JPWO2019093308A1 - miRNAを含むがん治療用医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
前記miRNAが、miR−3140、miR−137、miR−631、およびmiR−657からなる群から選択される1または複数のmiRNAであることを特徴とする、
医薬組成物に関する。
(i)配列番号1、配列番号2、配列番号5、配列番号8、または、配列番号11で表される配列からなるmature−miRNA;
(ii)配列番号1、配列番号2、配列番号5、配列番号8、または、配列番号11で表される配列からなるmature−miRNAに対して、1〜5塩基の置換、付加、および/または欠失を有し、がん治療効果を有する、miRNA;または、
(iii)配列番号1、配列番号2、配列番号5、配列番号8、または、配列番号11で表される配列からなるmature−miRNAに対して、80%以上の配列相同性を有し、がん治療効果を有する、miRNA;
であることを特徴とする。
前記miRNAが、miR−3140、miR−137、miR−631、およびmiR−657からなる群から選択される1または複数のmiRNAであることを特徴とする、
使用に関する。
前記方法は、がん患者に対して、治療上有効量の、miRNAをコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物を含む抗がん用医薬組成物を適用するステップ、
を含み、
前記miRNAが、miR−3140、miR−137、miR−631、およびmiR−657からなる群から選択される1または複数のmiRNAであることを特徴とする、
治療方法に関する。
2:1の溶液を、Bravoを用いて96well plate(μ−plate;ibidi)に加えた。
3:2にmiRNA(Stock Conc. 2μM)を、Bravoを用いて0.7μL加え、ピペッティングにより混和した。
4:室温で20分間インキュベートした。
5:3.5×104cells/mLに希釈した細胞懸濁液を、Bravoを用いて70μLずつ分注した。
6:37℃,5%CO2条件下でインキュベートした。
2:3.7%ホルマリン溶液を加え、室温で10分間インキュベートし細胞を固定した。
3:PBS(−)を用いて2回洗浄を行った。
4:Stain Solutionを加え、室温で30分間インキュベートし、染色した。
5:PBS(−)を用いて3回洗浄を行った。
6:染色し終わったプレートは、自動写真撮影装置Operetta(Perkin Elmer)を用いて全視野撮影を行った。
7:撮影した写真は、画像解析ソフトColumbus(Perkin Elmer)を用いて定量解析を行った。
2:2%ホルマリン溶液を加え、室温で5分間インキュベートし細胞を固定した。
3:PBS(−)を用いて2回洗浄した。
4:β−Gal stain solutionを用事調製し、ウェルに加えた。
5:37℃で12−16時間インキュベートした。
6:染色し終わったプレートは、自動写真撮影装置Opera(Perkin Elmer)を用いて撮影した。
得られた細胞数、細胞の大きさの数値をそれぞれ、ネガティブコントロールであるランダム配列miRNAの数値およびポジティブコントロールであるmiR−34a−5pの数値を用いてスコア化した。スコア化の方法を以下に示した。
1:ネガティブコントロールの値からポジティブコントロールの値を引いた。
2:ネガティブコントロールの値からそれぞれのmiRNAの値を引いた。
3:2の値を1の値で割り、スコア値とした。
4:横軸に細胞数のスコア値を縦軸に細胞の大きさのスコア値を取り散布図を描いた。
5:miR−22−3pおよびmiR−22−5pのスコア値よりも少なくとも一方が高いスコア値を示したmiRNAを老化誘導miRNA候補として579種類同定した。
6:579種類の候補中、細胞老化マーカーであるβ−ガラクトシダーゼの活性化を誘導したmiRNAを老化誘導miRNAとして349種類同定した。
トランスフェクションは以下の手順で実施した。
2:1の溶液を、Bravoを用いて96well plate(μ−plate;ibidi)に加えた。
3:2にmiRNA(Stock Conc. 200nM)をBravoを用いて0.7μL加え、ピペッティングにより混和した。
4:室温で20分間インキュベートした。
5:3.5×104cells/mL希釈した細胞懸濁液をBravoを用いて70μLずつ分注した。
6:37℃,5%CO2条件下でインキュベートした。
2.Enspire(Perkin Elmer)を用いて蛍光値(Ex/Em=560nm/590nm)を測定した。
3.試薬のみのウェルから得られる蛍光値をバックグラウンドとして、細胞生存率を求めた。
2:1の溶液に核酸(Control,miR−137−3p,miR−631−5p,miR−657−3p,miR−3140−3p,4つのmiRNAの等量混合物)をそれぞれ1μLずつ加えた。(終濃度10nM)
3:室温で20分間インキュベートした。
4:6.7×104cells/mLに希釈した細胞懸濁液を1.5mLずつ35mm dishに加えた。
5:37℃,5%CO2条件下でインキュベートした。
6:トランスフェクション後5日後に細胞計数を行った。
2:1の溶液にmiRNA溶液をそれぞれ4μLずつ加えた(表3参照)。(終濃度10nM)
3:室温で20分間インキュベートした。
4:6.7×104cells/mLに希釈した細胞懸濁液を1.5mLずつ35mmdishに加えた。
5:37℃,5%CO2条件下でインキュベートした。
6:トランスフェクション後2日後に再び1−3の操作を行った。
7:6により調製した溶液を5で培養中のdishにそれぞれ添加した。
8:最初のトランスフェクション後7日後に細胞計数を行った。
2:1の溶液にmiR−ControlまたはmiR−3140−3p,miR−22−3p,miR−34a−5p(stock conc. 20μM)をそれぞれ1μL加えた。(終濃度10nM)
3:室温で20分間インキュベートした。
4:6.7×104cells/mLに希釈した細胞懸濁液を1.5mLずつ35mmdishに加えた。
5:37℃,5%CO2条件下でインキュベートした。
6:トランスフェクション後4日後に細胞計数を行った。
2:1の溶液にmiR−ControlまたはmiR−3140−3p,miR−22−3p,miR−34a−5p(stock conc. 2μM)をそれぞれ12.5μL加えた。(終濃度12.5nM)
3:室温で20分間インキュベートした。
4:6.7×104cells/mLに希釈した細胞懸濁液を1.5mLずつ35mmdishに加えた。
5:37℃,5%CO2条件下でインキュベートした。
6:トランスフェクション後4日後に細胞計数を行った。
1:上記と同様の手順で、miR−3140−3pのトランスフェクションを行なった。
2:トランスフェクション6日後に細胞を上清ごと回収した。
3:Annexin V assay kitのプロトコルに従い、FACS用サンプルを調製した。
4:Annexin V−FITCにより染色した細胞を、がん幹細胞マーカーであるCD44に対する抗体(eBioScience)を用いて染色した。
5:調製したサンプルを、セルソーター(SONY)を用いて解析した。
2:1の溶液にmiR−ControlまたはmiR−3140−3p,miR−22−3p,miR−34a−5p(stock conc. 20μM)をそれぞれ1μL加えた。(終濃度10.0nM)
3:室温で20分間インキュベートした。
4:6.7×104cells/mLに希釈した細胞懸濁液を1.5mLずつ35mmdishに加えた。
5:37℃,5%CO2条件下でインキュベートした。
6:トランスフェクション後6日後に細胞計数を行った。
2:1の溶液にmiR−ControlまたはmiR−3140−3p,miR−22−3p,miR−34a−5p(stock conc. 2μM)をそれぞれ12.5μL加えた。(終濃度10.0nM)
3:室温で20分間インキュベートした。
4:6.7×104cells/mLに希釈した細胞懸濁液を1.5mLずつ35mmdishに加えた。
5:37℃,5%CO2条件下でインキュベートした。
6:トランスフェクション後7日後に細胞計数を行った。
悪性胸膜中皮腫細胞MSTO−211H細胞を使用した。
1:ディッシュ上の細胞をPBS(−)で2回ウォッシュした。
2:トリプシンを用いて細胞を剥がした。
3:培地で懸濁し、細胞計数を行った。
4:1000rpm 3minの条件で遠心し、ペレットダウンした。
5:細胞を2.0×107cells/mLとなるようPBS(−)で再懸濁した。
マウスは6週齢のC−B−17/Icr−scid/scid Jcl(SCID マウス)を使用した。SCIDマウスの皮下に調製した細胞懸濁液100μLを投与し、細胞を定着させた。
コントロール配列であるネガティブコントロールと、本発明のmiRNAであるmiR−3140−3pを用いた。核酸デリバリー試薬として、A6K(3Dマトリックス社)を用いた。マウスへのmiRNAの投与は以下の手順で実施した。
2:1%A6K溶液を使用前に5分間超音波処理を行った。
3:希釈した核酸と1%A6K溶液を1:1の割合で混合し、投与核酸とした。
4:SCIDマウス皮下(腫瘍部)に投与核酸を50μLずつ投与した。
以下の手順で実験結果の評価を行った。
1:移植後4日後から、1日または2日おきに核酸を投与した。
2:計13回投与し、移植後34日後をエンドポイントとした。
3:マウスを解剖し、皮下にある腫瘍を摘出し、その重量を測定した。
悪性胸膜中皮腫細胞EHMES−10細胞を使用した。
1:ディッシュ上の細胞をPBS(−)で2回ウォッシュした。
2:トリプシンを用いて細胞を剥がした。
3:培地で懸濁し、細胞計数を行った。
4:1000rpm 3minの条件で遠心し、ペレットダウンした。
5:細胞を2.0×107cells/mLとなるようPBS(−)で再懸濁した。
マウスは6週齢のC−B−17/Icr−scid/scid Jcl(SCID マウス)を使用した。SCIDマウスの皮下に調製した細胞懸濁液100μLを投与し、細胞を定着させた。
コントロール配列であるネガティブコントロールと、本発明のmiRNAであるmiR−3140−3pを用いた。核酸デリバリー試薬として、A6K(3Dマトリックス社)を用いた。マウスへのmiRNAの投与は以下の手順で実施した。
2:1%A6K溶液を使用前に5分間超音波処理を行った。
3:希釈した核酸と1%A6K溶液を1:1の割合で混合し、投与核酸とした。
4:SCIDマウス皮下(腫瘍部)に投与核酸を50μLずつ投与した。
以下の手順で実験結果の評価を行った。
1:移植後2日後から、1日または2日おきに核酸を投与した。
2:計13回投与し、移植後33日後をエンドポイントとした。
3:移植後12、19、26、33日後にルシフェリンを腹腔内に投与し、イメージングを行うことで腫瘍の大きさをトレースした。
4:エンドポイントでマウスを解剖し、皮下にある腫瘍を摘出し、その重量を測定した。
舌がん細胞株HSC−4細胞を使用した。
1:ディッシュ上の細胞をPBS(−)で2回ウォッシュした。
2:トリプシンを用いて細胞を剥がした。
3:培地で懸濁し、細胞計数を行った。
4:1000rpm 3minの条件で遠心し、ペレットダウンした。
5:細胞を2.0×107cells/mLとなるようPBS(−)で再懸濁した。
マウスは6週齢のC−B−17/Icr−scid/scid Jcl(SCID マウス)を使用した。SCIDマウスの皮下に調製した細胞懸濁液100μLを投与し、細胞を定着させた。
コントロール配列であるネガティブコントロールと、本発明のmiRNAであるmiR−3140−3p、miR−137、miR−631およびmiR−657を用いた。核酸デリバリー試薬として、A6K(3Dマトリックス社)を用いた。マウスへのmiRNAの投与は以下の手順で実施した。
2:1%A6K溶液を使用前に5分間超音波処理を行った。
3:希釈した核酸と1%A6K溶液を1:1の割合で混合し、投与核酸とした。
4:SCIDマウス皮下(腫瘍部)に投与核酸を50μLずつ投与した。
以下の手順で実験結果の評価を行った。
1:移植後3日後から、1日または2日おきに核酸を投与した。
2:計11回投与し、移植後28日後をエンドポイントとした。
3:移植後7、14、21、28日後にルシフェリンを腹腔内に投与し、イメージングを行うことで腫瘍の大きさをトレースした。
4:エンドポイントでマウスを解剖し、皮下にある腫瘍を摘出し、その重量を測定した。
1:マウス腹腔内に体重10gあたり0.1mLの塩酸メデトミジン、ミダゾラム、酒石酸ブトルファノールの混合麻酔薬を投与した。
2:麻酔後マウス胸部の毛を剃り、ハサミで表皮を切開した。
3:マウス胸腔内に27Gのインスリン用シリンジを用いて、腫瘍細胞(3×107cells/mL)を100μL移植した。
4:移植後3日後、IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging Systemを用いて、腫瘍細胞のイメージングを行なった。
5:イメージング後、移植に成功したマウスを用いて、群分けを行なった。
6:マウス腹腔内に体重10gあたり0.1mLの塩酸メデトミジン、ミダゾラム、酒石酸ブトルファノールの混合麻酔薬を投与し、マウスを麻酔した。
7:麻酔後、マウス胸腔内にmiRNA/A6K混合物を100μL投与した。
8:最初のイメージングから1週間おきにイメージングを行い、腫瘍増大を観察した。
9:マウスの死亡日時を記録し、マウス生存率を算出した。
1:25μLの無血清培地(Serum Free Medium(SFM))に対し0.25μLのRNAiMAX(Invitrogen)を加えた。
2:miR−ControlおよびmiR−3140−3pを終濃度が40nM、20nM、10nM、5nM、1nM、500pM、100pM、50pM、10pM、5pM、1pMとなるように段階希釈し、SFM/RNAiMAX複合体と混合した。
3:室温で20分間インキュベートした。
4:6.7×104cells/mLの細胞を75μLずつ各wellに加えた。
5:37℃、5%CO2条件下でインキュベートした。
6:トランスフェクション後5日後にCell Counting Kit 8(DOJINDO)を用いて細胞の生存率を検討した。以下にその手順を示す
(i)Cell Counting Kit を培地で10倍希釈した。
(ii)各wellに200μLずつ希釈したCell Counting Kitを添加した。
(iii)37℃、5%CO2条件下で1時間インキュベートした。
(iv)プレートリーダーを用いて450nm/600nmの値を測定した。
1:マウス腹腔内に体重10gあたり0.1mLの塩酸メデトミジン、ミダゾラム、酒石酸ブトルファノールの混合麻酔薬を投与した。
2:麻酔後マウス胸部の毛を剃り、ハサミで表皮を切開した。
3:マウス胸腔内に27Gのインスリン用シリンジを用いて、腫瘍細胞(3×107cells/mL)を100μL移植した。
4:移植後4日後にIVIS SpectrumCT In Vivo Imaging Systemを用いて腫瘍細胞のイメージングを行なった。
5:イメージング後、移植に成功したマウスを用いて、群分けを行なった。
6:マウス腹腔内に体重10gあたり0.1mLの塩酸メデトミジン、ミダゾラム、酒石酸ブトルファノールの混合麻酔薬を投与し、マウスを麻酔した。
7:麻酔後、miRNA投与群にはmiRNA/A6K混合物を胸腔内に100μL、シスプラチン投与群にはシスプラチン(6mg/kg)を腹腔内に投与した。
8:最初のイメージングから1週間おきにイメージングを行い、腫瘍増大を観察した。
Claims (15)
- miRNAをコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物を含むがん治療用医薬組成物であって、
前記miRNAが、miR−3140、miR−137、miR−631、およびmiR−657からなる群から選択される1または複数のmiRNAであることを特徴とする、
医薬組成物。 - 請求項1に記載の医薬組成物であって、
前記がんが、固形がんであることを特徴とする、
医薬組成物。 - 請求項2に記載の医薬組成物であって、
前記固形がんが、大腸がん、膵臓がん、舌がん、中皮腫、子宮肉腫、骨肉腫、乳がん、肺がん、または頭頸部がんであることを特徴とする、
医薬組成物。 - 請求項1に記載の医薬組成物であって、
前記miRNAをコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物は、pri−miRNA、pre−miRNA、2本鎖mature−miRNA、pre−miRNAの5’末端側から発現する1本鎖mature−miRNA、または、pre−miRNAの3’末端側から発現する1本鎖mature−miRNAであることを特徴とする、
医薬組成物。 - 請求項4に記載の医薬組成物であって、
前記miRNAが、
(i)配列番号1、配列番号2、配列番号5、配列番号8、または、配列番号11で表される配列からなるmature−miRNA;
(ii)配列番号1、配列番号2、配列番号5、配列番号8、または、配列番号11で表される配列からなるmature−miRNAに対して、1〜5塩基の置換、付加、および/または欠失を有し、がん治療効果を有する、miRNA;または、
(iii)配列番号1、配列番号2、配列番号5、配列番号8、または、配列番号11で表される配列からなるmature−miRNAに対して、80%以上の配列相同性を有し、がん治療効果を有する、miRNA;
であることを特徴とする、
医薬組成物。 - 請求項1〜5のいずれか1項に記載の医薬組成物であって、
前記miRNAが、化学的に修飾されていることを特徴とする、
医薬組成物。 - 請求項6に記載の医薬組成物であって、
前記化学的修飾が、LNA化、BNA化、ENA化、2’−OMe修飾、ホスホロチオエート化、S−TuD化、モルフォリノ修飾、ペプチド付加、糖鎖付加、アプタマー付加、疎水性分子付加、高分子付加、および、非修飾DNA付加からなる群から選択される、1または複数の化学的修飾であることを特徴とする、
医薬組成物。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載の医薬組成物であって、
前記医薬組成物が、核酸トランスフェクション剤をさらに含むことを特徴とする、
医薬組成物。 - 請求項8に記載の医薬組成物であって、
前記トランスフェクション剤が、脂質系トランスフェクション剤、ポリマー系トランスフェクション剤、磁気粒子系トランスフェクション剤、核酸デリバリー用エクソソーム、または、核酸デリバリー用ウイルスタンパク質であることを特徴とする、
医薬組成物。 - 請求項8に記載の医薬組成物であって、
前記トランスフェクション剤は、GGGGDD(G4D2)、GGGGGGDD(G6D2)、GGGGGGGGDD(G8D2)、GGGGGGGGGGDD(G10D2)、AAAAAAD(A6D)、AAAAAADD(A6D2)、AAAAAAK(A6K)、AAAAAAKK(A6K2)、VVVVVVD(V6D)、VVVVVVDD(V6D2)、VVVVVVK(V6K)、VVVVVVKK(V6K2)、LLLLLLD(L6D)、LLLLLLDD(L6D2)、LLLLLLK(L6K)、または、LLLLLLKK(L6K2)のアミノ酸配列で表されるペプチドを含むトランスフェクション剤であることを特徴とする、
医薬組成物。 - 請求項1〜10のいずれか1項に記載の医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、局所投与用であることを特徴とする、
医薬組成物。 - 請求項1〜11のいずれか1項に記載の医薬組成物であって、
他の抗がん剤と併用されることを特徴とする、
医薬組成物。 - 請求項12に記載の医薬組成物であって、
前記他の抗がん剤が、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、微小管阻害剤、抗がん性抗生物質、分子標的薬、ホルモン製剤、免疫調節薬、インターフェロン、インターロイキン、植物由来抗がん剤、BRM製剤からなる群から選択される、1または複数の抗がん剤であることを特徴とする、
医薬組成物。 - miRNAをコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物の、がん治療用医薬組成物の製造のための使用であって、
前記miRNAが、miR−3140、miR−137、miR−631、およびmiR−657からなる群から選択される1または複数のmiRNAであることを特徴とする、
使用。 - がんの治療方法であって、
前記方法は、がん患者に対して、治療上有効量の、miRNAをコードする遺伝子の転写産物またはそのプロセシング産物を含む抗がん用医薬組成物を適用するステップ、
を含み、
前記miRNAが、miR−3140、miR−137、miR−631、およびmiR−657からなる群から選択される1または複数のmiRNAであることを特徴とする、
治療方法。
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