JP5145557B2

JP5145557B2 - マイクロｒｎａを有効成分として含有する腫瘍増殖抑制剤、および癌治療用医薬組成物

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Publication number: JP5145557B2
Application number: JP2007228442A
Authority: JP
Inventors: 斉中釜; 大田澤; 直人土屋
Original assignee: Japan Health Sciences Foundation
Current assignee: Japan Health Sciences Foundation
Priority date: 2007-03-01
Filing date: 2007-09-04
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2027-09-04
Also published as: JP2008239596A

Description

本発明は、マイクロＲＮＡを有効成分として含有する腫瘍増殖抑制剤、および癌治療用医薬組成物に関する。

マイクロRNAは約22塩基の蛋白質非翻訳RNAであり、ヒトには約1000種類存在する事が示唆されている。近年、マイクロRNAは生体内でさまざまな遺伝子の発現抑制を行う分子として注目されている。ゲノム上には各マイクロRNA遺伝子の領域が存在し、RNAポリメラーゼIIによって転写され、約数百塩基のマイクロRNA初期転写産物が形成される。マイクロRNA初期転写産物は核内でDrosha、細胞質内でDicerと呼ばれる2種類のRNAase III酵素によってプロセシングされ、成熟マイクロRNAが形成される。成熟マイクロRNAはRISC複合体と協調しつつ、相補的配列をもつ複数のターゲット遺伝子のmRNAと相互作用し、遺伝子の発現を抑制する事が知られている（非特許文献1）。

いくつかのマイクロRNAはがんを含めたヒト疾患との関連が示唆されている。特にがんとマイクロRNAの関係に関して、様々な臓器において正常組織とがん組織で多くのマイクロRNAの発現様式が異なる事から、発がん過程へのマイクロRNA発現異常の関与が強く示唆されている（非特許文献2-4）。近年、腫瘍抑制的あるいは発がん促進的マイクロRNAの存在が示唆されている（非特許文献5-7）。腫瘍抑制的マイクロRNAとして、miR-15とmiR-16はアポトーシス抑制因子であるBCL2の発現を抑制する事によってヒト巨核球細胞にアポトーシスを誘導する事が報告されている（非特許文献8）。Let-7は、ヒト肝がんならびに子宮がん細胞株において、がん遺伝子Rasの発現を抑制的に調節する事が知られている（非特許文献9）。また、miR-143とmiR-145はヒト大腸がん組織での発現低下が認められるが、その生物学的意義は未だ不明である（非特許文献10）。一方、発がん促進的マイクロRNAとして、miR-17-92クラスターは転写因子c-Mycと協調して、マウスにB細胞型リンパ腫を誘発させる事が報告されている（非特許文献11）。また、miR-21の発現低下はヒトグリオブラストーマ細胞株にアポトーシスを誘導する事が知られている（非特許文献12）。以上より、腫瘍抑制的マイクロRNAの発現低下あるいは発がん促進的マイクロRNAの発現上昇がヒト発がん過程に関与している可能性が強く示唆されている。

miRNAを用いた癌の予後判定方法、癌の遺伝子治療ベクター及び癌治療用医薬組成物も提案されている(特許文献1)。特定の塩基配列を含むDNAから転写されるmiRNA、pre-miRNA及びpri-miRNAからなる群から選択されるいずれか1つを有効成分として含有する癌治療用医薬組成物が記載されている(請求項１５)。
Bartel DP, マイクロRNA：遺伝学的特性、生物学的特性、メカニズムと機能(MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function), Cell, 2004年, 116巻, p.281-297 Lu J, Getz G, Miska EAら, マイクロRNA発現プロファイルがヒトがん組織を分類する(MicroRNA expression profiles classify human cancers), Nature, 2005年, 435巻, p.834-838 Volinia S, Calin GA, Liu CG, Ambs Sら, ヒトがん組織におけるマイクロRNAの発現形式はがん関連遺伝子のターゲットを明らかにする(A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets), Proc Natl Acad Sci USA, 2006年, 103巻, p.2257-2261 Calin GA, Croce CM, ヒトがん組織に特徴的なマイクロRNA(MicroRNA signatures in human cancers), Nature Rev Cancer, 2006年, 6巻, p.857-866 Esquela-Kerscher A, Slack FJ, がんマイクロRNA遺伝子−がん組織において役割をもったマイクロRNA(Oncomirs−microRNAs with a role in cancer), Nature Rev Cancer, 2006年, 6巻, p.259-269 Kent OA, Mendell JT, がんパズルにおける小さなピース：腫瘍抑制的及び発がん促進的microRNAs(A small piece in the cancer puzzle: microRNAs as tumor suppressors and oncogenes), Oncogene, 2006年, 25巻, p.6188-6196 Zhang B, Pan X, Cobb GP, Anderson TA, 発がん促進的及び腫瘍抑制的マイクロRNAs(MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors), Dev Biol, 2007年, 302巻, p.1-12 Cimmino A, Calin GA, Fabbri M, Iorio MVら, miR-15とmiR-16はBCL2をターゲットとしてアポトーシスを誘導する(miR-15 and miR-16 induce apoptosis by targeting BCL2), Proc Natl Acad Sci USA, 2005年, 102巻, p.13944-13949 Johnson SM, Grosshans H, Shingara J, Byrom Mら, RASはlet-7マイクロRNAファミリーによって調節されている(RAS is regulated by the let-7 microRNA family), Cell, 2005年, 120巻, p.635-647 Michael MZ, O'Connor SM, van Holst Pellekaan NG, Young GP, James RJ, 大腸がん組織において発現が低下しているマイクロRNA(Reduced accumulation of specific microRNAs in colorectal neoplasia), Mol Cancer Res, 2003年, 1巻, p.882-891 He L, Thomson JM, Hemann MT, Hernando-Monge Eら, ヒトがん遺伝子としてのマイクロRNAポリシストロン(A microRNA polycistron as a potential human oncogene), Nature, 2005年, 435巻, p.828-833 Chan JA, Krichevsky AM, Kosik KS, microRNA-21はヒトグリオブラストーマ細胞株において抗アポトーシス因子となる(MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells), Cancer Res, 2005年, 65巻, p.6029-6033 特開２００５−１９２４８４号公報

上記のように、腫瘍抑制的マイクロRNAの発現低下あるいは発がん促進的マイクロRNAの発現上昇がヒト発がん過程に関与している可能性が強く示唆されているが、実際に腫瘍抑制的マイクロRNAを用いた腫瘍増殖抑制剤は知られていない。

また、特許文献1に記載の発明では、マイクロRNAを直接用いる方法ではなく、マイクロRNAを転写によって作成しえるＤＮＡを用いるものである。また、特許文献1は、マイクロRNAを転写によって作成しえるＤＮＡを用いて、マイクロRNAによる癌治療についてのデータは含んでおらず、実際に腫瘍抑制的マイクロRNAを用いた腫瘍増殖抑制剤は知られていない。

そこで、本発明の目的は、マイクロRNAを有効成分として含有する腫瘍増殖抑制剤、および癌治療用医薬組成物を提供することにある。

本発明者らは腫瘍抑制的マイクロRNAの探索を目的として、腫瘍抑制遺伝子p53の活性化に伴って発現が誘導されるマイクロRNAの同定を試みた。ヒト大腸がん細胞株HCT116において、アドリアマイシン処理によるp53の活性化に伴い上昇する機能未知のマイクロRNA、miR-34a、miR-34b、miR-34cを同定した。一方、p53を欠損するHCT116では、miR-34の発現誘導を認めなかった。正常なp53を有するヒト大腸がん細胞株（LoVo、RKO）は、HCT116と同様にmiR-34の発現誘導を認めた。この知見を基に、miR-34の腫瘍細胞増殖抑制効果を検討した結果、miR-34aが、複数の大腸癌細胞に対して増殖抑制効果を示すことを見いだして本発明を完成させた。

本発明は以下のとおりである。
［1]配列表の配列番号1で示される塩基配列を有するマイクロＲＮＡ34a(以下、miR-34aという)を有効成分として含有し、キャリアーとして、アテロコラーゲンをさらに含有する腫瘍増殖抑制剤。
［2]miR-34aとアテロコラーゲンとの混合比が１：９９〜９９：１の範囲である[1]に記載の腫瘍増殖抑制剤。
［3]腫瘍が大腸癌である［1］又は[2]に記載の腫瘍増殖抑制剤。
［4]［1］〜[3]のいずれかに記載の腫瘍増殖抑制剤を含有する癌治療用医薬組成物。

本発明によれば、大腸癌細胞に対して増殖抑制効果を示す、腫瘍細胞増殖抑制剤および癌治療用医薬組成物を提供することができる。

マイクロRNA（miRNA）は、miRNA遺伝子から、まず数百から数千ヌクレオチドの長さの初期miRNAが転写され、次にマイクロプロセッサーと呼ばれるタンパク質複合体によって消化され、約60〜70ヌクレオチドのヘヤピン型前駆体miRNAとなり、その後、エクスポーチン5を介して核から細胞質内に移り、Dicerと呼ばれるリボヌクレアーゼIIIによって更に消化され、19〜24ヌクレオチドの成熟したmiRNA二量体となる。成熟したmiRNA二量体は、RNA干渉（RNAi）と関連のあるArgonauteタンパク質と共に複合体を形成し、機能すると考えられている。

本発明における配列表の配列番号1で示される塩基配列を有するマイクロＲＮＡ34a(miR-34a)は、成熟した一本鎖のmiRNAである。

miRNAの作用機序は、miRNAと一部（部分的に）相補的なメッセンジャーRNAとの部分的（不完全な）ハイブリダイゼーションと、それに伴う未知の翻訳抑制作用であると考えられている。本発明においては、miR-34aが、腫瘍細胞の増殖抑制にどのように係わっているかは不明である。

miR-34aは、相補的な塩基配列を有するＲＮＡとからなる二本鎖の前駆体であることもできる。二本鎖の前駆体は、細胞内で、熱力学的に不安定な端から二本鎖が解けて、成熟した一本鎖のmiRNAとなり、腫瘍細胞の増殖抑制効果を発揮する。

相補的な塩基配列を有するＲＮＡは、相補的な塩基配列を有するＲＮＡであること以外に、相補的な塩基配列を有するＲＮＡの一部の核酸が修飾されたＲＮＡであることもできる。そのような修飾をすることで、二本鎖の前駆体の安定性等を向上させることができる。修飾の例としては、例えば2-O（2-メトキシ）エチル−修飾を挙げることができる。

本発明の腫瘍増殖抑制剤は、miRNAを細胞内に移送するためのキャリアーを含むことができる。そのようなキャリアーとしては、siRNAを含む種々のRNA用のキャリアーを挙げることができ、例えば、アテロコラーゲンをキャリアーとして挙げることができる。

アテロコラーゲンは、酵素可溶化コラーゲンであり、コラーゲンをペプシン処理することでテロペプチド部分が分解されて得られるポリペプチドである。コラーゲンは、その種類、由来、型等特に制限はない。アテロコラーゲンに加えて、その修飾物も用いることができる。修飾物としては、側鎖アミノ基、カルボキシル基の化学修飾、あるいは化学的・物理的架橋物を用いることができる。また、由来として、ウシ、ブタ、ウマ、ヒト等の哺乳動物、鳥、魚類を由来とするいずれのコラーゲンも用いることが可能であるが、細胞が培養される温度で変化しない熱安定性を持つことが望ましい。具体的には、哺乳動物、鳥由来のコラーゲンが望ましく、若しくはそれらの遺伝子組み換えにより得られたコラーゲンが望ましい。コラーゲンの型については、特に制限はないが、入手の容易さよりＩ、ＩＩ，ＩＩＩ型などを使用することができる。

miR-34aとアテロコラーゲンとの質量混合比は複合体の長径が100nm前後である事等を考慮して適宜決定でき、例えば、１：９９〜９９：１の範囲であることができる。好ましくは１０：９０〜９０：１０、より好ましくは３０：７０〜７０：３０の範囲で混合することができる。

本発明の腫瘍増殖抑制剤は、特に、腫瘍細胞が大腸癌細胞である場合に有効である。但し、腫瘍細胞が大腸癌細胞以外である場合にも適用は可能であり、例えば、肺癌、肝臓癌、神経膠芽腫、骨髄腫、胃癌、膵臓癌、脳腫瘍、腎癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌及び白血病等が挙げられる。

本発明は、上記本発明の腫瘍増殖抑制剤を含有する癌治療用医薬組成物も包含する。

本発明に係る癌治療用医薬組成物においては、miR-34aの含量は、例えば、100〜500mg、より好ましくは300〜500mgであることが望ましい。さらに本発明に係るmiR-34aを有効成分として含有する癌治療用医薬組成物の投与量は、癌患者の病期、年齢、体重等により適宜調節することができ、例えば、100〜500mg、より好ましくは300〜500mgであることが望ましい。かかる投与量を1〜10回、より好ましくは5〜10回投与することが望ましい。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例1
miR-34aの遺伝子導入による細胞増殖への影響の検討
細胞としては、4種類の細胞株を用い、4種類ともヒト大腸がん細胞株である。HCT116とRKOはp53が正常な細胞株である。SW480はp53に変異が入っており、機能異常を伴う細胞株である。HCT116 p53-/-は、HCT116細胞のp53遺伝子のみを人工的に破壊した細胞株である。

24ウェルプレートに1ウェルあたり1×10⁴の細胞を蒔いて、24時間接着させた。24時間後に、5nMの濃度でmiR-34a前駆体（Ambion）あるいはネガティブコントロール（Ambion）をHiPerfect試薬（QIAGEN）にて遺伝子導入し、4日間細胞数をカウントした。結果を図1に示す。n=3で行い、グラフには平均±標準偏差で示す。尚、HCT116とRKOについては1nMの濃度でも、同様の細胞増殖抑制効果があることを確認した（n=1）。

4種類のヒト大腸がん細胞株の全てにおいて、miR-34aの遺伝子導入により細胞増殖が抑制された。

実施例2
アテロコラーゲンを併用したmiR-34aの遺伝子導入によるin vivo腫瘍増殖への影響の検討
HCT116とRKO細胞株を2.5×10⁷個/mlに調整したリン酸緩衝食塩水を、ヌードマウス（BALB/c-nu/nu、6週齢、メス）の左右背部に１箇所あたり細胞溶液200μl（5×10⁶個）を1細胞あたり6箇所ずつ（ヌードマウス3匹の左右背部）皮下移植した。移植後8日目で腫瘍体積が50-100mm³（腫瘍体積＝（長径）×（短径）²×0.5）になった時点で、アテロコラーゲンとPre-miR-34a複合体（背部左の腫瘍）、あるいはアテロコラーゲンとコントロール複合体（背部右の腫瘍）を200μl（アテロコラーゲン最終濃度0.5重量%、Pre-miRNA 15μg）、腫瘍周囲の皮下組織に注入した。投与後2日おきに14日目まで腫瘍長径と短径を計測して体積を算出し、投与開始日の各腫瘍体積を100%とした場合の増殖曲線のグラフを作成した。ヌードマウスの写真は投与後14日目（解剖直前）の写真である。(図2)

実施例3
miR-34aの遺伝子導入によるヒト大腸がん細胞株への細胞老化様の表現型の誘導の検討
p53正常のヒト大腸がん細胞株HCT116及びRKOと、p53変異をもつヒト大腸がん細胞株SW480について以下の検討を行った。

各細胞株を6ウェルプレートに１ウェルあたり1×10⁵個の細胞を蒔いて、24時間接着させた。24時間後に、5nMの濃度でmiR-34a前駆体（Ambion）あるいはネガティブコントロール（Ambion）をHiPerfect試薬（QIAGEN）にて遺伝子導入した。導入後4日目に各細胞を2% formaldehyde、0.2% glutaraldehyde含有中性リン酸緩衝食塩水にて10分間固定した。細胞老化関連ガラクトシダーゼ活性の有無を確認するために、1mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-bD-galactopyranoside含有染色液（pH6.0）にて、37℃、12時間インキュベーションを行い、細胞の染色の程度を確認した。

実験結果
miR-34aの遺伝子導入によるp53正常のヒト大腸がん細胞株HCT116とRKOへの細胞老化様の表現型の誘導
結果を図3に示す。HCT116とRKO細胞株において、miR-34aの遺伝子導入により形態学的に細胞老化に特徴的な核ならびに細胞の大きさの増大を観察した。さらに、HCT116細胞株において細胞老化関連ガラクトシダーゼ染色の陽性細胞の出現を観察した。

miR-34aの遺伝子導入によるp53変異をもつヒト大腸がん細胞株SW480への細胞老化様の表現型の誘導
結果を図4に示す。SW480細胞株において、miR-34aの遺伝子導入により形態学的に細胞老化に特徴的な核ならびに細胞の大きさの増大を観察した。さらに、細胞老化関連ガラクトシダーゼ染色の陽性細胞の出現を観察した。

本発明は、マイクロRNAによる細胞増殖抑制による癌治療の分野に有用である。

miR-34aの遺伝子導入による細胞増殖への影響の検討結果(実施例1)を示す。腫瘍の増殖曲線のグラフおよび投与後14日目（解剖直前）のマウスの写真(実施例2)を示す。 miR-34aの遺伝子導入によるp53正常ヒト大腸がん細胞株HCT116とRKOへの細胞老化様の表現型の誘導の検討結果（実施例3）を示す。 miR-34aの遺伝子導入によるp53変異ヒト大腸がん細胞株SW480への細胞老化様の表現型の誘導の検討結果（実施例3）を示す。

Claims

配列表の配列番号1で示される塩基配列を有するマイクロＲＮＡ34a(以下、miR-34aという)を有効成分として含有し、
キャリアーとして、アテロコラーゲンをさらに含有する腫瘍増殖抑制剤。
miR-34aとアテロコラーゲンとの質量混合比が１：９９〜９９：１の範囲である請求項１に記載の腫瘍増殖抑制剤。
腫瘍が大腸癌である請求項１又は２に記載の腫瘍増殖抑制剤。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の腫瘍増殖抑制剤を含有する癌治療用医薬組成物。