ES2956776T3 - Composición farmacéutica que comprende miARN-3140 para su uso en el tratamiento del cáncer - Google Patents
Composición farmacéutica que comprende miARN-3140 para su uso en el tratamiento del cáncer Download PDFInfo
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Abstract
[Problema] Encontrar un producto farmacéutico que muestre un fuerte efecto terapéutico sobre el cáncer. [Solución] Se proporciona una composición farmacéutica terapéutica para el cáncer que incluye un producto de transcripción de un gen que codifica un miARN, o un producto de procesamiento del mismo. En la composición farmacéutica, el miARN es uno o una pluralidad de miARN seleccionados del grupo que consiste en miR-3140, miR-137, miR-631 y miR-657. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composición farmacéutica que comprende miARN-3140 para su uso en el tratamiento del cáncer
Campo técnico
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para terapia contra el cáncer que comprende un producto de transcripción o procesamiento de un gen que codifica miARN-3140.
Antecedentes técnicos
El microARN (de aquí en adelante miARN) es un ácido nucleico funcional que está codificado en el genoma y en última instancia se convierte a un ARN minúsculo de aproximadamente 20-25 bases de longitud mediante un proceso de producción multietapa. El miARN se clasifica como un ARNnc (ARN no codificante) funcional, y se está aclarando que desempeña un papel importante en varios fenómenos biológicos (tal como la regulación de la expresión génica, etc.). Varios miARN que han llegado a ser bien conocidos hasta ahora incluyendo miARN humano están registrados en la miRBase (véase, http://www.mirbase.org/).
Se indica que el miARN está asociado con el inicio y la evolución de, por ejemplo, cáncer, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades psiquiátricas, enfermedad inflamatoria crónica, y similares. En particular en los últimos años, se ha indicado que el miARN está profundamente implicado en la cancerización o el envejecimiento de células.
Por ejemplo, la bibliografía de patente 1 describe que miR-22 fomenta el envejecimiento de células y suprime la invasión y metástasis de cáncer. Además, la bibliografía de patente 2 describe que una composición que comprende miR-34 se puede emplear para terapia contra el cáncer.
Lista de citas
[Bibliografía de patente 1] WO2011/078037
[Bibliografía de patente 2] WO2008/137867
Compendio de la invención
Problemas que se van a resolver mediante la invención
Los presentes inventores buscaron diligentemente miARN que tuvieran efecto terapéutico contra el cáncer de entre un gran número de miARN.
Medios para resolver los problemas
Como resultado, los presentes inventores encontraron miARN particulares que tienen efecto terapéutico contra el cáncer significativamente más fuerte que los miARN descritos en el estado de la técnica, llegando de esta manera a la finalización de la presente invención.
En otras palabras, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para terapia contra el cáncer que comprende un producto de transcripción o procesamiento de un gen que codifica un miARN, caracterizado en que dicho miARN es miR-3140.
Una forma de realización de la presente invención se caracteriza en que dicho cáncer es un cáncer sólido.
Una forma de realización de la presente invención se caracteriza en que dicho cáncer sólido es cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer de lengua, mesotelioma, sarcoma uterino, osteosarcoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, o cáncer de cabeza y cuello.
Una forma de realización de la presente invención se caracteriza en que dicho producto de transcripción o procesamiento de un gen que codifica un miARN es un pri-miARN, un pre-miARN, un miARN maduro bicatenario, un miARN maduro monocatenario expresado del extremo 5' de un pre-miARN, o un miARN maduro monocatenario expresado del extremo 3' de un pre-miARN.
Una forma de realización de la presente invención se caracteriza en que dicho miARN es:
(i) un miARN maduro que consiste en una secuencia representada por SEQ ID NO. 2;
(ii) un miARN que tiene una sustitución, adición, y/o deleción de 1-5 bases respecto a un miARN maduro que consiste en una secuencia representada por SEQ ID NO. 2, así como que tiene efecto terapéutico contra el cáncer; o
(iii) un miARN que tiene el 80 % o más de identidad de secuencia frente a un miARN maduro que consiste en una secuencia representada por SEQ ID NO. 2, así como que tiene efecto terapéutico contra el cáncer.
Una forma de realización de la presente invención se caracteriza en que dicho miARN está químicamente modificado. Una forma de realización de la presente invención se caracteriza en que dicha modificación química es una o más modificaciones químicas seleccionadas del grupo que consiste en ANB-ción, BNA-ción, ENA-ción, modificación con 2'-OMe, fosforotioación, S-TuD-ación, modificación con morfolino, adición de péptido, glucosilación, adición de aptámero, adición de molécula hidrofóbica, adición de polímero, y adición de ADN sin modificar.
Una forma de realización de la presente invención se caracteriza en que dicha composición farmacéutica además comprende un agente de transfección de ácido nucleico.
Una forma de realización de la presente invención se caracteriza en que dicho agente de transfección es un agente de transfección basado en lípidos, un agente de transfección basado en polímero, un agente de transfección basado en partículas magnéticas, un exosoma para administración de ácidos nucleicos, o una proteína vírica para administración de ácidos nucleicos.
Una forma de realización de la presente invención se caracteriza en que dicho agente de transfección es un agente de transfección que comprende un péptido representado por las secuencias de aminoácidos GGGGDD (G4D2), GGGGGGDD (G6D2), GGGGGGGGDD (G8D2), GGGGGGGGGGDD (G10D2), AAAAAAD (A6D), AAAAAADD (A6D2), AAAAAAK (A6K), AAAAAAKK (A6K2), VVVVVVD (V6D), VVVVVVDD (V6D2), VVVVVVK (V6K), VVVVVVKK (V6K2), LLLLLLD (L6D), LLLLLLDD (L6D2), LLLLLLK (L6K), o LLLLLLKK (L6K2).
Una forma de realización de la presente invención se caracteriza en que la composición farmacéutica de la presente invención es para administración tópica.
Una forma de realización de la presente invención se caracteriza en que la composición farmacéutica de la presente invención se usa en combinación con otros agentes anticancerosos.
Una forma de realización de la presente invención se caracteriza en que dichos otros agentes anticancerosos son uno o más agentes anticancerosos seleccionados del grupo que consiste en un agente alquilante, una preparación de platino, un antagonista de metabolismo, un inhibidor de topoisomerasa, un inhibidor microtubular, un antibiótico anticanceroso, un fármaco de diana molecular, una preparación hormonal, un fármaco inmunomodulador, un interferón, una interleuquina, un agente anticáncer vegetal, y una preparación MRB.
Otra forma de realización de la presente invención se refiere al uso de un producto de transcripción o procesamiento de un gen que codifica un miARN para producir una composición farmacéutica para terapia contra el cáncer, caracterizado en que dicho miARN es uno o más miARN seleccionados del grupo que consiste en miR-3140, miR-137, miR-631 y miR-657.
Otra forma de realización de la presente especificación se refiere a un método de terapia contra el cáncer que comprende una etapa de aplicar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica anticancerosa que comprende un producto de transcripción o procesamiento de un gen que codifica un miARN, caracterizado en que dicho miARN es uno o más miARN seleccionados del grupo que consiste en miR-3140, miR-137, miR-631 y miR-657. Esta forma de realización no es parte de la invención reivindicada.
La invención se define en las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 describe el flujo del cribado de miARN en los ejemplos.
La figura 2 describe el flujo del cribado de miARN en los ejemplos.
La figura 3 muestra cuatro miARN que muestran efecto de inhibición de crecimiento contra numerosos tipos de células cancerosas separados en el cribado de miARN.
La figura 4 muestra los efectos del miARN de la presente invención sobre cepas de células de cáncer de lengua (células HSC-4 y células OSC19).
La figura 5 muestra los efectos del miARN de la presente invención sobre una cepa de células de cáncer de lengua (células SAS).
La figura 6 muestra los efectos del miARN de la presente invención sobre una cepa de células de mesotelioma (células MSTO-211H).
La figura 7 muestra los efectos del miARN de la presente invención sobre una cepa de células de mesotelioma (células EHMES-10).
La figura 8 muestra los efectos del miARN de la presente invención sobre una cepa de células de sarcoma uterino (células MES-SA).
La figura 9 muestra los efectos del miARN de la presente invención sobre una cepa de células de osteosarcoma (células U2-OS).
La figura 10 muestra los efectos del miARN de la presente invención sobre cepas de células madre de cáncer (células
MDA-MB231-luc-D3H2LN).
La figura 11 muestra los efectos del miARN de la presente invención sobre una cepa de células de cáncer de pulmón (células A549).
La figura 12 muestra los efectos del miARN de la presente invención sobre cepas de células de cáncer de intestino grueso (células SW620, células SW480, y células Ht 29).
La figura 13 muestra el efecto terapéutico conta el cáncer del miARN de la presente invención in vivo.
La figura 14 muestra resultados del análisis de imagenología de tejidos tumorales a los 12, 19, 26, y 33 días después del trasplante de células tumorales.
La figura 15 muestra un gráfico que cuantifica los resultados del análisis de imagenología de la figura 14.
La figura 16 muestra los resultados de comparar pesos tumorales en el punto final.
La figura 17 muestra resultados del análisis de imagenología de tejidos tumorales después del trasplante de células tumorales.
La figura 18 muestra los resultados de comparar pesos tumorales en el punto final.
La figura 19 muestra la planificación en el experimento 7.
La figura 20 muestra los resultados de imagenología cuando miR-3140-3p se administra una vez.
La figura 21 muestra los resultados de imagenología cuando miR-3140-3p se administra una vez.
La figura 22 muestra los resultados de imagenología cuando miR-3140-3p se administra una vez.
La figura 23 muestra los resultados de imagenología cuando miR-3140-3p se administra dos veces.
La figura 24 muestra los resultados de imagenología cuando miR-3140-3p se administra dos veces.
La figura 25 muestra los resultados de imagenología cuando miR-3140-3p se administra dos veces.
La figura 26 muestra los resultados de imagenología cuando miR-3140-3p se administra tres veces.
La figura 27 muestra los resultados de imagenología cuando miR-3140-3p se administra tres veces.
La figura 28 muestra los resultados de imagenología cuando miR-3140-3p se administra tres veces.
La figura 29 muestra los resultados del experimento 8.
La figura 30 muestra la comparación del efecto de supresión tumoral entre miR-3140-3p y cisplatino.
La figura 31 muestra la comparación del efecto de supresión tumoral entre miR-3140-3p y cisplatino.
La figura 32 muestra la comparación del efecto de supresión tumoral entre miR-3140-3p y cisplatino.
La figura 33 muestra la comparación 
los índices de supervivencia entre el grupo de administración de miR-3140-3p y el grupo de administración de cisplatino.
Descripción de las formas de realización
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para terapia contra el cáncer que comprende un producto de transcripción o procesamiento de un gen que codifica un miARN (microARN). Un miARN general se biosintetiza a través de un proceso continuo. El producto de transcripción primario de un gen que codifica un miARN se llama transcrito miARN primario (pri-miARN), y en general tiene una estructura en horquilla de tallo-bucle. El primiARN es cortado por un complejo microprocesador, toma una forma de horquilla por Drosha que una enzima RNasa de serie III, y se produce el miARN precursor (pre-miARN) que es precursor intermedio de aproximadamente 70 bases. El pre-miARN se transporta después del núcleo al citoplasma. En el citoplasma, es cortado adicionalmente por Dicer que es otra enzima RNasa III, y se produce un miARN maduro bicatenario. En general, entre las dos hebras, se añade “-5p” a la expresada del extremo 5' del precursor y se añade “-3p” a la expresada del extremo 3' del precursor, y se representan como “hsa-miR-21-5p” y “hsa-miR-21-3p”. Nótese que, en principio, los miARN bien conocidos están registrados en la miRBase (véase, http://www.mirbase.org/).
Nótese que solo una de las hebras en el miARN maduro puede ejercer el efecto deseado, o cada una de las hebras puede ejercer el efecto deseado, o el efecto deseado puede ser ejercido en el estado bicatenario. Además, el efecto deseado también se puede ejercer en el estado pri-miARN o el estado pre-miARN.
El ácido nucleico comprendido en la composición de la presente invención es un producto de transcripción o procesamiento de un gen que codifica miR-3140, y también puede ser una variante o una modificación que retiene la función del ácido nucleico anteriormente mencionado.
La secuencia del producto de transcripción o procesamiento del gen que codifica miR-3140 usado en una forma de realización de la presente invención es como sigue.
[Tabla 1]
Nótese que la secuencia de la región del intrón que codifica el pri-miARN de miR-3140 se muestra en SEQ ID NO. 4. La secuencia del producto de transcripción o procesamiento del gen que codifica miR-137 usado es como sigue. [Tabla 2]
Nótese que la secuencia de la región del intrón que codifica el pri-miARN de miR-137 se muestra en SEQ ID NO. 7. La secuencia del producto de transcripción o procesamiento del gen que codifica miR-631 usado es como sigue. [Tabla 3]
Nótese que la secuencia de la región del intrón que codifica el pri-miARN de miR-631 se muestra en SEQ ID NO. 10. La secuencia del producto de transcripción o procesamiento del gen que codifica miR-657 usado es como sigue.
[Tabla 4]
Nótese que la secuencia de la región del intrón que codifica el pri-miARN de miR-657 se muestra en SEQ ID NO. 13.
El ácido nucleico comprendido en la composición de la presente invención puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico que tiene una sustitución, adición, y/o deleción de 1, 2, 3, 4, o 5 bases respecto a un miARN maduro que consiste en una secuencia representada por SEQ ID NO. 2, así como que tiene el efecto de inhibir el crecimiento de células cancerosas. La sustitución de una base respecto al miARN maduro puede ser, por ejemplo, una sustitución conservadora de ARN conocida en la técnica.
Además, el ácido nucleico comprendido en la composición de la presente invención puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico que tiene el 80 % o más (preferiblemente, el 85 % o más, el 90 % o más, el 95 % o más) de homología de secuencia (o identidad de secuencia) respecto a un miARN maduro que consiste en una secuencia representada por SEQ ID NO. 2, así como que tiene el efecto de inhibir el crecimiento de células cancerosas.
Un miARN maduro que consiste en una secuencia representada por SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 5, SEQ ID. 8, o SEQ ID NO. 11 se puede fabricar fácilmente mediante un equipo de síntesis de ARN comúnmente usado en la técnica, y un ácido nucleico que tiene una base particular sustituida, añadida, y/o delecionada se puede de forma similar fabricar fácilmente. Además, numerosas empresas aceptan síntesis encargada de ácidos nucleicos, y también es fácil obtener ARN de la secuencia deseada de tales empresas. Según esto, los expertos en la materia serán capaces de investigar la naturaleza y función de una variante o modificación de un miARN maduro que consiste en una secuencia representada por SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 5, SEQ ID. 8, o SEQ ID NO. 11 por medios convencionales sin excesiva carga.
Además, el ácido nucleico comprendido en la composición de la presente invención puede haber recibido una modificación química bien conocida en la técnica con el fin de mejorar la estabilidad o especificidad etc. del ARN. La modificación química que se puede emplear en la invención puede ser, por ejemplo, una ANB (ácido nucleico bloqueado)-ción, BNA (ácido nucleico en puente)-ción, ENA (ácidos nucleicos en puente 2'-O,4'-C-etileno)-ción, modificación con 2'-OMe, fosforotioación (S-ación), S-TuD (Synthetic Tough Decoy)-ación, modificación con morfolino, adición de péptido, glucosilación, adición de aptámero, adición de molécula hidrofóbica tal como colesterol, adición de polímero tal como PEG, o adición de ADN sin modificar. Estas modificaciones químicas se pueden realizar por medios bien conocidos en la técnica.
La presente invención se puede emplear para varias terapias contra el cáncer, por ejemplo, se puede emplear favorablemente para cáncer sólido. Más preferiblemente, el objeto de la presente invención puede ser cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer de lengua, mesotelioma, sarcoma uterino, osteosarcoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, o cáncer de cabeza y cuello.
Con el fin de introducir apropiadamente la presente invención a células cancerosas, la composición de la presente invención puede además comprender un agente de transfección de ácidos nucleicos. Los ejemplos del agente de transfección de ácidos nucleicos que se puede emplear para la presente invención incluyen un agente de transfección basado en lípidos, un agente de transfección basado en polímero, un agente de transfección basado en partículas magnéticas, un exosoma para administración de ácidos nucleicos, o una proteína vírica para administración de ácidos nucleicos.
Un ejemplo del agente de transfección basado en lípidos incluye un lípido catiónico. Con un lípido catiónico, los complejos ácido nucleico-lípido catiónico se incorporan en las células a través de endocitosis y se liberan al citoplasma, introduciendo de esta manera el ácido nucleico en las células (lipofección). Específicamente, por ejemplo, se pueden emplear varios reactivos comercialmente disponibles para lipofección.
Un ejemplo del agente de transfección basado en polímero incluye, por ejemplo, un polímero catiónico. Cuando un polímero catiónico entra en contacto con un ácido nucleico, se forma un complejo ácido nucleico-polímero, y el complejo se une a la membrana celular a través de interacción electrostática y se incorpora a la célula a través de endocitosis. Específicamente, se pueden emplear un péptido catiónico y un derivado del mismo (tal como polilisina y poliornitina), un polímero sintético de cadena lineal o ramificada (tal como polibreno y polietilenimina), una molécula de introducción basada en polisacáridos (tal como ciclodextrina y quitosano), un polímero natural (tal como histona y colágeno), así como dendrímeros activos e inactivos, y similares. Además, los agentes de transfección empleados en el llamado nanoDDS, tal como un agente de transfección que emplea un copolímero en bloque que forma nanopartículas micelares y un agente de transfección que emplea nanocuernos de carbono también se puede usar para la presente invención.
Un ejemplo del agente de transfección basado en partículas magnéticas incluye un agente de transfección que emplea partículas magnéticas recubiertas con moléculas catiónicas. Un agente de transfección basado en partículas magnéticas lleva a cabo la transfección adhiriendo el ácido nucleico en la superficie de las partículas magnéticas, y después introduciendo magnéticamente las partículas magnéticas anteriormente mencionadas en las células. Específicamente, por ejemplo, se pueden emplear varias partículas magnéticas comercialmente disponibles para la transfección.
Además, el agente de transfección de ácidos nucleicos que emplea un exosoma generalmente disponible o un agente de transfección que utiliza proteínas víricas tal como adenovirus también se puede usar para la presente invención.
Además, en la presente invención, un agente de transfección que comprende un péptido representado por las secuencias de aminoácidos GGGGDD (G4D2) (SEQ ID NO. 14), GGGGGGDD (G6D2) (SEQ ID NO. 15), GGGGGGGGDD (G8D2) (SEQ ID NO. 16), GGGGGGGGGGDD (G10D2) (SEQ ID NO. 17), AAAAAAD (A6D) (SEQ ID NO. 18), AAAAAADD (A6D2) (SEQ ID NO. 19), AAAAAAK (A6K) (SEQ ID NO. 20), AAAAAAKK (A6K2) (SEQ ID NO. 21), VVVVVVD (V6D) (SEQ ID NO. 22), VVVVVVDD (V6D2) (SEQ ID NO. 23), VVVVVVK (V6K) (SEQ ID NO.
24), VVVVVVKK (V6K2) (SEQ ID NO. 25), LLLLLLD (L6D) (SEQ ID NO. 26), LLLLLLDD (L6D2) (SEQ ID NO. 27), LLLLLLK (L6K) (SEQ ID NO. 28), o LLLLLLKK (L6K2) (SEQ ID NO. 29) se puede emplear, y en particular AAAAAAD (A6D) o AAAAAAK (A6K) se puede emplear favorablemente. Los efectos de estos péptidos como agentes de transfección se divulgan en, por ejemplo, el documento WO2010/024262.
La composición farmacéutica para terapia contra el cáncer de la presente invención se puede usar en combinación con otros agentes anticancerosos bien conocidos en la técnica. Los otros agentes anticancerosos usados en combinación no están limitados, y, por ejemplo, se pueden emplear uno o más agentes anticancerosos seleccionados del grupo que consiste en un agente alquilante, una preparación de platino, un antagonista de metabolismo, un inhibidor de topoisomerasa, un inhibidor microtubular, un antibiótico anticanceroso, un fármaco de diana molecular, una preparación hormonal, un fármaco inmunomodulador, un interferón, una interleuquina, un agente anticáncer vegetal, y una preparación MRB.
Los aspectos del uso en combinación de la composición farmacéutica para terapia contra el cáncer de la presente invención y los otros agentes anticancerosos bien conocidos en la técnica no están limitados, y los pueden llevar a cabo los expertos en la materia (tal como un médico) en varios aspectos según el tipo de cáncer que va a ser objeto o la fase terapéutica y similares. La composición farmacéutica para terapia contra el cáncer de la presente invención y los otros agentes anticancerosos se pueden administrar al sujeto al mismo tiempo o a diferentes tiempos. La composición farmacéutica para terapia contra el cáncer de la presente invención y los otros agentes anticancerosos también se pueden preparar como formulaciones que comprenden cada uno y administrar a un sujeto. La composición farmacéutica para terapia contra el cáncer de la presente invención y los otros agentes anticancerosos también se pueden preparar como un kit que comprende cada uno por separado.
Un aspecto de administrar la composición farmacéutica para terapia contra el cáncer de la presente invención y los otros agentes anticancerosos al mismo tiempo puede ser, por ejemplo, un aspecto de administrar a un sujeto una formulación que comprende la composición farmacéutica para terapia contra el cáncer de la presente invención y los otros agentes anticancerosos.
En la presente invención, un aspecto de administrar la composición farmacéutica para terapia contra el cáncer de la presente invención y los otros agentes anticancerosos a diferentes tiempos puede ser, por ejemplo, un aspecto de administrar cada uno de la composición farmacéutica para terapia contra el cáncer de la presente invención y los otros agentes anticancerosos con tiempo escalonado, y, por ejemplo, un aspecto de administrar cada uno de la composición farmacéutica para terapia contra el cáncer de la presente invención y los otros agentes anticancerosos de diferentes rutas de administración.
La ruta de administración de la composición farmacéutica para terapia contra el cáncer de la presente invención no está limitada, y puede ser administración sistémica o administración tópica. Las rutas de administración pueden incluir, por ejemplo administración oral incluyendo administración sublingual, administración parenteral tal como administración por inhalación, administración directa al tejido diana por catéter o inyección, administración intravenosa incluyendo infusión, administración transdérmica por parches y similares, supositorios, o administración por nutrición enteral forzada empleando un tubo nasogástrico, un tubo nasointestinal, un tubo de gastrostomía, o tubo de enterostomía, y similares.
La forma posológica de la composición farmacéutica para terapia contra el cáncer de la presente invención se puede determinar apropiadamente según dicha ruta de administración, y puede incluir, pero no está limitada a, inyecciones, infusiones, comprimidos, cápsulas, gránulos finos, polvos, líquidos, soluciones disueltas en jarabes, etc., parches, supositorios, y similares.
El sujeto para administrar la composición farmacéutica de la presente invención no está limitado y, por ejemplo, la presente invención se puede emplear para mamíferos (seres humanos, cerdos, vacas, monos, babuinos, perros,
gatos, ratas, ratones, y similares). Sin embargo, cuando sea desfavorable, se pueden retirar los seres humanos de los sujetos.
El método de administración de la composición farmacéutica de la presente invención a un sujeto (ruta de administración, dosis, frecuencia de administración al día, momento de administración, y similares) no está limitado, y lo pueden determinar apropiadamente los expertos en la materia (tal como un médico) según el estado de salud del sujeto, el grado de la enfermedad, el tipo de agente usado en combinación, y similares.
Los términos usados en el presente documento, excepto para los que están particularmente definidos, se emplean para describir formas de realización particulares, y no pretenden limitar la invención.
Además, el término “comprender” como se usa en el presente documento, a menos que el contenido claramente indique que se debe entender de otra manera, pretende la presencia de los artículos descritos (tal como componentes, etapas, elementos, y números), y no excluye la presencia de otros artículos (tal como componentes, etapas, elementos, y números).
A menos que se defina de otra manera, todos los términos usados en el presente documento (incluyendo términos técnicos y científicos) tienen los mismos significados que los que reconocen en sentido amplio los expertos en la materia de la tecnología a la que la presente invención pertenece. Los términos usados en el presente documento, a menos que explícitamente se defina de otra manera, se deben interpretar como que tienen significados consistentes con los significados en el presente documento y en campos técnicos relacionados, y no se deben interpretar como que tienen significados idealizados o excesivamente formales.
La presente invención se describirá ahora en más detalle con referencia a los ejemplos.
Ejemplos
Experimento 1: Cribado de miARN con alta inducibilidad en envejecimiento celular
(1) Transfección de todos los miARN en células TIG-3 (Figura 1)
Se transfectaron un total de 2028 tipos de miARN (mirVana; Ambion) en células TIG-3 (fibroblastos humanos) con un dosificador automático Bravo (Agilent). La transfección se llevó a cabo mediante el siguiente protocolo.
1: A 70 |jl de medio sin suero (SFM) se añadieron 0,35 j l de RNAiMAX (Invitrogen).
2: La solución de 1 se añadió a una placa de 96 pocillos (j-placa; ibidi) con Bravo.
3: A 2 se añadieron 0,7 j l de miARN (conc. madre 2 jM ) con Bravo, y esto se mezcló pipeteando.
4: Esto se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos.
5: Una suspensión celular diluida a 3,5 x 104 células/ml se dispensó a 70 j l cada una con Bravo.
6: Esto se incubó a 37 °C con condición de CO2 al 5 %.
(2-1) Tinción de las células transfectadas.
Estableciendo el día de la transfección como día 0, la tinción se realizó cinco días después con el fin de evaluar el número de células y el tamaño celular. El protocolo para lo mismo se muestra a continuación.
1: Se llevó a cabo lavar dos veces con PBS (-).
2: Se añadió solución de formalina al 3,7 %, y esto se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos para fijar las células.
3: Se llevó a cabo lavar dos veces con PBS (-).
4: Se añadió solución de tinción, y esto se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos para teñir.
5: Se llevó a cabo lavar tres veces con PBS (-).
6: La placa después de completar la tinción se sometió a fotografía de campo visual completa con un equipo de fotografía automático Operetta (Perkin Elmer).
7: Las fotografías tomadas se sometieron a análisis cuantitativo con un software de análisis de imagen Columbus (Perkin Elmer).
[Tabla 5]
Tabla 1: Composición de la solución de tinción
DAPI (1 mg/ml) (DOJINDO) 
0,1 μl 
0,1 μg/ml 
(2-2) Ensayo de SA-p-galactosidasa de las células transfectadas
Estableciendo el día de la transfección como día 0, el ensayo de SA-p-galactosidasa se realizó el día 7. El protocolo de operación se muestra a continuación.
1: Se llevó a cabo lavar dos veces con PBS (-).
2: Se añadió solución de formalina al 2 %, y esto se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos para fijar las células.
3: Se llevó a cabo lavar dos veces con PBS (-).
4: Se preparó la solución de tinción de p-Gal en el momento de uso y se añadió a los pocillos.
5: Esto se incubó a 37 °C durante 12-16 horas.
6: La placa después de completar la tinción se fotografió con un equipo de fotografía automático Opera (Perkin Elmer).
[Tabla 6]
Tabla 2: Composición de la solución de tinción de p-Gal
*1: Preparado de modo que el pH sea 6,0.
*2: X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranósido: Wako) se preparó en el momento de uso con N,N-dimetilformamida.
(3) Análisis del resultado del cribado (Figura 2)
Cada uno de los valores del número de células y tamaño celular obtenidos se puntuaron con los valores numéricos de miARN de secuencia aleatoria que es el control negativo y los valores numéricos de miR-34a-5p que es el control positivo. El método de puntuación se muestra a continuación.
En cada placa:
1: El valor del control positivo se restó del valor del control negativo.
2: El valor de cada miARN se restó del valor del control negativo.
3: El valor de 2 se dividió por el valor de 1 para obtener un valor de puntuación.
4: Se dibujó un diagrama de dispersión tomando el valor de puntuación del número de células en el eje horizontal y el valor de puntuación del tamaño celular en el eje vertical.
5: Se identificaron 579 tipos de miARN donde al menos uno de los dos mostró un valor de puntuación mayor que los valores de puntuación de miR-22-3p y miR-22-5p como candidatos de miARN de inducción por envejecimiento.
6: De los 579 tipos de candidatos, 349 tipos de miARN que indujeron activación de p-galactosidasa que es un marcador de envejecimiento celular se identificaron como miARN de inducción por envejecimiento.
Experimento 2: Cribado adicional empleando cepas de células cancerosas
Los 349 tipos de miARN de inducción por envejecimiento (mirVANA; Ambion) obtenidos del cribado se transfectaron en varias cepas de células cancerosas (cepa de células de cáncer de intestino grueso HCT116 (p53 de tipo salvaje y deleción de p53), cepas de células de cáncer pancreático BxPC-3 y CFPAC-1, y cepa de células de cáncer de lengua HSC-4) con un dosificador automático Bravo (Agilent).
La transfección se llevó a cabo con el siguiente protocolo.
1: A 70 μl de medio sin suero (SFM) se añadieron 0,35 μl de RNAiMAX (Invitrogen).
2: La solución de 1 se añadió a una placa de 96 pocillos (p-placa; ibidi) con Bravo.
3: A 2 se añadieron 0,7 μl de miARN (conc. madre 200 nM) con Bravo, y esto se mezcló pipeteando.
4: Esto se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos.
5: Una suspensión celular diluida a 3,5 x 1034 células/ml se dispensó a 70 μl cada una con Bravo.
6: Esto se incubó a 37 °C con condición de CO2 al 5 %.
Estableciendo el día de transfección como día 0, el día 5 se evaluó el índice de supervivencia celular con PrestoBlue (Invitrogen). El protocolo de operación se muestra a continuación.
1. El medio se intercambió a un medio que comprendía PrestoBlue diluido 20 veces, y esto se incubó a 37 °C durante 1 hora.
2. El valor de fluorescencia (Ex/Em = 560 nm/590 nm) se midió con Enspire (Perkin Elmer).
3. El índice de supervivencia celular se determinó estableciendo el valor de fluorescencia obtenido del pocillo con solo el reactivo como el fondo.
El protocolo anterior se llevó a cabo para cada cepa de células cancerosas (cepa de células de cáncer de intestino grueso HCT116 (p53 de tipo salvaje y deleción de p53), cepas de células de cáncer pancreático BxPC-3 y CFPAC-1, y cepa de células de cáncer de lengua HSC-4), y los miARN que suprimen la proliferación celular más significativamente que miR-34a-5p se separaron.
Como resultado de separar los miARN que suprimen la proliferación celular más significativamente que miR-34a-5p comúnmente en todas las cepas celulares, se encontraron cuatro miARN (miR-137-3p, miR-631-5p, miR-657-3p, y miR-3140-3p) (Figura 3).
Experimento 3. Confirmación del efecto de inhibición del crecimiento celular empleando varias cepas de células cancerosas
(1) Cepa de células de cáncer de lengua (HSC-4 y OSC-19) (Figura 4)
Se transfectaron cuatro miARN (miR-137-3p, miR-631-5p, miR-657-3p, y miR-3140-3p) en cepas de células de cáncer de lengua (HSC-4 y OSC-19), y se observó la proliferación celular. La transfección se llevó a cabo con el siguiente protocolo.
1: A una placa de 35 mm se añadieron 500 μl de medio sin suero (SFM) y 5 μl de RNAiMAX (Invitrogen).
2: A la solución de 1 se añadió 1 μl de cada uno de los ácidos nucleicos (control, miR-137-3p, miR-631-5p, miR-657-3p, miR-3140-3p y una mezcla de cantidades iguales de los cuatro miARN (concentración final de 10 nM). 3: Esto se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos.
4: Una suspensión celular diluida a 6,7 x 104 células/ml se añadió a la placa de 35 mm a 1,5 ml cada una.
5: Esto se incubó a 37 °C con condición de CO2 al 5 %.
6: Las células se contaron cinco días después de la transfección.
Como se muestra en la figura 4, los cuatro miARN mostraron efecto de inhibición del crecimiento celular en ambas cepas de células de cáncer de lengua.
(2) Cepa de células de cáncer de lengua (SAS) (Figura 5)
Se transfectaron cuatro miARN (miR-137-3p, miR-631-5p, miR-657-3p, y miR-3140-3p) en una cepa de células de cáncer de lengua (SAS), y se observó la proliferación celular. La transfección se llevó a cabo con el siguiente protocolo.
1: A una placa de 35 mm se añadieron 500 μl de medio sin suero (SFM) y 5 μl de RNAiMAX (Invitrogen).
2: A la solución de 1 se añadieron 4 μl de cada una de las soluciones de miARN (véase la tabla 3) (concentración final de 10 nM).
3: Esto se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos.
4: Se añadieron 1,5 ml de una suspensión celular diluida a 6,7 x 104 células/ml a la placa de 35 mm.
5: Esto se incubó a 37 °C con condición de CO2 al 5 %.
6: Las operaciones de 1-3 se repitieron dos días después de la transfección.
7: Las soluciones preparadas en 6 se añadieron cada una a la placa cultivada en 5.
8: Las células se contaron siete días después de la primera transfección.
Como se muestra en la figura 5, cualquiera de los cuatro miARN mostró efecto de inhibición del crecimiento celular contra la cepa de células de cáncer de lengua SAS.
[Tabla 7]
Tabla 3: dosis de miARN
(3) Cepas de células de mesotelioma pleural maligno, cepa de células de sarcoma uterino, y cepa de células de osteosarcoma (figuras 6-9)
Entre los cuatros miARN anteriores, miR-3140-3p que tenía un efecto de inhibición del crecimiento celular particularmente alto se transfectó en cada una de cepas de células de mesotelioma pleural maligno (MSTO-211H y EHMES-10), cepa de células de sarcoma uterino (MES-SA), y cepa de células de osteosarcoma (U2-OS), y se observó la proliferación celular. Como objetos de comparación, se emplearon miR-22-3p y miR-34a-5p que mostraron efecto de inhibición del crecimiento celular en investigación anterior. La transfección se llevó a cabo con el siguiente protocolo.
1: A una placa de 35 mm se añadieron 500 μl de medio sin suero (SFM) y 5 μl de RNAiMAX (Invitrogen).
2: A la solución de 1 se añadió 1 μl de cada uno de miR-control, o miR-3140-3p, miR-22-3p y miR-34a-5p (conc.
madre 20 μM) (concentración final de 10 nM).
3: Esto se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos.
4: Se añadieron 1,5 ml de una suspensión celular diluida a 6,7 x 104 células/ml a la placa de 35 mm.
5: Esto se incubó a 37 °C con condición de CO2 al 5 %.
6: Las células se contaron cuatro días después de la transfección.
Como se muestra en las figuras 6-9, en cualquiera de las cepas celulares, miR-3140-3p mostró efecto de inhibición del crecimiento celular extremadamente alto comparado con miR-22-3p y miR-34a-5p del estado de la técnica.
(4) Cepa de células madre de cáncer de mama (células MDA-MB231-luc-D3H2LN) (Figura 10)
Se transfectó miR-3140-3p en una cepa de células cancerosas muy metastásicas de cáncer de mama (células MDA-MB231-luc-D3H2LN), y se observó la proliferación celular. Como objetos de comparación, se emplearon miR-22-3p y miR-34a-5p que mostraron efecto de inhibición del crecimiento celular en investigación anterior. La transfección se llevó a cabo con el siguiente protocolo.
1: A una placa de 35 mm se añadieron 500 μl de medio sin suero (SFM) y 5 μl de RNAiMAX (Invitrogen).
2: A la solución de 1 se añadieron 12,5 μl de cada uno de miR-control, o miR-3140-3p, miR-22-3p y miR-34a-5p (conc. madre 2 μM) (concentración final de 12,5 nM).
3: Esto se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos.
4: Se añadieron 1,5 ml de una suspensión celular diluida a 6,7 x 104 células/ml a la placa de 35 mm.
5: Esto se incubó a 37 °C con condición de CO2 al 5 %.
6: Las células se contaron cuatro días después de la transfección.
Además, mediante el protocolo posterior, se analizó la expresión del marcador de apoptosis anexina V en células de cáncer de mama transfectadas con miR-3140-3p.
1: La transfección de miR-3140-3p se realizó con un protocolo similar al descrito anteriormente.
2: Seis días después de la transfección, las células se recuperaron junto con el sobrenadante.
3: Se prepararon muestras para FACS según el protocolo del kit del ensayo de anexina V.
4: Las células teñidas por anexina V-FITC se tiñeron con un anticuerpo contra el marcador de células madre de cáncer CD44 (eBioScience).
5: Las muestras preparadas se analizaron con separador celular (SONY).
Como se muestra en la figura 10 arriba, miR-3140-3p mostró efecto de inhibición del crecimiento celular extremadamente alto contra la cepa de células madre de cáncer de mama (células MDA-MB231-luc-D3H2LN).
Además, como se muestra en la figura 10 abajo, en células madre de cáncer de mama a los seis días después de la transfección de miR-3140-3p, el marcador de apoptosis anexina V era muy positivo (96,97 %). En otras palabras, se mostró que miR-3140-3p significativamente induce apoptosis contra células madre de cáncer.
(5) Cepa de células de cáncer de pulmón (A549) (Figura 11)
Se transfectó miR-3140-3p en una cepa de células de cáncer de pulmón (A549), y se observó la proliferación celular. Como objetos de comparación, se emplearon miR-22-3p y miR-34a-5p que mostraron efecto de inhibición del crecimiento celular en investigación anterior. La transfección se llevó a cabo con el siguiente protocolo.
1: A una placa de 35 mm se añadieron 500 μl de medio sin suero (SFM) y 5 μl de RNAiMAX (Invitrogen).
2: A la solución de 1 se añadió 1 μl de cada uno de miR-control, o miR-3140-3p, miR-22-3p y miR-34a-5p (conc.
madre 20 μM) (concentración final de 10,0 nM).
3: Esto se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos.
4: Se añadieron 1,5 ml de una suspensión celular diluida a 6,7 x 104 células/ml a la placa de 35 mm.
5: Esto se incubó a 37 °C con condición de CO2 al 5 %.
6: Las células se contaron seis días después de la transfección.
Como se muestra en la figura 11, miR-3140-3p mostró efecto de inhibición del crecimiento celular extremadamente alto contra la cepa de células de cáncer de pulmón (A549).
(6) Cepas de células de cáncer de intestino grueso (SW620, SW480, y HT29) (Figura 12)
Se transfectó miR-3140-3p en cepas de células de cáncer de intestino grueso (SW620, SW480, y HT29), y se observó la proliferación celular. La transfección se llevó a cabo con el siguiente protocolo.
1: A una placa de 35 mm se añadieron 500 μl de medio sin suero (SFM) y 5 μl de RNAiMAX (Invitrogen).
2: A la solución de 1 se añadieron 12,5 μl de cada uno de miR-control, o miR-3140-3p, miR-22-3p y miR-34a-5p (conc. madre 2 μM) (concentración final de 10,0 nM).
3: Esto se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos.
4: Se añadieron 1,5 ml de una suspensión celular diluida a 6,7 x 104 células/ml a la placa de 35 mm.
5: Esto se incubó a 37 °C con condición de CO2 al 5 %.
6: Las células se contaron siete días después de la transfección.
Los resultados se muestran en la figura 12. Estableciendo el número de células de introducción del control como el 100 %, el índice de supervivencia de las células en las que se introdujo miR-3140-3p se muestra en %. Como se muestra en la figura 12, miR-3140-3p mostró efecto de inhibición del crecimiento celular extremadamente alto contra cualquiera de las cepas de células de cáncer de intestino grueso.
Experimento 4. Efecto antitumoral del miARN de la presente invención in vivo (células de mesotelioma pleural maligno) (Figura 13)
Con el fin de verificar el efecto antitumoral del miARN de la presente invención in vivo, se realizaron experimentos con animales de laboratorio trasplantados con células de mesotelioma pleural maligno.
(1) Preparación de las células
Se usaron células de mesotelioma pleural maligno células MSTO-211H.
1: Las células en la placa se lavaron dos veces con PBS (-).
2: Las células se despegaron con tripsina.
3: Esto se suspendió en un medio, y las células se contaron.
4: Se realizó centrifugación en una condición de 1000 rpm durante 3 min para precipitar.
5: Las células se resuspendieron en PBS (-) con el fin de obtener 2,0 x 107 células/ml.
(2) Trasplante de células a ratones
Se usaron C-B-17/Icr-scid/scid Jcl (ratones SCID) de seis semanas de edad como ratones. A los ratones SCID se les administró por vía subcutánea 100 μl de la suspensión celular preparada, y las células se dejaron asentar.
(3) Administración de miARN
Se emplearon control negativo que es la secuencia control y miR-3140-p3 que es el miARN de la presente invención. Se empleó A6K (de 3D Matrix) como el reactivo de administración de ácidos nucleicos. La administración del miARN a los ratones se llevó a cabo con el siguiente protocolo.
1: Se diluyeron 100 μM del ácido nucleico (miARN) con solución salina al 10 % y agua esterilizada con el fin de obtener 71,4 μM.
2: Una solución de A6K al 1 % se sonicó durante 5 minutos antes del uso.
3: El ácido nucleico diluido y la solución de A6K al 1 % se mezclaron en una proporción de 1:1 para dar el ácido nucleico de administración.
4: A los ratones SCID se les administró por vía subcutánea (sitio del tumor) 50 μl de cada uno de los ácidos nucleicos de administración.
(5) Evaluación
Los resultados experimentales se evaluaron con el siguiente protocolo.
1: A partir de cuatro días después del trasplante, el ácido nucleico se administró cada uno o dos días.
2: Se realizaron un total de 13 administraciones, y 34 días después del trasplante se estableció como el punto final.
3: Los ratones se disecaron, y el tumor subcutáneo se extirpó y pesó.
Los resultados del experimento se muestran en la figura 13 (n = 3). Como se muestra en la figura 13, comparado con el grupo control, el peso del tumor era significativamente menor en ratones en los que se introdujo miR-3140-3p en el sitio del tumor.
Experimento 5. Efecto antitumoral del miARN de la presente invención in vivo (células de mesotelioma pleural maligno) (Figura 14-16)
(1) Preparación de las células
Se usaron células de mesotelioma pleural maligno células EHMES-10.
1: Las células en la placa se lavaron dos veces con PBS (-).
2: Las células se despegaron con tripsina.
3: Esto se suspendió en un medio, y las células se contaron.
4: Se realizó centrifugación en una condición de 1000 rpm durante 3 min para precipitar.
5: Las células se resuspendieron en PBS (-) con el fin de obtener 2,0 x 107 células/ml.
(2) Trasplante de células a ratones
Se usaron C-B-17/Icr-scid/scid Jcl (ratones SCID) de seis semanas de edad como ratones. A los ratones SCID se les administró por vía subcutánea 100 μl de la suspensión celular preparada, y las células se dejaron asentar.
(3) Administración de miARN
Se emplearon control negativo que es la secuencia control y miR-3140-p3 que es el miARN de la presente invención. Se empleó A6K (de 3D Matrix) como el reactivo de administración de ácidos nucleicos. La administración del miARN a los ratones se llevó a cabo con el siguiente protocolo.
1: Se diluyeron 100 μM del ácido nucleico (miARN) con solución salina al 10 % y agua esterilizada con el fin de obtener 71,4 μM.
2: Una solución de A6K al 1 % se sonicó durante 5 minutos antes del uso.
3: El ácido nucleico diluido y la solución de A6K al 1 % se mezclaron en una proporción de 1:1 para dar el ácido nucleico de administración.
4: A los ratones SCID se les administró por vía subcutánea (sitio del tumor) 50 μl de cada uno de los ácidos nucleicos de administración.
(5) Evaluación
Los resultados experimentales se evaluaron con el siguiente protocolo.
1: A partir de dos días después del trasplante, el ácido nucleico se administró cada uno o dos días.
2: Se realizaron un total de 13 administraciones, y 33 días después del trasplante se estableció como el punto final.
3: A los 12, 19, 26 y 33 días después del trasplante, se administró luciferina por vía intraperitoneal para imagenología con el fin de seguir el tamaño del tumor.
4: Los ratones se disecaron en el punto final, y el tumor subcutáneo se extirpó y pesó.
Los resultados del análisis de imagenología de tejidos tumorales a los 12, 19, 26 y 33 días después del trasplante de células tumorales se muestran en la figura 14 y la figura 15. Como se muestra en la figura 14 y la figura 15, comparado con el grupo control, la expansión del tumor estaba suprimida en ratones en los que se introdujo miR-3140-3p en el sitio del tumor. Además, un resultado similar se mostró en la figura 16 que compara el peso del tumor en el punto final. Experimento 6. Efecto antitumoral del miARN de la presente invención in vivo (células de cáncer de lengua) (Figuras 17 y 18)
(1) Preparación de las células
Se usó la cepa de células de cáncer de lengua células HSC-4.
1: Las células en la placa se lavaron dos veces con PBS (-).
2: Las células se despegaron con tripsina.
3: Esto se suspendió en un medio, y las células se contaron.
4: Se realizó centrifugación en una condición de 1000 rpm durante 3 min para precipitar.
5: Las células se resuspendieron en PBS (-) con el fin de obtener 2,0 x 107 células/ml.
(2) Trasplante de células a ratones
Se usaron C-B-17/Icr-scid/scid Jcl (ratones SCID) de seis semanas de edad como ratones. A los ratones SCID se les administró por vía subcutánea 100 j l de la suspensión celular preparada, y las células se dejaron asentar.
(3) Administración de miARN
Se emplearon control negativo que es la secuencia control y miR-3140-p3, miR-137, miR-631 y miR-657 que son los miARN de la presente invención. Se empleó A6K (de 3D Matrix) como el reactivo de administración de ácidos nucleicos. La administración del miARN a los ratones se llevó a cabo con el siguiente protocolo.
1: Se diluyeron 100 jM del ácido nucleico (miARN) con solución salina al 10 % y agua esterilizada con el fin de obtener 71,4 jM .
2: Una solución de A6K al 1 % se sonicó durante 5 minutos antes del uso.
3: El ácido nucleico diluido y la solución de A6K al 1 % se mezclaron en una proporción de 1:1 para dar el ácido nucleico de administración.
4: A los ratones SCID se les administró por vía subcutánea (sitio del tumor) 50 j l de cada uno de los ácidos nucleicos de administración.
(5) Evaluación
Los resultados experimentales se evaluaron con el siguiente protocolo.
1: A partir de tres días después del trasplante, el ácido nucleico se administró cada uno o dos días.
2: Se realizaron un total de 11 administraciones, y 28 días después del trasplante se estableció como el punto final.
3: A los 7, 14, 21 y 28 días después del trasplante, se administró luciferina por vía intraperitoneal para imagenología con el fin de seguir el tamaño del tumor.
4: Los ratones se disecaron en el punto final, y el tumor subcutáneo se extirpó y pesó.
Los resultados del análisis de imagenología de tejidos tumorales después del trasplante celular se muestran en la figura 17. Como se muestra en la figura 17, comparado con el grupo control, la expansión del tumor estaba suprimida en ratones en los que se introdujo el miARN de la presente invención en el sitio del tumor. Además, un resultado similar se mostró en la figura 18 que compara el peso del tumor en el punto final.
De los resultados anteriores, se mostró que el miARN de la presente invención también ejerce efecto antitumoral extremadamente fuerte in vivo.
Experimento 7. Efecto antitumoral del miARN de la presente invención in vivo (células de mesotelioma pleural maligno) (Figura 19-28)
El efecto de supresión de tumor de miR-3140-3p in vivo se investigó con un ratón modelo de trasplante ortotópico intratorácico.
Se usaron ratones macho (C-B-17/Icr-scid/scid Jcl) de seis semanas de edad como ratones. Se usó la cepa de células de mesotelioma pleural maligno EHMES-10 que expresa el gen de luciferasa como la célula tumoral.
El protocolo del experimento se muestra a continuación.
1: A los ratones se les administró por vía intraperitoneal 0,1 ml por 10 g de peso corporal de un fármaco anestésico mezcla de clorhidrato de medetomidina, midazolam y tartrato de butorfanol.
2: Después de la anestesia, el pelo del pecho del ratón se afeitó, y se hizo una incisión en la epidermis con tijeras.
3: En la cavidad pleural del ratón se trasplantaron 100 j l de células tumorales (3 x 107 células/ml) con una jeringa de 27G para insulina.
4: Tres días después del trasplante, se realizó imagenología de las células tumorales con el sistema de imagenología in vivo IVIS Spectrum CT
5: Después de la imagenología, se realizó agrupamiento con ratones trasplantados con éxito.
6: A los ratones se les administró por vía intraperitoneal 0,1 ml por 10 de peso corporal de un fármaco anestésico mezcla de clorhidrato de medetomidina, midazolam y tartrato de butorfanol para anestesiar a los ratones.
7: Después de la anestesia, se administraron 100 j l de una mezcla miARN/A6K en la cavidad pleural del ratón. 8: Se realizó imagenología cada semana desde la primera imagenología, y se observó la expansión del tumor. 9: Se registraron el tiempo y la fecha de muerte de los ratones, y se calculó el índice de supervivencia de los ratones.
La planificación de la administración e imagenología se muestra en la figura 19. El fármaco anestésico mezcla de clorhidrato de medetomidina, midazolam y tartrato de butorfanol se preparó como en la tabla 4 siguiente. La mezcla de miARN/A6K se preparó como en la tabla 5. Además, al grupo control se le administró el ARN mostrado en la tabla 6 en lugar del miARN de la presente invención.
Nótese que, con el fin de mejorar la eficacia de expresión, el miARN se administró como bicatenario en combinación con una hebra complementaria que comprende mal emparejamiento parcial.
[Tabla 8]
Tabla 4. Preparación de un fármaco anestésico mezcla
[Tabla 9]
Tabla 5. Preparación de la mezcla miARN/A6K
g p y 9, u
El miARN se administra a 3,2 mol (45 ug) por ratón.
[Tabla 10]
Tabla 6. Secuencias de control y miR-3140-3p
Los resultados experimentales se muestran de la figura 20 a la figura 28.
En el grupo con una administración de miR-3140-3p, la reducción del tumor se vio en la segunda imagenología (día 10 después del trasplante), y el efecto había persistido hasta la cuarta imagenología (día 24 después del trasplante) (Figura 20).
Los resultados de imagenología se digitalizaron y representaron en un gráfico, y se mostró que miR-3140-3p significativamente suprimió la expansión del tumor (Figura 21).
Al comparar los índices de supervivencia de los ratones, se observó que los índices de supervivencia de los ratones habían mejorado en el grupo de administración de miR-3140-3p (Figura 22).
Se mostró que, de forma similar al grupo con una administración, miR-3140-3p también suprimía significativamente el mesotelioma pleural maligno en los grupos con dos y tres administraciones de miR-3140-3p (Figuras 23-28).
Los índices de supervivencia de los ratones estuvieron más mejorados en el grupo con tres administraciones de miR-3140-3p (Figura 28).
Experimento 8. Cálculo del valor CIsn (Figura 29)
El valor CI50 de miR-3140-3p se calculó con células de mesotelioma pleural maligno EHMES-10.
El protocolo para lo mismo se muestra a continuación.
1: A 25 ul de medio sin suero (SFM) se añadieron 0,25 ul de RNAiMAX (Invitrogen).
2: Se diluyeron en serie miR-control y miR-3140-3p de modo que las concentraciones finales fueran 40 nM, 20 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 500 μM, 100 μM, 50 μM, 10 μM, 5 μM, y 1 μM, y se mezcló con el complejo SFM/RNAiMAX.
3: Esto se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos.
4: Se añadieron 75 |jl de cada una de células a 6,7 x 104 células/ml a cada pocilio.
5: Esto se incubó a 37 °C en la condición de CO2 al 5 %.
6: Cinco días después de la transfección, los índices de supervivencia de las células se investigaron con el kit de contaje de células 8 (DOJINDO). El protocolo para lo mismo se muestra a continuación.
(i) El kit de contaje de células se diluyó 10 veces con un medio.
(ii) Se añadieron 200 j l de cada uno del kit de contaje de células diluido a cada pocillo.
(iii) Esto se incubó a 37 °C en la condición de CO2 al 5 % durante 1 hora.
(iv) Se midieron los valores a 450 nm/600 nm con un lector de placas.
Nótese que el mismo ARN control que el usado en el experimento 7 se empleó como el control.
Los resultados se muestran en la figura 29. Como se muestra en la figura 29, se reveló que miR-3140-3p muestra efecto de inhibición del crecimiento contra la cepa de células de mesotelioma maligno EHMES-10 incluso a una concentración muy baja. El cálculo del valor CI50 dio una concentración final de 0,57 nM.
Experimento 9. Comparación del efecto antitumoral con agentes de quimioterapia (Figuras 30-33)
Con el fin de investigar la superioridad relativa del efecto antitumoral de miR-3140-3p, el efecto de supresión tumoral de cisplatino que es el fármaco de primera línea de mesotelioma pleural maligno y el efecto de supresión tumoral de miR-3140-3p se compararon in vivo.
Se usaron ratones macho (C-B-17/Icr-scid/scid Jcl) de seis semanas de edad como ratones. Se usó la cepa de células de mesotelioma pleural maligno EHMES-10 que expresa el gen de luciferasa como la célula tumoral.
El protocolo se muestra a continuación.
1: A los ratones se les administró por vía intraperitoneal 0,1 ml por 10 g de peso corporal de un fármaco anestésico mezcla de clorhidrato de medetomidina, midazolam y tartrato de butorfanol.
2: Después de la anestesia, el pelo del pecho del ratón se afeitó, y se hizo una incisión en la epidermis con tijeras.
3: En la cavidad pleural del ratón se trasplantaron 100 j l de células tumorales (3 x 107 células/ml) con una jeringa de 27G para insulina.
4: Cuatro días después del trasplante, se realizó imagenología de las células tumorales con el sistema de imagenología in vivo IVIS Spectrum CT.
5: Después de la imagenología, se realizó agrupamiento con ratones trasplantados con éxito.
6: A los ratones se les administró por vía intraperitoneal 0,1 ml por 10 de peso corporal de un fármaco anestésico mezcla de clorhidrato de medetomidina, midazolam y tartrato de butorfanol para anestesiar a los ratones.
7: Después de la anestesia, se administraron 100 j l de una mezcla miARN/A6K en la cavidad pleural del ratón para el grupo de administración de miARN, y se administró por vía intraperitoneal cisplatino (6 mg/kg) para el grupo de administración de cisplatino.
8: Se realizó imagenología cada semana desde la primera imagenología, y se observó la expansión del tumor.
El fármaco anestésico mezcla de clorhidrato de medetomidina, midazolam y tartrato de butorfanol se preparó como en la tabla 4 mostrada anteriormente. La mezcla de miARN/A6K se preparó como en las tablas 5 y 6 mostradas anteriormente. El cisplatino se preparó como en la tabla 7 a continuación.
[Tabla 11]
Tabla 7. Preparación de cisplatino
Nótese que el mismo ARN control que el usado en el experimento 7 se empleó como el control.
Los resultados experimentales se muestran en las figuras 30-33. Como se muestra en cada figura, se mostró que miR-3140-3p puede ejercer un efecto antitumoral que es equivalente o mayor comparado con cisplatino que es también el fármaco de primera línea de mesotelioma pleural maligno.
16
Claims (11)
1. Una composición farmacéutica para uso en terapia contra el cáncer que comprende un ARN que funciona como un miARN maduro, caracterizada en que dicho ARN comprende:
(i) un miARN maduro que consiste en una secuencia representada por SEQ ID NO. 2;
(ii) un ARN que tiene una sustitución, adición, y/o deleción de 1-5 bases respecto a un miARN maduro que consiste en la secuencia representada por SEQ ID NO. 2, y que tiene efecto terapéutico contra el cáncer; o
(iii) un ARN que tiene un 80 % o más de identidad de secuencia respecto a un miARN maduro que consiste en la secuencia representada por SEQ ID NO. 2, y que tiene efecto terapéutico contra el cáncer.
2. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 1, caracterizada en que dicho cáncer es un cáncer sólido.
3. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 2, caracterizada en que dicho cáncer sólido es cáncer de colon, cáncer pancreático, cáncer de lengua, mesotelioma, sarcoma uterino, osteosarcoma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, o cáncer de cabeza y cuello.
4. La composición farmacéutica para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada en que dicho miARN está químicamente modificado.
5. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 4, caracterizada en que dicha modificación química es una o más modificaciones químicas seleccionadas del grupo que consiste en ANB-ción, BNA-ción, ENA-ción, modificación con 2'-OMe, fosforotioación, S-TuD-ación, modificación con morfolino, adición de péptido, glucosilación, adición de aptámero, adición de molécula hidrofóbica, adición de polímero, y adición de ADN sin modificar.
6. La composición farmacéutica para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada en que se usa en combinación con un agente de transfección de ácidos nucleicos.
7. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 6, caracterizada en que dicho agente de transfección es un agente de transfección basado en lípidos, un agente de transfección basado en polímero, un agente de transfección basado en partículas magnéticas, un exosoma para administración de ácidos nucleicos, o una proteína vírica para administración de ácidos nucleicos.
8. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 6, caracterizada en que dicho agente de transfección es un agente de transfección que comprende un péptido representado por las secuencias de aminoácidos GGGGDD (G4D2), GGGGGGDD (G6D2), GGGGGGGGDD (G8D2), GGGGGGGGGGDD (G10D2), AAAAAAD (A6D), AAAAAADD (A6D2), AAAAAAK (A6K), AAAAAAKK (A6K2), VVVVVVD (V6D), VVVVVVDD (V6D2), VVVVVVK (V6K), VVVVVVKK (V6K2), LLLLLLD (L6D), LLLLLLDD (L6D2), LLLLLLK (L6K), o LLLLLLKK (L6K2).
9. La composición farmacéutica para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada en que se administra a través de administración tópica.
10. La composición farmacéutica para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada en que se usa en combinación con otros agentes anticancerosos.
11. La composición farmacéutica para uso según la reivindicación 10, caracterizada en que dichos otros agentes anticancerosos son uno o más agentes anticancerosos seleccionados del grupo que consiste en un agente alquilante, una preparación de platino, un antagonista de metabolismo, un inhibidor de topoisomerasa, un inhibidor microtubular, un antibiótico anticanceroso, un fármaco de diana molecular, una preparación hormonal, un fármaco inmunomodulador, un interferón, una interleuquina, un agente anticáncer vegetal, y una preparación MRB.
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