning medium GE11 using the GE11 expression vector has GE11 displayed on the surface.
  • the conditioning medium cont containing the exosome (GE11-exosome) and using the control expression vector contained an exosome (cont-exosome) on which neither EGF nor GE11 was presented on the surface.
  • a 6-well plate was seeded with 4 ⁇ 10 5 breast cancer cell lines (HCC70) per well and cultured at 37 ° C. for 24 hours using the conditioning medium (2 mL per well). And the form of HCC70 after culture
  • FIG. 4A shows the results of the conditioning medium cont
  • FIG. 4B shows the results of the conditioning medium EGF
  • FIG. 4C shows the results of HCC70 cultured in the presence of the conditioning medium GE11.
  • a part of the expanded cell is surrounded by a solid line.
  • the HCC using the conditioning medium EGF and the conditioning medium GE11 showed a clear increase in extension more clearly than the HCC 70 using the conditioning medium cont. This is presumably because EGF and GE11 presented on the surface of the exosome contained in the conditioning medium bound to EGFR on the surface of HCC70.
  • HCC70 a recombinant cell into which a luciferase gene expression vector was introduced was used. And it culture
  • FIG. 5 shows the results of luciferase activity of HCC70 cultured in the presence of the conditioning medium cont and the conditioning medium EGF.
  • HCC70 using the conditioning medium EGF showed about twice as much activity as HCC70 using the conditioning medium cont, confirming an increase in proliferation. This is presumably because EGF and GE11 presented on the surface of the exosome contained in the conditioning medium bound to EGFR on the surface of HCC70. From this result, it was found that the affinity of exosomes for EGFR-presenting cells can be improved by presenting EGF and GE11 on the surface of exosomes.
  • EGF was presented as a membrane peptide, exosomes encapsulating miRNA were prepared, and growth inhibition of breast cancer cell line HCC70, which is an EGFR-presenting cell, was confirmed.
  • the EGF expression vector was transfected into the fibroblast cell line HEK293.
  • HEK293 (EGF) after transfection was transfected with a tumor suppressor let-7a miRNA having the following sequence or a non-target miRNA.
  • the transfection conditions were the same as the transfection of the EGF expression vector.
  • the cells 24 hours after transfection were washed 3 times with PBS, and further cultured at 37 ° C. for 24 hours.
  • the culture medium was centrifuged (2000 ⁇ g, 15 minutes) to remove dead cells, and the supernatant was collected.
  • the supernatant was filtered through a 0.22 ⁇ m filter, and the resulting filtrate was used as a conditioning medium.
  • the conditioning medium obtained by introducing the let-7a miRNA (let-7a miRNA) contained EGF as a membrane protein on the surface and contained exosomes containing the let-7a miRNA.
  • the conditioning medium (non target miRNA) obtained by introducing the non-target miRNA contained exosomes with EGF present as a membrane protein on the surface and encapsulating the non-target miRNA.
  • a conditioning medium (None) was prepared in the same manner, except that pDisplay (registered trademark) Vector in which the EGF coding sequence was not inserted was transfected into HEK293 and miRNA was not transfected. did.
  • HCC70 was cultured in the presence of the conditioning medium in the same manner as in Example 1 except that each conditioning medium was used. Then, luciferase activity was measured in the same manner as in Example 1 (2). The result is shown in FIG.
  • FIG. 6 shows the results of luciferase activity of HCC70 cultured in the presence of the conditioning medium (None), the conditioning medium (Non target miRNA), and the conditioning medium (let-7a miRNA).
  • the HCC70 treated with the conditioning medium (None target miRNA) showed an equivalent luciferase activity
  • the conditioning medium HCC70 treated with (let-7a miRNA) significantly suppressed luciferase activity.
  • Inhibition of luciferase activity means suppression of growth of cancer cell HCC70. From this result, it was found that by presenting EGF to exosomes, affinity to HCC70 presenting EGFR was improved, and binding to HCC70 released the tumor suppressor let-7a miRNA into HCC70. Recognize.
  • Example 3 An exosome presenting EGF or GE11 as a membrane peptide was prepared, and the uptake of the exosome was confirmed in a lung cancer cell line which is an EGFR-presenting cell.
  • the lipid bilayer of the fibroblast cell line HEK293 is stained with a fluorescent dye (trade name PKH67, manufactured by Sigma-Aldrich Japan) according to a conventional method, and then the exosome on which EGF is presented in the same manner as in Example 1 above.
  • a fluorescent dye trade name PKH67, manufactured by Sigma-Aldrich Japan
  • EGF-exosome an exosome displaying GE11
  • GE11-exosome an exosome not displaying both EGF and GE11
  • cont-exosome were prepared. These exosomes were labeled with the fluorescent dye.
  • the lung cancer cell was used in the same manner as in Example 1 except that the exosome labeled with the fluorescent dye was used and the lung cancer cell lines A549, HCC3255, and HCC827 were used instead of the breast cancer cell line.
  • the strain was cultured. And after culture
  • the medium for A549 used E-MEM containing 10% FBS
  • the medium for H3255 and HCC827 used RPMI 1640 containing 10% FBS.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of analysis by flow cytometry.
  • normal lung cancer cells without exosome Normal
  • lung cancer cells using labeled cont-exosome PH67-labeled Exome
  • lung cancer cells using labeled EGF-exosome PH67-
  • the results of lung cancer cells labeled EGF-Exome
  • labeled GE11-exosomes PH67-labeled GE11-Exome
  • the numerical values in the graph indicate the average value of the fluorescence intensity.
  • the exosomes on which EGF or GE11 is presented have a significantly higher proportion of PKH-positive cells compared to exosomes on which EGF or GE11 is not presented. It was confirmed that exosomes can be introduced into.
  • Example 4 The exosome presenting GE11 as a membrane peptide was analyzed for its ability to accumulate in breast cancer cells in vivo .
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, an exosome displaying GE11 (GE11-exosome) and an exosome not displaying both EGF and GE11 (cont-exosome) were prepared, and a lipophilic near-infrared fluorescent dye (commercial product) Labeled with the name XenoLight DiR, Caliper Life Sciences).
  • Breast cancer cell line HCC70 was transplanted into RAG2 knockout mice to prepare breast cancer model mice. 4 ⁇ g of the labeled exosome was administered to the model mouse from its tail vein. Then, 24 hours after administration, the in vivo accumulation of tumors and exosomes in each organ was analyzed by in vivo imaging using an IVIS imaging system.
  • FIG. 8 (A) is a photograph showing in vivo imaging results of mice, the left is a mouse (Normal Exosome) administered with labeled cont-exosome, and the right is administered with labeled GE11-exosome. It is the result of the mouse
  • FIG. 8B is a graph showing fluorescence intensity in the tumor part (mammary gland) of the mouse. As shown in FIG. 8 (A), in the mouse administered with labeled GE11-exosome, the region surrounded by the dotted line showed extremely strong fluorescence intensity. Further, as shown in FIG.
  • GE11 was presented as a membrane peptide, an exosome encapsulating miRNA was prepared, and breast cancer growth suppression in vivo was confirmed.
  • exosome A supernatant containing exosomes was obtained in the same manner as in Example 2 except that the GE11 expression vector of Example 1 was used instead of the EGF expression vector, and washed HEK293 cells after transfection were cultured for 48 hours. It was collected. From the supernatant, exosome (GE / let-7a) was purified by the same method as in Reference Example 3 described later.
  • exosomes (Empty / let-7a) were recovered from HEK293 cells not containing the GE11 expression vector and let-7a miRNA.
  • the non target miRNA of Example 2 was used to recover exosomes (GE11 / Control) from HEK293 cells added with the GE11 expression vector, and HEK293 cells without the GE11 expression vector added.
  • the exosomes (Empty / Control) were recovered from the above.
  • exosomes (Normal Exosomes) were collected from HEK293 cells not containing the GE11 expression vector and miRNA.
  • let-7a miRNA contained in these exosomes was analyzed by the microRNA assay method according to a conventional method. The analysis result was corrected with the expression level of miR-16, the expression level of endogenous let-7a was taken as 1, and the relative value was determined. These results are shown in FIG.
  • FIG. 9 is a graph showing the relative expression level of let-7a miRNA contained in exosomes. As shown in FIG. 9, let-7a miRNA showed a high expression level in exosomes collected from cells added with GE11 expression vector and let-7a miRNA.
  • a luciferase expression vector was transfected into a breast cancer cell line HCC70 to produce a breast cancer cell line HCC70 that constantly expresses a luciferase gene. This cell was transplanted into a RAG2 knockout mouse to prepare a breast cancer model mouse. Tumor engraftment was confirmed using palpation and an IVIS imaging system.
  • the exosome (GE11 / let-7a) containing let-7a prepared in the above (1) was labeled with a near-infrared fluorescent dye (trade name: XenoLight DiR, Caliper Life Sciences).
  • the labeled exosome was administered from the tail vein to the model mouse for 4 weeks under the condition of 1 ⁇ g / week.
  • luciferin was administered to the model mice from the tail vein in the same manner, and tumor development was analyzed using an IVIS imaging system.
  • FIG. 10 (A) is a photograph showing the results of in vivo imaging of mice. From the left, labeled exosome (Normal Exome), labeled exosome (Empty / Control), labeled exosome (GE11 / Control), It is the result of the mouse
  • a region surrounded by a solid line indicated by an arrowhead is a region showing luciferin fluorescence.
  • FIG. 10B is a graph showing fluorescence intensity in the tumor part (mammary gland) of the mouse. As shown in FIG.
  • mice administered with labeled exosomes had very little fluorescence of luciferin compared to other mice.
  • Pre-miR-199a-1 template according to the instruction manual on the multi-cloning site of a vector for expression of Precursor-microRNA (Pre-miRNA) (trade name pMIW-cGFP-Zeo, manufactured by B-Bridge)
  • Pre-miRNA Precursor-microRNA
  • pMIW-cGFP-Zeo trade name pMIW-cGFP-Zeo, manufactured by B-Bridge
  • the obtained recombinant vector was transfected into a chronic megakaryoblastic leukemia cell line MEG-01s (IFO50473) using a transfection reagent (trade name: FuGene, manufactured by Roche).
  • the transfection was performed by using RPMI1640 medium containing 10% fetal calf serum and culturing at 37 ° C. for a predetermined time (24 hours, 48 hours, and 72 hours).
  • RNA was recovered using the trade name ISOGEN (manufactured by Nippon Gene) as an RNA extraction reagent.
  • ISOGEN manufactured by Nippon Gene
  • the separated medium was further subjected to a 0.22 ⁇ m filter, and the filtrate was collected.
  • RNA was collect
  • miR-199a was measured by reverse transcription PCR (RT-PCR) using brand name TaqMan (trademark) MicroRNA Kit (made by Applied Biosystems).
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between the amount of miRNA in the cell line and the amount of miRNA in the medium at a predetermined time.
  • the X axis indicates the amount of miRNA in the cell line
  • the Y axis indicates the amount of miRNA in the medium. The plots in the figure are the results for 24 hours, 48 hours and 72 hours from the left.
  • MEG-01s (control) in which the recombinant vector has not been introduced originally does not have miR-199a, but by introduction of the recombinant vector, the cell line and the In the medium, an increase in miR-199a was confirmed over time. Further, as shown in FIG. 1, when the results of the cell line and the medium were compared for MEG-01s into which the recombinant vector was introduced, the results were proportional to the amount of miR-199a in the cell line. It was found that the amount of miR-199a in the medium increased. It is clear that when miRNA is added to the RPMI 1640 medium, it is immediately degraded.
  • the fact that miRNA is detected from the medium by RNA extraction indicates that the miRNA is not released as it is from the cells. That is, it can be said that membrane vesicles encapsulating miRNA are formed by culture and released from the cells.
  • the labeled miRNA, miR-92a (SEQ ID NO: 3) labeled with rhodamine was adjusted to 100 nmol / L.
  • the labeled oligonucleotide was introduced into 1 ⁇ 10 6 K562 (human leukemia cell-derived strain) using a transfection reagent (trade name HiperFect, manufactured by Qiagen) and cultured overnight.
  • K562 was cultured in a medium containing 10% FCS-RMI1640, 0.1 mg streptomycin and 100 U penicillin under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the K562 was washed twice with PBS.
  • the concentration of K562 was adjusted with an EBM-2 medium (Cat. CC-3156, manufactured by Lonza Japan), which is a medium for endothelial cells, so that the number of K562 was 5 ⁇ 10 5 per well.
  • HUVEC manufactured by Lonza Japan
  • HUVEC human umbilical vein-derived vascular endothelial cell
  • EBM-2 medium which is a medium for endothelial cells
  • 37 ° C. and cultured under the conditions of 5% CO 2.
  • the medium was removed from the wells and 500 ⁇ L of fresh EBM-2 medium was added.
  • a film having a mesh of 0.45 ⁇ m (trade name Intercell, product number ST, manufactured by Kurabo Industries Co., Ltd.) is placed in the well, 200 ⁇ L of the K562 adjusted in concentration is added, and conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 are added.
  • the cells were cultured for 48 hours. After 48 hours of culture, the culture supernatant and the film were removed, and HUVEC were washed twice with PBS. Next, HUVEC was fixed at room temperature for 15 minutes using the 2% paraformaldehyde and washed 3 times with PBS.
  • DAPI manufactured by Dojindo Laboratories
  • 1 ⁇ g / mL DAPI manufactured by Dojindo Laboratories
  • the cover glass to which the cells were attached was peeled off, placed on a slide glass and sealed with a water-soluble mounting agent to prepare a preparation.
  • the preparation was observed for rhodamine and DAPI signals by a fluorescence microscope.
  • K562 in which a labeled oligonucleotide was not introduced was used, and the same treatment was performed for observation.
  • FIG. 2 shows the observation results of rhodamine and DAPI signals with a fluorescence microscope.
  • the upper diagram shows the rhodamine signal
  • the lower diagram shows the DAPI signal.
  • the main part in which the rhodamine signal (red fluorescence) was confirmed was surrounded by a white circle.
  • the left lane is the control
  • the right lane is the result of using K562 into which labeled miR-92a was introduced.
  • red fluorescence indicating rhodamine was not confirmed in the control.
  • FIG. 3 shows the result of observation of the signal of PKH67 using a fluorescence microscope.
  • green fluorescence was confirmed at the locations indicated by arrows. From this result, it was confirmed that exosomes stained with PKH67 (PKH67-positive exosomes) were introduced into HeLa cells.
  • luciferase siRNA 5 ⁇ 10 6 cells / dish of 293T (human fetal kidney epithelial cell line expressing CD63-GFP chimeric gene, the same applies hereinafter) were transferred to 100 nmol / L luciferase siRNA.
  • the solution was introduced using an injection reagent (trade name HiperFect, manufactured by Qiagen) and cultured overnight.
  • Luciferase siRNA is a double-stranded siRNA that inhibits the expression of luciferase.
  • the sequence of each strand of the luciferase siRNA is shown in SEQ ID NOs: 4 and 5.
  • the Luc / HeLa cells were adjusted to 1 ⁇ 10 5 cells / well with 1 mL of the medium and cultured overnight. 120 ⁇ L of the purified exosome (exo.1 or exo.2) was added thereto and further cultured overnight. As a control, the Luc / HeLa was cultured overnight under the condition where the supernatant and the exosome were not added.
  • luciferin reagent 100 ⁇ L was added to the Luc / HeLa after the culture, and the luciferase activity in the cells was measured using an in vivo imaging system (trade name IVIS Lumina, manufactured by XENOGEN).
  • the luciferin reagent was prepared by diluting luciferin (trade name D-luciferin potassium salt, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., hereinafter the same) with PBS so as to be 150 ⁇ g / mL.
  • the relative value of luciferase activity was determined for each cultured cell, with the control luciferase activity as 1. These results are shown in Table 3 below.
  • luciferase activity in Luc / HeLa was reduced by culturing in the presence of supernatant or exosome. From this result, it was found that an exosome was introduced into Luc / HeLa, and the luciferase siRNA in the introduced exosome was released and functioned.
  • luciferase siRNA / exosome solution Luc-siRNA-exosome
  • control exosome solution control-exosome solution
  • luciferin reagent 200 ⁇ L was added to the cultured HCC70, and intracellular luciferase activity was measured using an in vivo imaging system (trade name IVIS Lumina, manufactured by XENOGEN). The same luciferin reagent as that in Reference Example 4 was used. Then, with respect to the result of adding 50 ⁇ L of exosome, the luciferase activity when using control-exosome was taken as 1, and the relative value of luciferase activity when using Luc-siRNA-exosome was determined.
  • the luciferase activity in HCC70 was reduced by culturing in the presence of Luc-siRNA-exosome. Moreover, the luciferase activity decreased more by increasing the addition amount of Luc-siRNA-exosome. From this result, it was found that an exosome was introduced into the HCC70, and the luciferase siRNA in the introduced exosome was released and functioned.
  • luciferin diluted with PBS was administered into the abdominal cavity of the mouse under conditions of luciferin 150 mg / 20 g body.
  • the mice were anesthetized with isoflurane (trade name Isoflu, manufactured by Abbott Co., Ltd.) 20 minutes after the start of anesthesia, and then in vivo imaging system (trade name: IVIS Lumina, manufactured by XENOGEN).
  • IVIS Lumina manufactured by XENOGEN
  • the luciferase activity was measured.
  • the relative value of the luciferase activity on the 6th day was determined with the luciferase activity on the 5th day as 1 for the abdomen of the mouse administered with Luc-siRNA-exosome.
  • the relative value of the luciferase activity on the 6th day was determined from the abdomen of the mouse administered with control-exosome, assuming the luciferase activity on the 5th day as 1.
  • mice administered with control-exosome showed higher luciferase activity on the 6th day than on the 5th day.
  • mice administered with Luc-siRNA-exosome had a lower luciferase activity on day 6 than on day 5. . From this result, it can be seen that luciferase siRNA was released from Luc-siRNA-exosome, the expression of luciferase in mice was inhibited, and the luciferase activity was reduced.
  • a cell producing the membrane vesicle presenting the binding peptide can be obtained. And, if the membrane vesicle presenting the binding peptide is used as a drug carrier, the binding peptide binds to the membrane protein of the target cell, so that the drug can be efficiently administered to the target cell, and it is safe. Excellent in properties.
  • the membrane vesicle encapsulates the drug, for example, it can prevent the drug from being decomposed until it binds to the target cell and is released into the target cell. For this reason, the present invention can be said to be a very useful technique in practical use as a pharmaceutical such as a nucleic acid drug.

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Abstract

　薬剤の分解を防止し、優れた安全性で、生体内のターゲット細胞に特異的に前記薬剤をデリバリー可能なキャリアを提供する。　ターゲット細胞の膜タンパク質に結合可能な結合ペプチドをコードする核酸配列を有する発現ベクターを、膜小胞の産生細胞に導入することによって、キャリア産生細胞を得る。前記キャリア産生細胞は、膜ペプチドとして、ターゲット細胞の膜タンパク質に結合可能な結合ペプチドを有する膜小胞を産生できる。この膜小胞は、前記ターゲット細胞の膜タンパク質に結合するため、前記膜小胞に前記薬剤を内包させることで、前記ターゲット細胞に特異的に前記薬剤を投与できる。

Description

発現ベクター、それを用いたキャリアの製造方法およびその用途
　本発明は、薬剤をデリバリーするためのキャリアの製造方法およびその用途に関する。
　近年、種々の疾患を治療するための医薬品として、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ　ＲＮＡ）等の核酸薬剤が注目されており、その実用化に向けて、様々な研究が進められている。
　前記核酸薬剤を医薬品として実用するにあたって、特に、デリバリーシステムの確立が大きな課題となっている（非特許文献１～８）。前記核酸薬剤を目的の細胞に導入するためのキャリアは、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを発現するウイルスベクター、リポフェクタミン等の導入剤等が知られている。しかしながら、前者のウイルスベクターは、生体への安全性が問題視されている。また、後者の導入剤は、例えば、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが目的の細胞に導入される前に、生体内で分解されるおそれがある。このため、核酸薬剤は、種々の疾患に対する効能が証明されているにもかかわらず、デリバリーシステムの点から、実用化が困難という問題に直面している。このような問題は、例えば、低分子化合物等の、核酸薬剤以外の薬剤についても、同様である。
Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００８　Ｍａｙ；２６（５）：ｐ．５６１－５６９．、Ｅｐｕｂ　２００８　Ａｐｒ　２７．、ＰＭＩＤ：　１８４３８４０１ ＲＮＡ、２００７　Ａｐｒ；１３（４）：ｐ．４３１－４５６．、Ｅｐｕｂ　２００７　Ｆｅｂ　２８．Ｒｅｖｉｅｗ．、ＰＭＩＤ：　１７３２９３５５ Ｉｔａｋａ　Ｋ．ｅｔ　ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００７　Ｓｅｐ；１５（９）：ｐ．１６５５－１６６２．、Ｅｐｕｂ　２００７　Ｊｕｎ　５ Ｈａｒａｄａ－Ｓｈｉｂａ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２００９　Ｊａｎ　１２；１０（１）：ｐ．１１９－１２７． Ｚｈｏｕ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００８　Ａｕｇ；１６（８）：ｐ．１４８１－１４８９．、Ｅｐｕｂ　２００８　Ｍａｙ　６． Ｚｈｏｕ　Ｊ．ｅｔ　ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００９；９（１２）：ｐ．１１４４－１１５７． Ｍｅｙｅｒ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．、２００９　Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．、６、ｐ．７５２－７６２ Ｍｅｙｅｒ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．、２００８、Ｊ．ＡＭ．Ｃｈｅ．Ｓｏｃ．、１３０，ｐ．３２７２－３２７２
　そこで、本発明は、優れた安全性で薬剤をデリバリー可能なキャリア、その製造方法およびその用途の提供を目的とし、より詳細には、前記薬剤を効率よくターゲット細胞にデリバリー可能なキャリア、その製造方法およびその用途の提供を目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明の発現ベクターは、ターゲット細胞の膜タンパク質に結合可能な結合ペプチドをコードする核酸配列を有することを特徴とする。
　本発明のキャリア産生細胞は、薬剤をデリバリーするためのキャリアを産生するキャリア産生細胞であって、前記本発明の発現ベクターを有する、膜小胞の産生細胞であることを特徴とする。
　本発明のキャリア産生細胞の製造方法は、薬剤をデリバリーするためのキャリアを産生するキャリア産生細胞の製造方法であって、前記本発明の発現ベクターを、膜小胞の産生細胞に導入する工程を含むことを特徴とする。
　本発明のキャリアは、薬剤をデリバリーするためのキャリアであって、膜ペプチドとして、ターゲット細胞の膜タンパク質に結合可能な結合ペプチドを有する膜小胞であることを特徴とする。
　本発明のキャリアの製造方法は、薬剤をデリバリーするためのキャリアの製造方法であって、前記本発明のキャリア産生細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。
　本発明の医薬は、薬剤が導入された前記本発明のキャリア産生細胞および前記薬剤が内包された前記本発明のキャリアの少なくとも一方を含むことを特徴とする。
　本発明者らは、前記膜小胞を産生する細胞内に前記薬剤を導入すると、前記細胞外に、前記薬剤を内包する膜小胞が放出されること、前記薬剤を内包する膜小胞を細胞に接触させると、前記細胞が前記膜小胞を取り込み、前記細胞内で前記膜小胞中の薬剤が放出されることを見出した。そして、さらに、前記膜小胞に、目的とするターゲット細胞の膜タンパク質に結合可能な結合ペプチドを提示させることによって、前記膜小胞を効率よく前記ターゲット細胞に結合できることを見出し、本発明を完成させるに至った。
　本発明の発現ベクターによれば、前記結合ペプチドを提示する前記膜小胞を産生する細胞を得ることができる。そして、前記結合ペプチドを提示する前記膜小胞を、薬剤のキャリアとして使用すれば、前記結合ペプチドが前記ターゲット細胞の膜タンパク質に結合するため、前記ターゲット細胞に効率よく前記薬剤を投与でき、安全性にも優れる。また、前記膜小胞は、前記薬剤を内包するため、例えば、前記ターゲット細胞に結合し、前記細胞の内部に放出されるまで、前記薬剤の分解を防止できる。このため、本発明は、例えば、核酸薬剤等の薬剤を医薬品として実用化するにあたって、極めて有用な技術といえる。
図１は、本発明の参考例１において、所定時間における細胞株中のｍｉＲＮＡ量と培地中のｍｉＲＮＡ量との関係を示すグラフである。 図２は、本発明の参考例２において、ローダミンのシグナルの観察結果を示す写真である。 図３は、本発明の参考例３において、ＰＫＨ６７陽性エクソソームをトランスファーさせたＨｅＬａ細胞の、蛍光顕微鏡観察結果を示す写真である。 図４は、本発明の実施例１において、エクソソームを含むコンディショニングメディウムの存在下で培養したＨＣＣの外観を示す電子顕微鏡写真である。 図５は、本発明の実施例１において、エクソソームを含むコンディショニングメディウムの存在下で培養したＨＣＣのルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 図６は、本発明の実施例２において、エクソソームを含むコンディショニングメディウムの存在下で培養したＨＣＣのルシフェラーゼ活性を示すグラフである。 図７は、本発明の実施例３において、フローサイトメトリーによる解析結果を示すグラフである。 図８（Ａ）は、本発明の実施例４において、マウスのｉｎ　ｖｉｖｏイメージング結果を示す写真であり、図８（Ｂ）は、前記マウスの腫瘍部における蛍光強度を示すグラフである。 図９は、本発明の実施例５において、エクソソームに含まれるｌｅｔ－７ａ　ｍｉＲＮＡの発現量の相対値を示すグラフである。 図１０（Ａ）は、本発明の実施例５において、マウスのｉｎ　ｖｉｖｏイメージング結果を示す写真であり、図１０（Ｂ）は、前記マウスの腫瘍部における蛍光強度を示すグラフである。
＜発現ベクター＞
　本発明の発現ベクターは、ターゲット細胞の膜タンパク質に結合可能な結合ペプチドをコードする核酸配列を有することを特徴とする。
　本発明の発現ベクターは、前述のように、前記キャリア産生細胞の製造方法に使用できる。このため、本発明の発現ベクターは、これを導入する前記膜小胞の産生細胞において、前記核酸配列が発現可能であればよい。
　本発明において、前記ターゲット細胞は、前記膜小胞の産生細胞から産生される前記膜小胞を導入する、目的の細胞を意味し、例えば、前記薬剤のデリバリーが望まれる細胞があげられる。前記ターゲット細胞は、特に制限されず、例えば、がん細胞、腫瘍細胞、肝細胞、神経細胞、膵臓ラングハンス細胞、筋細胞、骨組織、軟骨組織、幹細胞等があげられる。前記幹細胞は、例えば、後述するような、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、胚性幹細胞等があげられる。前記がん細胞は、特に制限されず、例えば、乳がん細胞、肺がん細胞、白血球等の血中がん細胞、大腸がん細胞、直腸がん細胞、胃がん細胞、前立腺がん細胞等があげられる。
　前記ターゲット細胞の膜タンパク質は、特に制限されず、前記ターゲット細胞の種類に応じて適宜設定できる。前記ターゲット細胞ががん細胞の場合、前記膜タンパク質は、例えば、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ｃ－ｋｉｔ、Ｂｃｒ－Ａｂｌ、ＣＤ２０、Ｇタンパク質共役受容体等があげられる。
　前記膜タンパク質に結合可能な結合ペプチドは、特に制限されず、前記膜タンパク質の種類に応じて適宜設定できる。前記膜タンパク質がＥＧＦＲの場合、前記結合ペプチドは、例えば、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）またはその部分ペプチド、ＧＥ１１ペプチドがあげられる。前記結合ペプチドのコード配列は、例えば、前記ペプチドのアミノ酸配列から決定してもよいし、データベース等の塩基配列情報に基づいてもよい。
　本発明の発現ベクターは、例えば、さらに、膜貫通ペプチドをコードする核酸配列およびシグナルペプチドをコードする核酸配列の少なくとも一方を有してもよく、好ましくは、前記膜貫通ペプチドをコードする核酸配列および前記シグナルペプチドをコードする核酸配列を有する。
　前記シグナルペプチドは、特に制限されず、例えば、Ｉｇ　κ鎖リーダー配列等があげられ、具体的には、マウスＩｇ　κ鎖　Ｖ－Ｊ２－Ｃシグナルペプチド等があげられる。前記シグナルペプチドのコード配列は、例えば、公知の配列が採用でき、また、前記ペプチドのアミノ酸配列から決定してもよいし、データベース等の塩基配列情報に基づいてもよい。
　前記膜貫通ペプチドは、特に制限されず、例えば、ＰＤＧＦＲ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の膜貫通ドメイン等があげられる。前記膜貫通ペプチドのコード配列は、例えば、公知の配列が採用でき、また、前記ペプチドのアミノ酸配列から決定してもよいし、データベース等の塩基配列情報に基づいてもよい。
　本発明の発現ベクターは、例えば、前記各種核酸配列を、キメラ核酸配列として有してもよい。前記キメラ核酸配列は、例えば、前記結合ペプチドと前記膜貫通ペプチドとを含むキメラペプチドをコードするキメラ核酸配列、前記結合ペプチドと前記シグナルペプチドとを含むキメラペプチドをコードするキメラ核酸配列、前記結合ペプチドと前記膜貫通ペプチドと前記シグナルペプチドとを含むキメラペプチドをコードするキメラ核酸配列等があげられる。
　前記発現ベクターにおいて、例えば、前記各種核酸配列の配置順序は、特に制限されない。前記発現ベクターにおいて、例えば、５’側から、前記シグナルペプチドのコード配列、前記結合ペプチドのコード配列および前記膜貫通ペプチドのコード配列を有することが好ましい。これらの各種核酸配列は、例えば、前述のようにキメラ核酸配列であることが好ましい。このようなキメラ核酸配列に基づけば、例えば、前記結合ペプチドのＮ末端側に、前記シグナルペプチドを有し、前記結合ペプチドのＣ末端側に、前記膜貫通ペプチドが付加されたキメラペプチドを発現できる。前記キメラ核酸配列は、例えば、前記結合ペプチドのコード配列、前記膜貫通ペプチドのコード配列および前記シグナルペプチドのコード配列が、それぞれ、直接連結してもよいし、リンカー等を介して連結してもよい。
　本発明の発現ベクターは、例えば、さらに、他の核酸配列を有してもよい。前記他の核酸配列は、例えば、ペプチドタグのコード配列等があげられる。前記ペプチドタグは、特に制限されず、例えば、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＱタグ、ＨＮタグ、ＨＡＴタグ等があげられる。前記ペプチドタグのコード配列は、例えば、公知の配列が採用でき、また、前記ペプチドのアミノ酸配列から決定してもよいし、データベース等の塩基配列情報に基づいてもよい。本発明の発現ベクターが、前記キメラ核酸配列を有する場合、前記キメラ核酸配列が、例えば、さらに、前記他の核酸配列を有してもよい。前記他の核酸配列は、例えば、前記結合ペプチド、前記シグナルペプチドおよび前記結合ペプチドを含むキメラペプチドが発現可能なように、前記キメラ核酸配列内に挿入されることが好ましい。前記キメラ核酸配列は、例えば、前記膜貫通ペプチドのコード配列と前記結合ペプチドのコード配列との間に、ペプチドタグのコード配列を有してもよい。また、前記キメラ核酸配列は、例えば、前記結合ペプチドのコード配列と前記シグナルペプチドのコード配列との間に、ペプチドタグのコード配列を有してもよい。
　本発明の発現ベクターは、前述のように、例えば、ベクターに、前記各種核酸配列が発現可能なように挿入されていればよい。前記ベクターの種類は、例えば、後述する前記膜小胞の産生細胞の種類に応じて、適宜設定できる。前記ベクターは、例えば、非ウイルスベクターおよびウイルスベクターがあげられる。前記非ウイルスベクターは、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター等があげられる。前記ウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスベクター、ＤＮＡウイルスベクター、ＲＮＡウイルスベクター等があげられる。前記レトロウイルスベクターは、例えば、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のレンチウイルスベクター等があげられる。前記ＤＮＡウイルスベクターは、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶベクター；adeno　associated　virus）、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ボックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シンビスウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ＳＶ４０等があげられる。前記ＲＮＡウイルスベクターは、例えば、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のレンチウイルスベクター等があげられる。
　前記発現ベクターは、例えば、さらに、前記各種核酸配列の発現を調節する調節配列を含んでもよい。前記調節配列は、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、シミアンウイルス－４０（ＳＶ－４０）、筋βアクチンプロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等の構成プロモーター、チミジンキナーゼプロモーター等の組織特異的プロモーター、成長ホルモン調節性プロモーター、ｌａｃオペロン配列の制御下にあるプロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等の誘導性プロモーター、調節性プロモーターがあげられる。前記調節配列は、公知の方法に基づいて、前記各種核酸配列の発現を機能的に調節できる部位に配置すればよい。この他に、例えば、エンハンサー配列、ポリアデニル化シグナル、複製起点配列（ｏｒｉ）等を含んでもよい。
　前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
＜キャリア産生細胞およびその製造方法＞
　本発明のキャリア産生細胞は、薬剤をデリバリーするためのキャリアを産生するキャリア産生細胞であって、前記本発明の発現ベクターを有する、膜小胞の産生細胞であることを特徴とする。
　前記膜小胞は、細胞が分泌する膜状物質であって、その大きさは、例えば、直径５～２００ｎｍ、好ましくは１０～１００ｎｍである。前記膜小胞は、例えば、エクソソームである。前記エクソソームは、例えば、細胞内膜の小胞の中でも、細胞外に分泌されるナノオーダーの小胞である。前記エクソソームは、例えば、テキソソーム、デキソソーム、エンドソーム等がある。前記テキソソームは、例えば、前記腫瘍細胞から誘導される小胞であり、前記デキソソームは、例えば、樹状細胞から誘導される小胞である。
　前記膜小胞の産生細胞は、特に制限されず、例えば、赤血球、樹状細胞、白血球、脂肪細胞、上皮細胞、腫瘍細胞、巨核球細胞、血小板、胎盤由来細胞、羊膜細胞、絨毛膜細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、人工多能性幹細胞(Ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞)、胚性幹細胞、臍帯血由来細胞、臍帯静脈内皮細胞、臍帯動脈内皮細胞があげられる。また、前記細胞は、例えば、生体から採取した細胞でもよいし、培養細胞でもよく、後者は、例えば、腫瘍細胞を含む全ての株化された培養細胞等があげられる。また、前記細胞は、例えば、前述した細胞の誘導細胞、未分化細胞および分化細胞も含む。前記白血球は、例えば、リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞等）、好中球、好塩球、好酸球、単球があげられる。また、前記膜小胞および前記細胞は、例えば、動物種を問わない。
　本発明において、前記膜小胞の産生細胞は、さらに、薬剤が導入された細胞でもよい。このようなキャリア産生細胞によれば、例えば、前記薬剤を内包した膜小胞を有する細胞、前記薬剤を内包した膜小胞を放出可能な細胞、また、前記薬剤を内包した膜小胞を得ることができる。
　前記薬剤は、例えば、疾患に対する効能、疾患の原因となる生体内反応に対する効能等を有することが好ましい。前記薬剤は、例えば、目的に応じて選択でき、特に制限されない。前記薬剤の具体例は、例えば、抗がん作用、抗アレルギー作用等の効能を有する医薬があげられる。
　前記薬剤は、例えば、核酸、低分子化合物等があげられる。前記核酸薬剤の種類は、特に制限されず、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸等の核酸があげられる。前記ＲＮＡは、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等のノンコーディングＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ等があげられる。前記薬剤は、例えば、天然由来でもよいし、有機合成法または遺伝子工学的手法により製造したものでもよい。
　前記膜小胞の産生細胞は、例えば、前記核酸薬剤を発現する発現試薬が導入されてもよい。前記発現試薬は、例えば、後述の通りである。
　本発明のキャリア産生細胞は、例えば、本発明のキャリア産生細胞の製造方法により製造できる。本発明のキャリア産生細胞の製造方法は、前述のように、薬剤をデリバリーするためのキャリアを産生するキャリア産生細胞の製造方法であって、前記本発明の発現ベクターを、膜小胞の産生細胞に導入する工程を含むことを特徴とする。
　前記導入工程において、前記膜小胞の産生細胞への前記発現ベクターの導入方法は、特に制限されない。前記導入方法は、例えば、前記膜小胞の産生細胞の種類等に応じて、適宜決定できる。前記導入方法は、例えば、リン酸カルシウム法、ポリエチレングリコール法、リポソームを用いるリポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、遺伝子銃による導入法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、微小ガラス管等を用いた直接注入法、ハイドロダイナミック法、カチオニックリポソーム法、導入補助剤を用いる方法等があげられる。前記リポソームは、例えば、リポフェクタミンおよびカチオニックリポソーム等があげられ、前記導入補助剤は、例えば、アテロコラーゲン、ナノ粒子およびポリマー等があげられる。前記産生細胞への導入は、例えば、ｉｎ　ｖｉｖｏでもｉｎ　ｖｉｔｒｏでもよい。
　本発明の製造方法は、さらに、薬剤を、前記膜小胞の産生細胞に導入する工程を含んでもよい。前記薬剤の導入によって、例えば、前記薬剤を内包した膜小胞を有するキャリア産生細胞、前記薬剤を内包した膜小胞を放出可能なキャリア産生細胞、また、前記キャリア産生細胞から放出された、前記薬剤を内包する膜小胞等を得ることができる。
　前記薬剤は、例えば、前述の通りである。前記薬剤は、例えば、前記膜小胞の産生細胞に、直接的に導入してもよいし、間接的に導入してもよい。すなわち、本発明のキャリアの製造方法において、前記薬剤を導入する工程は、例えば、前記核酸薬剤を導入する工程でもよいし、前記核酸薬剤を発現する発現試薬を導入する工程でもよい。前記直接的な導入は、例えば、前記膜小胞の産生細胞に、前記核酸薬剤そのものを導入する方法があげられる。前記間接的な導入は、例えば、前記膜小胞の産生細胞に、前記核酸薬剤を発現する発現試薬を導入する方法があげられる。
　前記核酸薬剤を導入する場合、その導入方法は、特に制限されず、例えば、前記膜小胞の産生細胞の種類、前記核酸薬剤の種類等に応じて、適宜決定できる。前記導入方法は、例えば、前述した前記発現ベクターと同様の方法があげられる。
　前記発現試薬は、前記核酸薬剤を発現すればよく、その種類は、特に制限されない。前記発現試薬は、例えば、前記核酸薬剤の前駆体を含む発現試薬、前記核酸薬剤を発現する発現ベクターを含む発現試薬等があげられる。
　前者の発現試薬において、前記核酸薬剤の前駆体は、例えば、ｓｉＲＮＡを遊離するｓｉＲＮＡ前駆体、ｍｉＲＮＡを遊離するｍｉＲＮＡ前駆体等があげられる。この場合、前記膜小胞の産生細胞に、前記前駆体を含む発現試薬を導入する方法は、特に制限されず、例えば、前記核酸薬剤の導入方法と同様である。
　後者の発現試薬において、前記発現ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、細胞内で目的の前記核酸薬剤を発現できればよい。前記発現ベクターは、例えば、ベクターに、前記核酸薬剤を発現するための核酸配列が、発現可能なように挿入されていればよい。前記ベクターの種類は、例えば、前記膜小胞の産生細胞の種類、前記核酸薬剤の種類等に応じて適宜決定できる。前記ベクターは、例えば、前述のような前記非ウイルスベクターおよび前記ウイルスベクターが使用でき、具体例は、前述の通りである。
　前記核酸薬剤がｍｉＲＮＡの場合、前記発現ベクターは、例えば、ｐｒｉｍａｒｙ－ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）を発現する核酸配列を有することが好ましい。これによって、前記膜小胞産生細胞内で、目的の核酸薬剤に対応するｐｒｉ－ｍｉＲＮＡが生成され、これからＤｒｏｓｈａによりステムループ構造を持つｐｒｅｃｕｒｓｏｒ－ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）が生成され、さらに、Ｄｉｃｅｒによりループ部分が切断されて、目的のｍａｔｕｒｅ　ｍｉＲＮＡが製造される。このような発現ベクターは、例えば、市販のｍｉＲＮＡ発現用ベクター、ｓｉＲＮＡ発現用ベクター等が使用できる。前記発現ベクターを前記膜小胞の産生細胞に導入する方法は、特に制限されず、例えば、前記核酸薬剤の導入方法において例示した方法があげられる。
＜キャリアおよびその製造方法＞
　本発明のキャリアは、前述のように、薬剤をデリバリーするためのキャリアであって、膜ペプチドとして、ターゲット細胞の膜タンパク質に結合可能な結合ペプチドを有する膜小胞を含むことを特徴とする。
　前記膜小胞は、前記薬剤を含むことが好ましい。前記薬剤は、例えば、前述の通りである。
　本発明のキャリアは、前述のように、前記膜小胞を含んでいればよい。前記膜小胞は、例えば、前記キャリア産生細胞内に存在する膜小胞でもよい。すなわち、本発明は、前記膜小胞を有する細胞を含んでもよく、前記細胞は、例えば、前記本発明のキャリア産生細胞があげられる。本発明において、前記膜小胞を有する細胞は、例えば、前記膜小胞を内包する細胞の他に、生体に投与した後、前記膜小胞を生成する細胞の意味も含む。前記膜小胞を有する細胞において、前記膜小胞は、前記薬剤を内包することが好ましい。
　前記膜小胞は、例えば、種々の細胞より放出されるエクソソームがあげられ、細胞は、例えば、前述のような、前記膜小胞の産生細胞である。前記エクソソームは、例えば、テキソソーム、デキソソーム、エンドソーム等がある。
　前記膜小胞は、前記膜ペプチドとして、例えば、さらに、前記膜貫通ペプチドおよびシグナルペプチドの少なくとも一方を含んでもよく、好ましくは、前記膜貫通ペプチドおよび前記シグナルペプチドを有する。前記膜ペプチドが、前記膜貫通ペプチドおよび／シグナルペプチドを含む場合、前記膜ペプチドは、前記結合ペプチドと、前記膜貫通ペプチドおよび／前記シグナルペプチドとを含むキメラペプチドが好ましい。前記キメラペプチドにおいて、前記各種ペプチドの配置は、特に制限されず、例えば、前記結合ペプチドのＮ末端側に、前記シグナルペプチドを有し、前記結合ペプチドのＣ末端側に、前記膜貫通ペプチドが付加されたキメラペプチドが例示できる。
　前記膜小胞は、前記膜ペプチドとして、例えば、さらに他のペプチドを有してもよく、前記他のペプチドは、例えば、前述のようなペプチドタグがあげられる。前記膜ペプチドが、前記ペプチドタグを有する場合、前記膜ペプチドは、例えば、前記結合ペプチドと、前記膜貫通ペプチドおよび／または前記シグナルペプチドと、前記ペプチドタグとを含むキメラペプチドが好ましい。前記キメラペプチドにおける各ペプチドの配置は、特に制限されず、例えば、前記発現ベクターの説明において述べた順序が援用できる。前記キメラペプチドにおいて、前記ペプチドタグは、例えば、前記膜貫通ペプチドと前記結合ペプチドとの間でもよいし、前記結合ペプチドと前記シグナルペプチドとの間でもよい。
　本発明のキャリアは、例えば、本発明のキャリアの製造方法により製造できる。本発明のキャリアの製造方法は、前述のように、薬剤をデリバリーするためのキャリアの製造方法であって、前記本発明のキャリア産生細胞を培養する工程を含むことを特徴とする。
　本発明のキャリアの製造方法は、例えば、前記培養工程に先立って、前記キャリア産生細胞を、前述した前記キャリア産生細胞の製造方法により製造する工程を含んでもよい。前記キャリア産生細胞の製造方法は、前述の通りである。
　本発明のキャリアの製造方法において、前記キャリア産生細胞は、例えば、前述したように、前記薬剤が導入された前記キャリア産生細胞が好ましい。また、本発明のキャリアの製造方法は、例えば、前記キャリア産生細胞に前記薬剤が導入されていない場合、さらに、前記薬剤を、前記キャリア産生細胞に導入する工程を含むことが好ましい。このように前記薬剤が導入された前記キャリア産生細胞を培養することによって、例えば、前記細胞から前記薬剤を内包した膜小胞を放出させて、前記薬剤が内包された膜小胞を含む本発明のキャリアを得ることができる。
　前記培養工程において、前記培養条件は、特に制限されず、前記膜小胞の産生細胞の種類等に応じて、適宜設定できる。
　本発明のキャリアの製造方法は、例えば、さらに、前記キャリア産生細胞を培養した後、前記細胞を回収する工程、および／または、前記細胞により生成された前記膜小胞を回収する工程を含んでもよい。前述のように、本発明のキャリアは、前記膜小胞を有する細胞でもよい。このため、前記細胞を回収して、キャリアとして使用できる。また、前述のように、前記薬剤を導入した前記キャリア産生細胞は、前記薬剤を内包する膜小胞を、細胞外に放出する。このため、例えば、前記キャリア産生細胞の培養後、その培養上清を回収することで、前記膜小胞を回収し、キャリアとして使用できる。
　前記膜小胞の回収は、例えば、フィルターろ過、遠心分離等によって行うことができる。前記膜小胞は、例えば、その直径に基づいて分画可能であり、具体例として、前記エクソソームは、例えば、３０～１００ｎｍの直径に基づいて分画可能である。回収方法の具体例は、例えば、培養液を遠心処理（例えば、５００×ｇ、１０分）して上清を回収し、前記上清をろ過後（例えば、０．２２μｍのフィルター使用）、この上清を超遠心処理（例えば、１００，０００×ｇ～１２０，０００×ｇ、７０分）し、沈殿画分として回収する方法等があげられる。また、さらに、ショ糖等の比重担体を用いて密度勾配をつくり、密度勾配遠心を行ってもよい。また、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２００７　Ｊｕｎ；９（６）：ｐ．６５４－６５９およびＥｐｕｂ　２００７　Ｍａｙ　７．、ＰＭＩＤ：　１７４８６１１３等の文献を参照して、回収できる。
　本発明のキャリアは、前述のように、例えば、前記薬剤を目的の細胞に導入するために使用でき、具体例として、例えば、生体内において、前記薬剤を目的の細胞に導入するために使用できる。本発明のキャリアの使用方法は、特に制限されず、例えば、ｉｎ　ｖｉｖｏ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、ｅｘ　ｖｉｖｏのいずれで使用してもよい。前記本発明のキャリアは、前述のように、細胞に取り込まれることから、目的の細胞に接触する状態で使用することが好ましい。前記本発明のキャリアをｉｎ　ｖｉｔｒｏで使用する場合、例えば、前記本発明のキャリアと目的の細胞を接触させればよく、具体的には、例えば、前記本発明のキャリアと目的の細胞とを、培地等の液体中で共存させればよい。これによって、前記本発明のキャリアを前記目的の細胞に取り込ませることができる。また、前記本発明のキャリアをｅｘ　ｖｉｖｏで使用する場合は、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏと同様に処理した前記目的の細胞を、生体内に戻せばよい。前記本発明のキャリアをｉｎ　ｖｉｖｏで使用する場合は、例えば、前記目的の細胞の種類に応じて、投与方法を選択し、前記本発明のキャリアを生体内に投与すればよい。前記投与方法は、例えば、経口投与および非経口投与があげられ、非経口投与は、例えば、静脈、動脈、筋肉内、腹腔内、皮下等への注射、皮下組織投与等があげられる。
　本発明のキャリアを導入する細胞の種類、その由来等は、何ら制限されない。また、前記本発明のキャリアを導入する生体の種類も何ら制限されず、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、ヒト以外の霊長類、げっ歯類、犬、猫等があげられる。
＜医薬＞
　本発明の医薬は、前記薬剤が導入された前記本発明のキャリア産生細胞および前記薬剤が内包された前記発明のキャリアの少なくとも一方を含むことを特徴とする。本発明の医薬の使用方法は、特に示さない限り、前述と同様である。
　本発明の医薬の効能は、例えば、前記薬剤の種類によって、適宜決定できる。前記薬剤として、例えば、抗がん作用を示す薬剤を含む場合、本発明の医薬は、抗がん剤ということができる。本発明の医薬は、これには制限されず、この他にも、前記薬剤の種類によって、抗アレルギー剤等があげられる。本発明の医薬は、例えば、医薬組成物でもよい。
＜治療方法＞
　本発明の治療方法は、生体または生体から採取した試料に、本発明の医薬を投与することを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の医薬を使用することが特徴であり、その他の条件については、何ら制限されない。本発明において、生体から採取した試料に前記医薬を投与した場合、例えば、投与後の試料を患者に戻してもよい。前記本発明の医薬は、前述のように、例えば、前記膜小胞を有する細胞でもよいし、細胞から放出された前記膜小胞のいずれを含んでもよい。前者の場合、前記細胞を投与すればよい。前記本発明の医薬の投与方法は、何ら制限されず、例えば、治療対象の組織に応じて適宜決定でき、前述と同様に、静脈、動脈、筋肉内、腹腔内、皮下等への注射、経口投与、皮下組織投与等があげられる。本発明の治療方法は、例えば、前記核酸薬剤の種類および投与の目的によって、予防方法ともいえる。前記生体から採取した試料は、例えば、組織、細胞等があげられる。
　本発明は、例えば、治療等の医療への利用の他、例えば、医療目的以外で使用することもできる。
　つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例により制限されない。細胞の培養条件は、特に示さない限り、３７℃、５％ＣＯ２とした。
［実施例１］
　膜ペプチドとしてＥＧＦまたはＧＥ１１を提示するエクソソームを調製し、ＥＧＦＲ提示細胞である乳がん細胞株ＨＣＣ７０に対する親和性を確認した。
（１）形態観察
　シグナルペプチド（Ｉｇκ鎖リーダー配列）のコード配列および膜貫通ペプチド（ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン）のコード配列を有するｐＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）Ｖｅｃｔｏｒ（商品名、インビトロゲン社製）を使用した。このｐＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）Ｖｅｃｔｏｒのマルチクローニングサイト（シグナルペプチドのコード配列と膜貫通ペプチドのコード配列との間）に、以下に示すＥＧＦタンパク質のコード配列またはＧＥ１１ペプチドのコード配列を挿入し、ＥＧＦ発現ベクターとＧＥ１１発現ベクターを構築した。コントロールとして、前記コード配列を挿入していないｐＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）Ｖｅｃｔｏｒを使用した。
（ＥＧＦコード配列）
ＢｇｌII－ＥＧＦ　ｍａｔｕｒｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ－ＰｓｔＩ：配列番号６
agatctaatagtgactctgaatgtcccctgtcccacgatgggtactgcctccatgatggtgtgtgcatgtatattgaagcattggacaagtatgcatgcaactgtgttgttggctacatcggggagcgatgtcagtaccgagacctgaagtggtgggaactgcgcctgcag
（ＧＥ１１コード配列）
ＢｇｌII－ＧＥ１１　ｐｅｐｔｉｄｅ－ＳａｌＩ：配列番号７
agatctggcggtgggggcagcgggggaggcggcagcggcggcggcggcagctaccactggtacggctacaccccccagaacgtgatcggcggtgggggcagcgggggaggcggcagcggcggcggcggcagcgtcgac
　前記各発現ベクターを、トランスフェクション試薬（商品名ＦｕＧｅｎｅ、ロシュ社製）を用いて、繊維芽細胞株ＨＥＫ２９３にトランスフェクションした。前記トランスフェクションの条件は、Ｄ－ＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）培地を用いて、３７℃、２４時間培養とした。
　そして、トランスフェクション後の細胞を３回洗浄し、さらに、３７℃で２４時間培養した。その培養液を、遠心分離（２０００×ｇ、１５分）して死細胞を除去し、上清を回収した。前記上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、得られたろ液をコンディショニングメディウムとした。前記ＥＧＦ発現ベクターを使用したコンディショニングメディウムＥＧＦは、表面に膜たんぱく質としてＥＧＦが提示されたエクソソーム（ＥＧＦ－エクソソーム）を含み、前記ＧＥ１１発現ベクターを使用したコンディショニングメディウムＧＥ１１は、表面にＧＥ１１が提示されたエクソソーム（ＧＥ１１－エクソソーム）を含み、前記コントロール発現ベクターを使用したコンディショニングメディウムｃｏｎｔは、表面にＥＧＦおよびＧＥ１１のいずれも提示されていないエクソソーム（ｃｏｎｔ－エクソソーム）を含んでいた。
　６ウェルプレートに、乳がん細胞株（ＨＣＣ７０）をウェルあたり４×１０５個となるように播種し、前記コンディショニングメディウム（ウェルあたり２ｍＬ）を用いて、３７℃で２４時間培養した。そして、培養後のＨＣＣ７０の形態を、電子顕微鏡により確認した。この結果を、図４に示す。
　図４において、（Ａ）は、前記コンディショニングメディウムｃｏｎｔ、（Ｂ）は、前記コンディショニングメディウムＥＧＦ、（Ｃ）は、前記コンディショニングメディウムＧＥ１１の存在下で培養したＨＣＣ７０の結果を示す。図４の各図において、伸展した細胞について、一部を実線で囲んで示した。図４に示すように、前記コンディショニングメディウムＥＧＦおよび前記コンディショニングメディウムＧＥ１１を使用したＨＣＣは、前記コンディショニングメディウムｃｏｎｔを使用したＨＣＣ７０よりも、明らかな伸展の亢進が確認された。これは、前記コンディショニングメディウムに含まれる前記エクソソームの表面に提示されたＥＧＦおよびＧＥ１１が、ＨＣＣ７０の表面上のＥＧＦＲに結合したことによると推測される。この結果から、エクソソームの表面にＥＧＦおよびＧＥ１１を提示させることによって、ＥＧＦＲ提示細胞に対するエクソソームの親和性を向上できることがわかった。なお、前記コンディショニングメディウムの添加量を１／２とした場合も、同様の結果が得られることは確認済みである。
（２）ルシフェラーゼ活性測定
　ＨＣＣ７０として、ルシフェラーゼ遺伝子発現ベクターを導入した組換え細胞を使用した。そして、培養日数を３日間とした以外は、前記（１）と同様にして、前記コンディショニングメディウム存在下で培養を行った。培養後のＨＣＣ７０について、ルシフェラーゼ活性を測定した。この結果を、図５に示す。
　図５は、前記コンディショニングメディウムｃｏｎｔおよび前記コンディショニングメディウムＥＧＦの存在下で培養したＨＣＣ７０のルシフェラーゼ活性の結果を示す。図５に示すように、前記コンディショニングメディウムＥＧＦを使用したＨＣＣ７０は、前記コンディショニングメディウムｃｏｎｔを使用したＨＣＣ７０よりも、約２倍の活性を示し、増殖の亢進が確認された。これは、前記コンディショニングメディウムに含まれる前記エクソソームの表面に提示されたＥＧＦおよびＧＥ１１が、ＨＣＣ７０の表面上のＥＧＦＲに結合したことによると推測される。この結果から、エクソソームの表面にＥＧＦおよびＧＥ１１を提示させることによって、ＥＧＦＲ提示細胞に対するエクソソームの親和性を向上できることがわかった。
［実施例２］
　膜ペプチドとしてＥＧＦを提示し、ｍｉＲＮＡを内包するエクソソームを調製し、ＥＧＦＲ提示細胞である乳がん細胞株ＨＣＣ７０の増殖抑制を確認した。
　前記実施例１と同様にして、前記ＥＧＦ発現ベクターを、繊維芽細胞株ＨＥＫ２９３にトランスフェクションした。トランスフェクション後のＨＥＫ２９３（ＥＧＦ）に、下記配列のがん抑制因子ｌｅｔ－７ａ　ｍｉＲＮＡまたはノンターゲットのｍｉＲＮＡを、トランスフェクションした。前記トランスフェクションの条件は、前記ＥＧＦ発現ベクターのトランスフェクションと同様とした。
（ｌｅｔ－7ａ　ｍｉＲＮＡ）
　　センス鎖（配列番号８）
　　5’-ugagguaguagguuguauaguu-3’
　　アンチセンス鎖（配列番号９）
　　5’-cuauacaaucuacugucuuuc-3’
（ｎｏｎ　ｔａｒｇｅｔ　ｍｉＲＮＡ）
　　センス鎖（配列番号１０）
　　5’-auccgcgcgauaguacguauu-3’
　　アンチセンス鎖（配列番号１１）
　　5’-uacguacuaucgcgcggauuu-3’
　そして、トランスフェクションしてから２４時間後の細胞をＰＢＳで３回洗浄し、さらに、３７℃で２４時間培養した。その培養液を、遠心分離（２０００×ｇ、１５分）して死細胞を除去し、上清を回収した。前記上清を０．２２μｍのフィルターでろ過し、得られたろ液を、コンディショニングメディウムとした。前記ｌｅｔ－７ａ　ｍｉＲＮＡを導入して得られたコンディショニングメディウム（ｌｅｔ－７ａ　ｍｉＲＮＡ）は、表面に膜たんぱく質としてＥＧＦが提示され且つ前記ｌｅｔ－７ａ　ｍｉＲＮＡを内包したエクソソームを含んでいた。前記ｎｏｎ　ｔａｒｇｅｔ　ｍｉＲＮＡを導入して得られたコンディショニングメディウム（ｎｏｎ　ｔａｒｇｅｔ　ｍｉＲＮＡ）は、表面に膜たんぱく質としてＥＧＦが提示され且つ前記ｎｏｎ　ｔａｒｇｅｔ　ｍｉＲＮＡを内包したエクソソームを含んでいた。
　また、コントロールとして、ＨＥＫ２９３に、前記ＥＧＦのコード配列を挿入していないｐＤｉｓｐｌａｙ（登録商標）Ｖｅｃｔｏｒをトランスフェクションし、ｍｉＲＮＡをトランスフェクションしていない以外は、同様にして、コンディショニングメディウム（Ｎｏｎｅ）を調製した。
　つぎに、前記各コンディショニングメディウムを使用した以外は、前記実施例１と同様にして、前記コンディショニングメディウム存在下で、ＨＣＣ７０の培養を行った。そして、前記実施例１（２）と同様にして、ルシフェラーゼ活性を測定した。この結果を、図６に示す。
　図６は、前記コンディショニングメディウム（Ｎｏｎｅ）、前記コンディショニングメディウム（Ｎｏｎ　ｔａｒｇｅｔ　ｍｉＲＮＡ）および前記コンディショニングメディウム（ｌｅｔ－７ａ　ｍｉＲＮＡ）の存在下で培養したＨＣＣ７０のルシフェラーゼ活性の結果を示す。図６に示すように、前記コンディショニングメディウム（Ｎｏｎｅ）で処理したＨＣＣ７０と比較して、前記コンディショニングメディウム（Ｎｏｎｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｍｉＲＮＡ）で処理したＨＣＣ７０は、同等のルシフェラーゼ活性を示したのに対し、前記コンディショニングメディウム（ｌｅｔ－７ａ　ｍｉＲＮＡ）で処理したＨＣＣ７０は、有意にルシフェラーゼ活性が抑制された。ルシフェラーゼ活性の抑制は、がん細胞ＨＣＣ７０の増殖の抑制を意味する。この結果から、エクソソームにＥＧＦを提示させることによって、ＥＧＦＲを提示するＨＣＣ７０への親和性が向上し、ＨＣＣ７０への結合によって、前記ＨＣＣ７０内にがん抑制因子ｌｅｔ－７ａ　ｍｉＲＮＡが放出されたことがわかる。
［実施例３］
　膜ペプチドとしてＥＧＦまたはＧＥ１１を提示するエクソソームを調製し、ＥＧＦＲ提示細胞である肺がん細胞株における前記エクソソームの取り込みを確認した。
　繊維芽細胞株ＨＥＫ２９３の脂質二重層を、常法に準じて、蛍光色素（商品名ＰＫＨ６７、シグマアルドリッチジャパン社製）で染色した後、前記実施例１と同様にして、ＥＧＦが提示されたエクソソーム（ＥＧＦ－エクソソーム）、ＧＥ１１が提示されたエクソソーム（ＧＥ１１－エクソソーム）およびＥＧＦおよびＧＥ１１のいずれも提示されていないエクソソーム（ｃｏｎｔ－エクソソーム）を調製した。これらのエクソソームは、前記蛍光色素で標識化された。
　そして、エクソソームとして、前記蛍光色素で標識化されたエクソソームを使用し、乳がん細胞株に代えて肺がん細胞株Ａ５４９、ＨＣＣ３２５５およびＨＣＣ８２７を使用した以外は、前記実施例１と同様にして、前記肺がん細胞株の培養を行った。そして、４時間培養した後、細胞を回収し、フローサイトメーターを用いて、蛍光強度を解析した。また、コントロールとして、エクソソーム未添加の前記肺がん細胞株についても同様に解析を行った（Ｎｏｒｍａｌ）。Ａ５４９用の培地は、１０％ＦＢＳを含有するＥ－ＭＥＭを使用し、Ｈ３２５５およびＨＣＣ８２７用の培地は、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０を使用した。
　これらの結果を、図７に示す。図７は、フローサイトメトリーによる解析結果を示すグラフである。図７において、上の段から、エクソソーム未添加のノーマル肺がん細胞（Ｎｏｒｍａｌ）、標識化ｃｏｎｔ－エクソソームを使用した肺がん細胞（ＰＫＨ６７－ｌａｂｅｌｅｄ　Ｅｘｏｓｏｍｅ）、標識化ＥＧＦ－エクソソームを使用した肺がん細胞（ＰＫＨ６７－ｌａｂｅｌｅｄ　ＥＧＦ－Ｅｘｏｓｏｍｅ）、標識化ＧＥ１１－エクソソームを使用した肺がん細胞（ＰＫＨ６７－ｌａｂｅｌｅｄ　ＧＥ１１－Ｅｘｏｓｏｍｅ）の結果であり、左のレーンから、Ａ５４９、Ｈ３２５５、ＨＣＣ８２７の結果である。図７において、グラフ中の数値は、蛍光強度の平均値を示す。
　同図に示すように、ＥＧＦまたはＧＥ１１が提示されたエクソソームは、ＥＧＦまたはＧＥ１１が提示されていないエクソソームと比較して、ＰＫＨ陽性の細胞が示す割合が格段に高いことから、高効率に肺がん細胞にエクソソームを導入できることが確認された。
［実施例４］
　膜ペプチドとしてＧＥ１１を提示するエクソソームについて、ｉｎ　ｖｉｖｏでの乳がん細胞への集積能を解析した。
　前記実施例１と同様にして、ＧＥ１１が提示されたエクソソーム（ＧＥ１１－エクソソーム）およびＥＧＦおよびＧＥ１１のいずれも提示されていないエクソソーム（ｃｏｎｔ－エクソソーム）を調製し、親油性の近赤外線蛍光色素（商品名ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ　ＤｉＲ、Ｃａｌｉｐｅｒ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で標識化した。
　乳がん細胞株ＨＣＣ７０をＲＡＧ２ノックアウトマウスに移植し、乳がんモデルマウスを作成した。前記モデルマウスに、その尾静脈より、前記標識化エクソソーム４μｇを投与した。そして、投与から２４時間後、腫瘍および各臓器のエクソソームの体内集積を、ＩＶＩＳ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍを用いてｉｎ　ｖｉｖｏイメージングにより解析した。
　これらの結果を図８に示す。図８（Ａ）は、マウスのｉｎ　ｖｉｖｏイメージンング結果を示す写真であり、左は、標識化ｃｏｎｔ－エクソソームを投与したマウス（Ｎｏｒｍａｌ　Ｅｘｏｓｏｍｅ）であり、右は、標識化ＧＥ１１－エクソソームを投与したマウス（ＧＥ１１）の結果である。図８（Ｂ）は、前記マウスの腫瘍部（乳腺）における、蛍光強度を示すグラフである。図８（Ａ）に示すように、標識化ＧＥ１１－エクソソームを投与したマウスは、点線で囲っている領域が、極めて強い蛍光強度を示した。また、図８（Ｂ）に示すように、標識化ＧＥ１１－エクソソームを投与したマウスの腫瘍部は、標識化ｃｏｎｔ－エクソソームを投与したマウスの腫瘍部と比較して、蛍光強度が有意に高い値を示した（ｎ＝５、ｐ＜０．０５）。これらの結果から、前記標識化ＧＥ１１－エクソソームが、腫瘍部において高効率で集積したことがわかった。
［実施例５］
　膜ペプチドとしてＧＥ１１を提示し、ｍｉＲＮＡを内包するエクソソームを調製し、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける乳がんの増殖抑制を確認した。
（１）エクソソームの調製 
　前記ＥＧＦ発現ベクターに代えて、前記実施例１の前記ＧＥ１１発現ベクターを使用し、トランスフェクション後の洗浄ＨＥＫ２９３細胞を４８時間培養した以外は、実施例２と同様にして、エクソソームを含む上清を回収した。前記上清から、後述する参考例３と同様の方法により、エクソソーム（ＧＥ／ｌｅｔ－７ａ）を精製した。
　同様に、前記ＧＥ１１発現ベクター未添加且つｌｅｔ－７ａ　ｍｉＲＮＡ添加のＨＥＫ２９３細胞からエクソソーム（Ｅｍｐｔｙ／ｌｅｔ－７ａ）を回収した。また、ｌｅｔ－７ａ　ｍｉＲＮＡに代えて、前記実施例２のｎｏｎ　ｔａｒｇｅｔ　ｍｉＲＮＡを使用し、前記ＧＥ１１発現ベクター添加のＨＥＫ２９３細胞からエクソソーム（ＧＥ１１／Ｃｏｎｔｒｏｌ）を回収し、前記ＧＥ１１発現ベクター未添加のＨＥＫ２９３細胞からエクソソーム（Ｅｍｐｔｙ／Ｃｏｎｔｒｏｌ）を回収した。また、前記ＧＥ１１発現ベクター未添加且つｍｉＲＮＡ未添加のＨＥＫ２９３細胞からエクソソーム（Ｎｏｒｍａｌ　Ｅｘｏｓｏｍｅ）を回収した。
　これらのエクソソームに含まれるｌｅｔ－７ａ　ｍｉＲＮＡの発現量を、常法にしたがって、ｍｉｃｒｏＲＮＡ　ａｓｓａｙ法により解析した。解析結果を、ｍｉＲ－１６発現量で補正し、内在性ｌｅｔ－７ａの発現量を１として、相対値を求めた。これらの結果を図９に示す。
　図９は、エクソソームに含まれるｌｅｔ－７ａ　ｍｉＲＮＡの発現量の相対値を示すグラフである。図９に示すように、ＧＥ１１発現ベクターおよびｌｅｔ－７ａ　ｍｉＲＮＡを添加した細胞から回収したエクソソームにおいて、ｌｅｔ－７ａ　ｍｉＲＮＡは、高い発現量を示した。
（２）ｉｎ　ｖｉｖｏでの腫瘍抑制効果
　ルシフェラーゼ発現ベクターを乳がん細胞株ＨＣＣ７０にトランスフェクションし、ルシフェラーゼ遺伝子を恒常的に発現する乳がん細胞株ＨＣＣ７０を作成した。この細胞をＲＡＧ２ノックアウトマウスに移植し、乳がんモデルマウスを作成した。腫瘍の生着は、触診およびＩＶＩＳ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍを用いて確認した。
　前記（１）で調製したｌｅｔ－７ａを含有するエクソソーム（ＧＥ１１／ｌｅｔ－７ａ）を、近赤外線蛍光色素（商品名ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ　ＤｉＲ、Ｃａｌｉｐｅｒ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で標識した。前記標識化エクソソームを、１μｇ／週の条件で４週間、前記モデルマウスに尾静脈より投与した。４週間の投与後、前記モデルマウスに、同様にしてルシフェリンを尾静脈より投与し、腫瘍の発達をＩＶＩＳ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍを用いて解析した。
　これらの結果を、図１０に示す。図１０（Ａ）は、マウスのｉｎ　ｖｉｖｏイメージンング結果を示す写真であり、左から、標識化エクソソーム（Ｎｏｒｍａｌ　Ｅｘｏｓｏｍｅ）、標識化エクソソーム（Ｅｍｐｔｙ／Ｃｏｎｔｒｏｌ）、標識化エクソソーム（ＧＥ１１／Ｃｏｎｔｒｏｌ）、標識化エクソソーム（Ｅｍｐｔｙ／ｌｅｔ－７ａ）、標識化エクソソーム（ＧＥ／ｌｅｔ－７ａ）を、それぞれ投与したマウスの結果である。図１０（Ａ）において、矢先で示す実線で囲んだ領域が、ルシフェリンの蛍光を示した領域である。図１０（Ｂ）は、前記マウスの腫瘍部（乳腺）における、蛍光強度を示すグラフである。図１０（Ａ）に示すように、標識化エクソソーム（ＧＥ１１／ｌｅｔ７ａ）を投与したマウスは、他のマウスと比較して、ルシフェリンの蛍光が極めて少なかった。また、図１０（Ｂ）に示すように、標識化エクソソーム（ＧＥ１１／ｌｅｔ７ａ）を投与したマウスの腫瘍部は、他のマウスの腫瘍部と比較して、蛍光強度が有意に高い値を示した（ｎ＝５、ｐ＜０．０５）。これらの結果から、前記ＧＥ１１が提示されたエクソソームが、腫瘍部において高効率で集積したことで、ｌｅｔ－７ａが効果的に腫瘍に作用したことがわかった。
［参考例１］
　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ－ｍｉｃｒｏＲＮＡ（Ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ）発現用ベクター（商品名ｐＭＩＷ－ｃＧＦＰ－Ｚｅｏ、株式会社Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ製）のマルチクローニングサイトに、使用説明書に準じて、Ｐｒｅ－ｍｉＲ－１９９ａ－１の鋳型となる二本鎖のオリゴヌクレオチドを挿入した。前記二本鎖は、Ｐｒｅ－ｍｉＲ－１９９ａ－１の部分配列を含む、配列番号１に示すオリゴヌクレオチドと配列番号２に示すオリゴヌクレオチドとの二本鎖とした。そして、得られた組換えベクターを、トランスフェクション試薬（商品名ＦｕＧｅｎｅ、ロシュ製）を用いて、慢性巨核芽球性白血病細胞株ＭＥＧ－０１ｓ（ＩＦＯ５０４７３）にトランスフェクションした。前記トランスフェクションは、１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、３７℃で所定時間（２４時間、４８時間および７２時間）培養することによって行った。
（配列番号１）
　5’-taacccagtgttcagactacctgttcaggaggctctcaatgtgtacagtagtctgcacattggttag-3’
（配列番号２）
　5’-ctagctaaccaatgtgcagactactgtacacattgagagcctcctgaacaggtagtctgaacactgggttaat-3’
　そして、前記トランスフェクション後の培養液を遠心分離して、培養した細胞株と、培地とに分離した。前記遠心分離の条件は、５００×ｇ、１０分間とした。前記細胞株については、ＲＮＡ抽出試薬として、商品名ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン製）を用いて、ＲＮＡを回収した。前記分離した培地については、さらに０．２２μｍのフィルターに供し、ろ液を回収した。そして、前記ろ液から、ＲＮＡ抽出試薬として、ｍｉｒＶａｎａ（登録商標）ＰＡＲＩＳ（登録商標）を用いて、ＲＮＡを回収した。得られた各ＲＮＡ画分について、商品名ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ　Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ製）を用いて、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）により、ｍｉＲ－１９９ａを測定した。また、コントロールとして、前記二本鎖オリゴヌクレオチドを未挿入の前記発現用ベクターをトランスフェクションした以外は、同様にして、前記細胞株を培養し、ｍｉＲ－１９９ａを測定した。これらの結果を、下記表１および表２に示す。表１は、前記細胞株中のｍｉＲＮＡ量の結果であり、表２は、前記培地中のｍｉＲＮＡ量の結果である。また、図１に、所定時間における前記細胞株中のｍｉＲＮＡ量と前記培地中のｍｉＲＮＡ量との関係をグラフに示す。図１において、Ｘ軸が、前記細胞株中のｍｉＲＮＡ量を示し、Ｙ軸が、前記培地中のｍｉＲＮＡ量を示す。また、同図におけるプロットは、左から２４時間、４８時間および７２時間の結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　前記表１および表２に示すように、前記組換えベクター未導入のＭＥＧ－０１ｓ（コントロール）は、本来、ｍｉＲ－１９９ａを有さないが、前記組換えベクターの導入によって、前記細胞株および前記培地において、経時的にｍｉＲ－１９９ａの増加が確認された。また、図１に示すように、前記組換えベクターを導入したＭＥＧ－０１ｓについて、前記細胞株と前記培地との結果を比較したところ、前記細胞株中のｍｉＲ－１９９ａ量に比例して、前記培地中のｍｉＲ－１９９ａ量が増加することがわかった。なお、前記ＲＰＭＩ１６４０培地中にｍｉＲＮＡを添加した場合、ただちに分解されることが明らかとなっている。このため、本参考例において、前記培地からＲＮＡ抽出によりｍｉＲＮＡが検出されているということは、細胞からｍｉＲＮＡがそのまま放出されているのではないことがわかる。すなわち、培養によって、ｍｉＲＮＡを内包する膜小胞が形成されて、細胞から細胞外に放出されているといえる。
［参考例２］
　本参考例では、細胞間におけるｍｉＲＮＡの移動を確認した。
　標識化ｍｉＲＮＡ、ローダミンで標識化したｍｉＲ－９２ａ（配列番号３）を、１００ｎｍｏｌ／Ｌに調整した。前記標識化オリゴヌクレオチドを、トランスフェクション試薬（商品名ＨｉｐｅｒＦｅｃｔ、キアゲン社製）を用いて、Ｋ５６２（ヒト白血病細胞由来株）１×１０６個に導入し、一晩培養した。Ｋ５６２の培養は、１０％　ＦＣＳ－ＲＭＩ１６４０、０．１ｍｇ　ストレプトマイシンおよび１００Ｕ　ペニシリンを含む培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行った。
ｈｓａ－ｍｉＲ－９２ａ（配列番号３）
　　5’-uauugcacuugucccggccugu-3’
　培養後、前記Ｋ５６２をＰＢＳで２回洗浄した。そして、Ｋ５６２を、ウェルあたり５×１０５個となるように、内皮細胞用培地であるＥＢＭ－２培地（Ｃａｔ．ＣＣ－３１５６、ロンザジャパン社製）で濃度調節した。
　他方、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞であるＨＵＶＥＣ（ロンザジャパン社製）を、丸形カバーガラスを入れた２４ウェルプレートに、１×１０４個／ウェルとなるように播種した。培地は、内皮細胞用培地であるＥＢＭ－２培地を使用した。そして、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。前記ウェルから、前記培地を除去し、新たなＥＢＭ－２培地を５００μＬ加えた。
　つぎに、前記ウェルに、０．４５μｍのメッシュを有するフィルム（商品名Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ、製品番号ＳＴ、クラボウ社製）を配置し、濃度調整した前記Ｋ５６２　２００μＬを加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４８時間培養した。培養４８時間後、培養上清と前記フィルムを除去し、ＨＵＶＥＣをＰＢＳで２回洗浄した。つぎに、前記２％パラフォルムアルデヒドを用いて、ＨＵＶＥＣを、室温で１５分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。さらに、核染色のため、１μｇ／ｍＬ　ＤＡＰＩ（同仁化学研究所製）を加え、室温で５分間、遮光して反応させた後、ＰＢＳで３回洗浄した。その後、細胞が付着した前記カバーガラスを剥がし、スライドガラス上に乗せて水溶性封入剤で封入し、プレパラートとした。前記プレパラートを、蛍光顕微鏡により、ローダミンおよびＤＡＰＩのシグナルを観測した。また、コントロールとして、標識化オリゴヌクレオチドを未導入のＫ５６２を使用し、同様に処理し、観測を行った。
　図２の写真に、蛍光顕微鏡による、ローダミンおよびＤＡＰＩのシグナルの観察結果を示す。図２において、上の図が、ローダミンのシグナルを示し、下の図が、ＤＡＰIのシグナルを示す。図２において、ローダミンのシグナル（赤い蛍光）が確認された主要な部分は、白線の丸で囲んだ。図２において、左のレーンが、コントロール、右のレーンが、標識化ｍｉＲ－９２ａを導入したＫ５６２を使用した結果である。図２に示すように、コントロールでは、ローダミンを示す赤い蛍光が確認されなかった。これに対して、標識化ｍｉＲ－９２ａを導入したＫ５６２とＨＵＶＥＣとを培養することによって、ＨＵＶＥＣにおいて、ｍｉＲＮＡの標識であるローダミンが赤い蛍光として多数検出された。この結果から、Ｋ５６２に導入された標識化ｍｉＲＮＡが、ＨＵＶＥＣ内に導入されたことがわかる。なお、図２の下図において、細胞が存在することは確認済みである。
［参考例３］
　本参考例では、細胞内へのエクソソームのトランスファーを確認した。
（１）エクソソームの回収
　ＨｅＬａ細胞の脂質二重層を、蛍光色素（商品名ＰＫＨ６７、シグマアルドリッチジャパン社製）を用いて染色し、１０％　ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地４ｍＬ／ｄｉｓｈを用いて、３７℃で一晩培養した。培養液から上清をピペットで回収し、以下のプロトコールに従って遠心を行い、エクソソームを精製回収した。
（ａ）前記上清を、２，０００×ｇで１５ｍｉｎ遠心分離し、上清を回収
（ｂ）得られた前記上清を、１０，０００×ｇで３５ｍｉｎ遠心分離し、上清を回収
（ｃ）得られた前記上清を、１００，０００×ｇで７０ｍｉｎ遠心分離し、沈殿を回収
（ｄ）得られた前記沈殿を、１０ｍＬ　ＰＢＳに浮遊させ、１００，０００×ｇで７０ｍｉｎ遠心分離し、沈殿を回収
（ｅ）得られた前記沈殿を、エクソソームとして、ＰＢＳに浮遊させる
（２）エクソソームのトランスファー
　ＨｅＬａ細胞１×１０５個を、１０％　ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地１ｍＬを用いて、３７℃で一晩培養し、そこへ、得られた前記エクソソームの浮遊液０．５ｍＬを添加し、さらに、一晩培養した。培養後、前記ＨｅＬa細胞をＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡観察を行った。
　図３の写真に、蛍光顕微鏡による、ＰＫＨ６７のシグナルの観察結果を示す。図３において、矢印で示す箇所で、緑色の蛍光が確認された。この結果から、ＨｅＬａ細胞内に、ＰＫＨ６７で染色されたエクソソーム（ＰＫＨ６７陽性エクソソーム）が導入されたことが確認された。
［参考例４］
　本参考例では、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、ルシフェラーゼ活性を指標として、エクソソームによる細胞内へのルシフェラーゼｓｉＲＮＡのトランスファーを確認および評価した。細胞の培養には、前処理したＦＢＳを１０％含有するＤＭＥＭを使用した。前記前処理ＦＢＳは、未処理のＦＢＳを、１０，０００×ｇで７０分間超遠心し、前記ＦＢＳに含まれているエクソソームを除去して調製した。
（１）ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを内包するエクソソームの回収
　５×１０６個／ｄｉｓｈの２９３Ｔ（ＣＤ６３－ＧＦＰキメラ遺伝子を発現させたヒト胎児腎上皮細胞株、以下同様）に、１００ｎｍｏｌ／Ｌ　ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを、トランスフェクション試薬（商品名ＨｉｐｅｒＦｅｃｔ、キアゲン社製）を用いて導入し、一晩培養した。ルシフェラーゼｓｉＲＮＡは、ルシフェラーゼの発現を阻害する二本鎖ｓｉＲＮＡである。前記ルシフェラーゼｓｉＲＮＡの各鎖の配列を、配列番号４および５に示す。
ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ
　　5’-cuuacgcugaguacuucgayy-3’　（配列番号４）
　　5’-ucgaaguacucagcguaagyy-3’　（配列番号５）
　　　　　　　　　　　　ｙ＝ｔ
　培養後、２９３ＴをＰＢＳで３回洗浄し、前記培地４ｍＬ／ｄｉｓｈで一晩培養した。そして、培養液から上清をピペットで回収し、前記参考例３と同様のプロトコールにより、エクソソーム（ｅｘｏ．１）を精製回収した。前記上清を回収した後の２９３Ｔに、再度、前記培地４ｍＬを加え、さらに一晩培養した。この培養液から、前述と同様にして、上清を回収し、前記プロトコールにより、エクソソーム（ｅｘｏ．２）を精製回収した。
（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのエクソソームによるルシフェラーゼ活性の抑制
　前記回収したエクソソームの存在下で、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したＨｅＬａ細胞（Ｌｕｃ／ＨｅＬａ）を培養し、ルシフェラーゼ活性を確認した。
　すなわち、前記Ｌｕｃ／ＨｅＬａ細胞を、前記培地１ｍＬで、１×１０５個／ウェルとなるように調整し、一晩培養した。そこに、精製した前記エクソソーム（ｅｘｏ．１またはｅｘｏ．２）１２０μＬを添加し、さらに一晩培養した。コントロールとして、前記上清および前記エクソソーム無添加の条件下で、前記Ｌｕｃ／ＨｅＬａを一晩培養した。
　そして、培養後の前記Ｌｕｃ／ＨｅＬａに、ルシフェリン試薬１００μＬを添加し、ｉｎ　ｖｉｖｏイメージングシステム（商品名ＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ、ＸＥＮＯＧＥＮ社製）を用いて、細胞内におけるルシフェラーゼ活性を測定した。前記ルシフェリン試薬は、１５０μｇ／ｍＬとなるようにルシフェリン（商品名Ｄ－ルシフェリンカリウム塩、和光純薬社製、以下同様）をＰＢＳで希釈して調製した。そして、コントロールのルシフェラーゼ活性を１として、各培養細胞について、ルシフェラーゼ活性の相対値を求めた。これらの結果を下記表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　前記表３に示すように、上清またはエクソソームの存在下で培養することによって、前記Ｌｕｃ／ＨｅＬａ内におけるルシフェラーゼ活性が低下した。この結果から、前記Ｌｕｃ／ＨｅＬａ内にエクソソームが導入され、導入された前記エクソソーム内のルシフェラーゼｓｉＲＮＡが放出されて機能したことがわかった。
［参考例５］
　本参考例では、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、ルシフェラーゼ活性を指標として、エクソソームによる細胞内へのルシフェラーゼｓｉＲＮＡのトランスファーを確認した。
（１）ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを内包するエクソソームの回収
　５×１０６個／ｄｉｓｈの２９３Ｔを、１０％　ＦＣＳ、０．１ｍｇ　ストレプトマイシンおよび１００Ｕ　ペニシリンを含有するＤＭＥＭ培地で一晩培養した。培養した２９３Ｔに、５０ｎｍｏｌ／Ｌ　ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを、トランスフェクション試薬（商品名ＨｉｐｅｒＦｅｃｔ、キアゲン社製）を用いて導入した。前記ルシフェラーゼｓｉＲＮＡは、前記参考例４と同じ二本鎖ｓｉＲＮＡを使用した。ＨｉｐｅｒＦｅｃｔを用いて導入し、一晩培養した。
　培養後、上清を除き、２９３ＴをＰＢＳで３回洗浄し、さらに一晩培養した。培養には、６本の７５Ｔフラスコを使用し、それぞれ、０．１ｍｇ　ストレプトマイシンおよび１００Ｕ　ペニシリンを含むＧｌｕｔａｍａｘ入りＤＭＥＭ（商品名、インビトロゲン社製）４ｍＬを使用した。培養液（約２４ｍＬ）を回収し、２０００×ｇ、４℃で１５分遠心分離して、上清を回収した。前記上清を、０．２２μｍのフィルターで濾過し、４℃で保存した。他方、コントロールとして、前記ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを未導入とした以外は、同様にして、２９３Ｔ細胞を培養し、培養上清を回収した。以下、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを導入した前記２９３Ｔの培養上清を、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ／エクソソーム液（Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅ）とし、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ未導入の２９３Ｔ細胞の培養上清を、コントロールエクソソーム液（ｃｏｎｔｒｏｌ-ｅｘｏｓｏｍｅ）とした。
（２）ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのエクソソームによるルシフェラーゼ活性の抑制
　ルシフェラーゼを発現するＨＣＣ７０（ヒト乳がん細胞株）を、９６ウェルプレートに１×１０３個／培地５０μＬ／ウェルとなるように播種し、一晩培養した。前記培地は、１０％　ＦＣＳ、０．１ｍｇ　ストレプトマイシンおよび１００Ｕ　ペニシリンを含有するＤＭＥＭ培地を使用した。前記ウェルに、さらに、前記Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅまたは前記ｃｏｎｔｒｏｌ-ｅｘｏｓｏｍｅを、５０μＬまたは１００μＬを添加し、さらに一晩培養した。
　そして、培養後のＨＣＣ７０に、ルシフェリン試薬２００μＬを添加し、ｉｎ　ｖｉｖｏイメージングシステム（商品名ＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ、ＸＥＮＯＧＥＮ社製）を用いて、細胞内におけるルシフェラーゼ活性を測定した。前記ルシフェリン試薬は、前記参考例４と同じものを使用した。そして、エクソソーム添加量５０μＬの結果について、ｃｏｎｔｒｏｌ-ｅｘｏｓｏｍｅ使用時のルシフェラーゼ活性を１として、Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅ使用時のルシフェラーゼ活性の相対値を求めた。また、エクソソーム添加量１００μＬの結果について、ｃｏｎｔｒｏｌ-ｅｘｏｓｏｍｅ使用時のルシフェラーゼ活性を１として、Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅ使用時のルシフェラーゼ活性の相対値を求めた。これらの結果を下記表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　前記表４に示すように、Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅの存在下で培養することによって、前記ＨＣＣ７０内におけるルシフェラーゼ活性が低下した。また、Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅの添加量を増加させることによって、ルシフェラーゼ活性はより低下した。この結果から、前記ＨＣＣ７０内にエクソソームが導入され、導入された前記エクソソーム内のルシフェラーゼｓｉＲＮＡが放出されて機能したことがわかった。
［参考例６］
　本参考例では、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、ルシフェラーゼ活性を指標として、エクソソームによる細胞内へのルシフェラーゼｓｉＲＮＡのトランスファーを確認した。
（１）ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを内包するエクソソームの回収
　前記参考例５と同様にして、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡ／エクソソーム液（Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅ）およびコントロールエクソソーム液（ｃｏｎｔｒｏｌ-ｅｘｏｓｏｍｅ）を調製した。
（２）ｉｎ　ｖｉｖｏでのエクソソームによるルシフェラーゼ活性の抑制
　ルシフェラーゼを発現するＨＣＣ７０　２×１０６個を、マウス（Ｒａｇ２－／－／Ｂ６マウス、メス、１２週齢）の腹腔内に投与した。前記マウスの腹腔内に、前記Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅまたは前記ｃｏｎｔｒｏｌ-ｅｘｏｓｏｍｅを、毎日１ｍＬ、連続６日間投与した。
　つぎに、前記マウスの腹腔内に、ＰＢＳで希釈したルシフェリンを、ルシフェリン１５０ｍｇ／２０ｇ　ｂｏｄｙの条件で投与した。投与５日目および６日目に、前記マウスを、イソフルラン（商品名イソフル、アボット社製）による麻酔下で、麻酔開始２０分後、ｉｎ　ｖｉｖｏ　イメージングシステム（商品名ＩＶＩＳ　Ｌｕｍｉｎａ、ＸＥＮＯＧＥＮ社製）で、ルシフェラーゼ活性を測定した。そして、Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅを投与したマウスの腹部について、５日目のルシフェラーゼ活性を１として、６日目のルシフェラーゼ活性の相対値を求めた。また、ｃｏｎｔｒｏｌ-ｅｘｏｓｏｍｅを投与したマウスの腹部について、５日目のルシフェラーゼ活性を１として、６日目のルシフェラーゼ活性の相対値を求めた。これらの結果を下記表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　前記表５に示すように、ｃｏｎｔｒｏｌ-ｅｘｏｓｏｍｅを投与したマウスは、６日目において、５日目よりも高いルシフェラーゼ活性を示した。これに対して、６日目Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅの存在下で培養することによって、Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅを投与したマウスは、６日目において、５日目よりもルシフェラーゼ活性が低下していた。この結果から、Ｌｕｃ-ｓｉＲＮＡ-ｅｘｏｓｏｍｅからルシフェラーゼｓｉＲＮＡが放出され、マウスにおけるルシフェラーゼの発現が阻害され、ルシフェラーゼ活性が低下したことがわかる。
　本発明の発現ベクターによれば、前記結合ペプチドを提示する前記膜小胞を産生する細胞を得ることができる。そして、前記結合ペプチドを提示する前記膜小胞を、薬剤のキャリアとして使用すれば、前記結合ペプチドが前記ターゲット細胞の膜タンパク質に結合するため、前記ターゲット細胞に効率よく前記薬剤を投与でき、安全性に優れる。また、前記膜小胞は、前記薬剤を内包するため、例えば、前記ターゲット細胞に結合し、その内部に放出されるまで、前記薬剤の分解を防止できる。このため、本発明は、例えば、核酸薬剤等の医薬品としての実用化において、極めて有用な技術といえる。

Claims (35)

  1. ターゲット細胞の膜タンパク質に結合可能な結合ペプチドをコードする核酸配列を有することを特徴とする発現ベクター。
  2. さらに、膜貫通ペプチドをコードする核酸配列およびシグナルペプチドをコードする核酸配列の少なくとも一方を有する、請求項１記載の発現ベクター。
  3. 前記結合ペプチドと、前記膜貫通ペプチドおよび前記シグナルペプチドの少なくとも一方とを含むキメラペプチドをコードするキメラ核酸配列を有する、請求項２記載の発現ベクター。
  4. 前記ターゲット細胞が、がん細胞である、請求項１記載の発現ベクター。
  5. 前記ターゲット細胞の膜タンパク質が、ＥＧＦＲであり、前記膜タンパク質に結合可能なペプチドが、ＥＧＦ、その部分ペプチドおよびＧＥ１１ペプチドの少なくともいずれかである、請求項１記載の発現ベクター。
  6. 前記キメラ核酸配列が、その５’側から、前記シグナルペプチドのコード配列、前記結合ペプチドのコード配列および前記膜貫通ペプチドのコード配列を有する、請求項３記載の発現ベクター。
  7. 前記膜貫通ペプチドのコード配列と前記結合ペプチドのコード配列との間に、ペプチドタグのコード配列を有する、請求項３記載の発現ベクター。
  8. 前記結合ペプチドのコード配列と前記シグナルペプチドのコード配列との間に、ペプチドタグのコード配列を有する、請求項３記載の発現ベクター。
  9. 薬剤をデリバリーするためのキャリアを産生するキャリア産生細胞であって、
    請求項１記載の発現ベクターを有する、膜小胞の産生細胞であることを特徴とするキャリア産生細胞。
  10. 前記膜小胞が、エクソソームである、請求項９記載のキャリア産生細胞。
  11. 前記膜小胞の産生細胞が、赤血球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩球、好酸球、脂肪細胞、上皮細胞、腫瘍細胞、血小板、巨核球細胞、胎盤由来細胞、羊膜細胞、絨毛膜細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、臍帯血由来細胞、臍帯静脈内皮細胞および臍帯動脈内皮細胞からなる群から選択された少なくとも一つの細胞である、請求項９記載のキャリア産生細胞。
  12. 前記膜小胞の産生細胞が、薬剤が導入された細胞である、請求項９記載のキャリア産生細胞。
  13. 前記薬剤が、核酸薬剤である、請求項１２記載のキャリア産生細胞。
  14. 前記膜小胞の産生細胞が、核酸薬剤を発現する発現試薬が導入された細胞である、請求項９記載のキャリア産生細胞。
  15. 前記発現試薬が、前記核酸薬剤を発現する発現ベクターを含む、請求項１４記載のキャリア産生細胞。
  16. 薬剤をデリバリーするためのキャリアを産生するキャリア産生細胞の製造方法であって、
    請求項１記載の発現ベクターを、膜小胞の産生細胞に導入する工程を含むことを特徴とするキャリア産生細胞の製造方法。
  17. 前記膜小胞が、エクソソームである、請求項１６記載のキャリア産生細胞の製造方法。
  18. 前記膜小胞の産生細胞が、赤血球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩球、好酸球、脂肪細胞、上皮細胞、腫瘍細胞、血小板、巨核球細胞、胎盤由来細胞、羊膜細胞、絨毛膜細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、臍帯血由来細胞、臍帯静脈内皮細胞および臍帯動脈内皮細胞からなる群から選択された少なくとも一つの細胞である、請求項１６記載のキャリア産生細胞の製造方法。
  19. さらに、薬剤を、前記膜小胞の産生細胞に導入する工程を含む、請求項１６記載のキャリア産生細胞の製造方法。
  20. 前記薬剤を導入する工程が、核酸薬剤または前記核酸薬剤を発現する発現試薬を導入する工程である、請求項１９記載のキャリア産生細胞の製造方法。
  21. 前記発現試薬が、前記核酸薬剤を発現する発現ベクターを含む、請求項２０記載のキャリア産生細胞の製造方法。
  22. 薬剤をデリバリーするためのキャリアであって、
    膜ペプチドとして、ターゲット細胞の膜タンパク質に結合可能な結合ペプチドを有する膜小胞を含むことを特徴とするキャリア。
  23. 前記膜小胞が、前記膜ペプチドとして、さらに、膜貫通ペプチドおよびシグナルペプチドの少なくとも一方を含む、請求項２２記載のキャリア。
  24. 前記膜小胞が、前記膜ペプチドとして、キメラペプチドを有し、
    前記キメラペプチドが、前記結合ペプチド、前記膜貫通ペプチドおよび前記シグナルペプチドを含む、請求項２３記載のキャリア。
  25. 前記膜小胞が、エクソソームである、請求項２２記載のキャリア。
  26. 前記膜小胞が、薬剤を含む、請求項２２記載のキャリア。
  27. 前記薬剤が、核酸薬剤である、請求項２６記載のキャリア。
  28. 前記核酸薬剤が、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項２７記載のキャリア。
  29. 薬剤をデリバリーするためのキャリアの製造方法であって、
    請求項９記載のキャリア産生細胞を培養する工程を含むことを特徴とする、キャリアの製造方法。
  30. 前記膜小胞が、エクソソームである、請求項２９記載のキャリアの製造方法。
  31. 前記膜小胞の産生細胞が、赤血球、樹状細胞、リンパ球、好中球、好塩球、好酸球、脂肪細胞、上皮細胞、腫瘍細胞、血小板、巨核球細胞、胎盤由来細胞、羊膜細胞、絨毛膜細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、ｉＰＳ細胞、胚性幹細胞、臍帯血由来細胞、臍帯静脈内皮細胞および臍帯動脈内皮細胞からなる群から選択された少なくとも一つの細胞である、請求項２９記載のキャリアの製造方法。
  32. さらに、薬剤を、前記キャリア産生細胞に導入する工程を含む、請求項２９記載のキャリアの製造方法。
  33. 前記薬剤を導入する工程が、核酸薬剤または前記核酸薬剤を発現する発現試薬を導入する工程である、請求項３２記載のキャリアの製造方法。
  34. 前記核酸薬剤が、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項３３記載のキャリアの製造方法。
  35. 薬剤が導入された請求項９記載のキャリア産生細胞および前記薬剤が内包された請求項２２記載のキャリアの少なくとも一方を含むことを特徴とする医薬。
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