JP5683261B2 - 癌の予防乃至治療に好適な二本鎖核酸分子、癌細胞増殖抑制剤、並びに医薬 - Google Patents
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Description
また、膀胱癌は、前立腺癌と同じく増加傾向にあり、特に、女性に比べて男性において多く発症することが特徴として知られている。
従来、これらの泌尿器系のがんに対し、外科的に臓器を摘出する治療方法が行われている。前立腺癌に対しては、抗アンドロゲン製剤を投与する治療方法が行われている。しかしながら、臓器を摘出する治療方法では、患者のQOLが著しく低下してしまうことが問題となる。また、抗アンドロゲン製剤を用いた治療方法では、治療過程において耐性を獲得しやすいため、予後が非常に悪いことが問題となっている。
また、同じく泌尿器系のがんである腎癌も最近増加しているが、放射線治療や抗がん剤治療の奏功率が低い。一方、女性ホルモンであるエストロゲンが増悪因子として作用する乳癌や子宮癌も近年著しく増加しているが、治療薬に対して抵抗性を獲得して難治性となるものが多く存在している。さらに、肺癌、大腸癌、肝癌、皮膚癌も治療が困難で臨床上の大きな課題となり、同様の問題点を有している。
このような従来の治療方法における諸問題を克服するため、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の作用機序を解明し、その機構に根ざした、新たな分子標的の開発が望まれている。
前記非特許文献1では、癌細胞の免疫系からの回避に関与すると考えられているEBAG9遺伝子を標的としたsiRNA(siEBAG9C)が、マウス腎細胞癌Rencaの腫瘍形成を効果的に抑制できることが、本発明者らにより報告されている。
例えば、本発明者らは、前記siEBAG9Cが、腎細胞癌だけでなく、前立腺癌及び膀胱癌の癌細胞の増殖に対しても、抑制効果を有するかどうかを検証した。その結果、前記siEBAG9Cは、前立腺癌及び膀胱癌の癌細胞に対して若干の抑制効果を有するものの、充分な抑制効果を示すまでには至らないことを明らかとしている(実施例参照、後述)。
EBAG9遺伝子は、癌細胞の免疫系からの回避に関与すると考えられているが、膀胱癌において発現することは従来知られておらず、EBAG9遺伝子を標的とした前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の治療は従来行われていない。
本発明者らは、今回、APP遺伝子が、前立腺癌、膀胱癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌において発現していること、EBAG9遺伝子が、膀胱癌において発現していること、及び、APP遺伝子、及びEBAG9遺伝子の発現を効率よく、かつ特異的に抑制するsiRNAを新たに見出した。また、本発明者らは、これらのsiRNAを、前立腺癌細胞株(LNCaP)、膀胱癌細胞株(EJ)をヌードマウスに皮下移植した腫瘍増殖モデルにおいて形成された癌に投与することによって、それぞれの癌の増殖を著しく抑制することが可能となること、及び、これらのsiRNAを、肺癌細胞株(A549)、大腸癌細胞株(DLD−1)、肝癌細胞株(HepG2)、子宮癌株(Ishikawa細胞3H12 No.74)、乳癌細胞株(MCF−7)、メラノーマ細胞株(SK−MEL 28)、及び腎癌細胞株(VMRC−RCZ)に投与することによって、それぞれの細胞を著しく抑制することが可能となることを見出した(実施例参照、後述)。これらの結果は、APP遺伝子及びEBAG9遺伝子が、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の増殖に関わっており、これらの癌に対する新たな分子標的となり得ることを示すものである。
本発明者らが作製したsiRNAは、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌を予防乃至治療するための新たな医薬の有効成分として好適に利用可能であると考えられる。また、これらのsiRNAは、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌が発症乃至進展するメカニズムを解き明かし、これらの病態の更なる解明に役立つことも期待される。
<1> APP遺伝子及びEBAG9遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であって、
(a)配列番号:1〜配列番号:21のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、
(b)前記(a)のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖と、
を含むことを特徴とする二本鎖核酸分子である。
<2> センス鎖が、配列番号:1、配列番号:2、配列番号:15のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖である前記<1>に記載の二本鎖核酸分子である。
<3> センス鎖が、配列番号:2、及び、配列番号:15のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖である前記<2>に記載の二本鎖核酸分子である。
<4> 二本鎖RNA及び二本鎖RNA−DNAキメラの少なくともいずれかである前記<1>から<3>のいずれかに記載の二本鎖核酸分子である。
<5> 二本鎖RNAが、siRNAである前記<4>に記載の二本鎖核酸分子である。
<6> 前記<1>から<5>のいずれかに記載の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴とするDNAである。
<7> 前記<6>に記載のDNAを含むことを特徴とするベクターである。
<8> 前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制するための癌細胞増殖抑制剤であって、前記<1>から<5>のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、前記<6>に記載のDNA、及び、前記<7>に記載のベクターの少なくともいずれかを含むことを特徴とする癌細胞増殖抑制剤である。
<9> 前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制するための方法であって、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかに、前記<1>から<5>のいずれかに記載の二本鎖核酸分子、前記<6>に記載のDNA、及び、前記<7>に記載のベクターの少なくともいずれかを作用させることを特徴とする方法である。
<10> 前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかを予防乃至治療するための医薬であって、前記<8>に記載の癌細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする医薬である。
<11> 前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかを予防乃至治療するための方法であって、個体に、前記<8>に記載の癌細胞増殖抑制剤を投与することを特徴とする方法である。
本発明の二本鎖核酸分子は、APP遺伝子及びEBAG9遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための二本鎖核酸分子であり、(a)配列番号:1〜配列番号:21のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、(b)前記(a)のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含むことを特徴とする。
なお、本発明において「二本鎖核酸分子」とは、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とがハイブリダイズしてなる二本鎖の核酸分子をいう。
前記したように、前記APP遺伝子は、アルツハイマー病患者の脳に蓄積するアミロイド前駆体タンパク質をコードする遺伝子として知られている。前記EBAG9遺伝子は、癌細胞の免疫系からの回避に関与すると考えられている遺伝子である。前記APP遺伝子及び前記EBAG9遺伝子の塩基配列は、例えば、ヒト、マウス、チンパンジー、イヌ、ラットなどにおいて公知であり、その配列はGenBank(NCBI)などの公共データベースを通じて容易に入手することができる(例えば、ヒトAPP遺伝子:NCBI accession number NM_000484.2(Variant1)、NM_201413.1(Variant2)、NM_201414.1(Variant3)、ヒトEBAG9遺伝子:NCBI accession number NM_004215.3(Variant1)、NM_198120.1(Variant2))。
本発明において、前記APP遺伝子、前記EBAG9遺伝子は、そのmRNA配列が前記二本鎖核酸分子の標的となり、前記二本鎖核酸分子によってその発現が抑制されることから、本明細書中において前記APP遺伝子、前記EBAG9遺伝子を、前記二本鎖核酸分子の「標的遺伝子」と称することがある。
なお、参考として、ヒトの前記APP遺伝子配列を配列番号:24に、ヒトの前記EBAG9遺伝子配列を配列番号:25に示す。
前記したように、本発明者らは、鋭意検討の結果、前記APP遺伝子、前記EBAG9遺伝子のmRNA配列の中でも、ある特定の標的配列(配列番号:1〜配列番号:21)に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子が、前記APP遺伝子、前記EBAG9遺伝子に対して顕著に優れた発現抑制効果を有することを見出した。したがって、本発明の二本鎖核酸分子は、(a)配列番号:1〜配列番号:21のいずれかの標的配列に対応するヌクレオチド配列を有するセンス鎖と、(b)前記(a)のセンス鎖に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖とを含むものである。
ここで、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、RNA鎖であってもよいし、RNA−DNAキメラ鎖であってもよい。前記センス鎖と前記アンチセンス鎖とは、互いにハイブリダイズすることで前記二本鎖核酸分子を形成することができる。
なお、前記配列番号:1〜配列番号:21のうち、配列番号:1〜配列番号:14はヒトAPP遺伝子配列(配列番号:24)の一部であり、配列番号:15〜配列番号:21はヒトEBAG9遺伝子配列(配列番号:25)の一部である。
前記センス鎖が、前記好ましいセンス鎖以外のセンス鎖であると、前記二本鎖核酸分子の前記標的遺伝子に対する発現抑制効果が弱くなる場合がある。一方で、前記センス鎖が、前記特に好ましいセンス鎖であると、前記二本鎖核酸分子の使用量が少量であっても、前記標的遺伝子に対する強い発現抑制効果が得られる点で、有利である。
前記二本鎖核酸分子の種類としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、二本鎖RNA(double−stranded RNA:dsRNA)、二本鎖RNA−DNAキメラなどが挙げられるが、中でも、二本鎖RNAが好ましい。
ここで、「二本鎖RNA」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがRNA配列で構成されてなる二本鎖核酸分子をいい、「二本鎖RNA−DNAキメラ」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖のいずれもがRNAとDNAとのキメラ配列で構成されてなる二本鎖核酸分子をいう。
前記siRNAは、前記したようなセンス鎖及びアンチセンス鎖を有し、かつ前記標的遺伝子の発現を抑制し得るものであれば、その末端構造に特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記siRNAは、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端(オーバーハング)を有するものであってもよい。中でも、前記siRNAは、各鎖の3’末端が2〜6塩基突出した構造を有することが好ましく、各鎖の3’末端が2塩基突出した構造を有することがより好ましい。
前記shRNAの末端構造としても、前記siRNA同様、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平滑末端を有するものであってもよいし、突出末端(オーバーハング)を有するものであってもよい。
また、前記二本鎖核酸分子は、目的に応じて、適宜修飾を有していてもよい。例えば、核酸分解酵素(ヌクレアーゼ)に対する耐性を付与し、培養液中や生体中における安定性を向上させる等の目的から、前記二本鎖核酸分子に、2’O−methyl化修飾や、ホスホロチオエート化(S化)修飾、LNA(Locked Nucleic Acid)修飾等を施すことができる。また、例えば、細胞への導入効率を高める等の目的から、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖の5’端、或いは3’端に、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともできる。なお、前記二本鎖核酸分子にこのような修飾を施す方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。
前記二本鎖核酸分子の入手方法としては、特に制限はなく、それぞれ従来公知の手法に基づき作製することができる。
例えば、前記siRNAは、所望のセンス鎖とアンチセンス鎖とに相当する18〜29塩基長の一本鎖RNAを、それぞれ既存のDNA/RNA自動合成装置等を利用して化学的に合成し、それらをアニーリングすることにより作製することができる。また、アニーリング済の二本鎖siRNAの市販品を入手することもできるし、siRNA合成受託会社に合成を依頼することにより入手することもできる。また、後述する本発明のベクターのような、所望のsiRNA発現ベクターを構築し、前記発現ベクターを細胞内に導入することにより、細胞内の反応を利用してsiRNAを作製することもできる。
本発明のDNAは、前記した本発明の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むDNAであり、また、本発明のベクターは、前記DNAを含むベクターである。
前記DNAとしては、前記した本発明の二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むDNAであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、中でも、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列の上流(5’側)に、前記二本鎖核酸分子の転写を制御するためのプロモーター配列が連結されていることが好ましい。前記プロモーター配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、CMVプロモーター等のpol II系プロモーター、H1プロモーター、U6プロモーター等のpol III系プロモーターなどが挙げられる。また、更に、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列の下流(3’側)に、前記二本鎖核酸分子の転写を終結させるためのターミネーター配列が連結されていることがより好ましい。前記ターミネーター配列としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記プロモーター配列、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列、及び前記ターミネーター配列を含む転写ユニットは、前記DNAにおける好ましい一態様である。なお、前記転写ユニットは、従来公知の手法を用いて構築することができる。
前記ベクターは、前記DNAを含むものであれば特に制限はなく、その種類としては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。また、前記ベクターは、前記二本鎖核酸分子を発現可能な発現ベクターであることが好ましい。前記二本鎖核酸分子の発現様式としては、特に制限はなく、例えばsiRNAを発現させる方法として、短い一本鎖RNAを二本発現させる方法(タンデム型)や、shRNAとしての一本鎖RNAを発現させる方法(ヘアピン型)等を選択することができる。
前記タンデム型siRNA発現ベクターは、前記siRNAを構成するセンス鎖をコードするDNA配列と、アンチセンス鎖をコードするDNA配列とを含み、かつ、各鎖をコードするDNA配列の上流(5’側)にプロモーター配列がそれぞれ連結され、また、各鎖をコードするDNA配列の下流(3’側)にターミネーター配列がそれぞれ連結されたDNAを含む。
また、前記ヘアピン型siRNA発現ベクターは、前記siRNAを構成するセンス鎖をコードするDNA配列と、アンチセンス鎖をコードするDNA配列とが逆向きに配置され、前記センス鎖DNA配列とアンチセンス鎖DNA配列とがループ配列を介して接続されており、かつ、それらの上流(5’側)にプロモーター配列が、また、下流(3’側)にターミネーター配列が連結されたDNAを含む。
前記各ベクターは、従来公知の手法を用いて構築することができ、例えば、前記DNAを、予め制限酵素で切断したベクターの切断部位に連結(ライゲーション)することにより構築することができる。
本発明の癌細胞増殖抑制剤は、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制するための癌細胞増殖抑制剤(腫瘍増殖抑制剤)であり、前記した本発明の二本鎖核酸分子、DNA、及びベクターの少なくともいずれかを含んでなり、更に必要に応じてその他の成分を含んでなる。
前記二本鎖核酸分子の詳細としては、前記した本発明の二本鎖核酸分子の項目に記載した通りである。前記二本鎖核酸分子は、標的とするAPP遺伝子及びEBAG9遺伝子の少なくともいずれかの発現を効果的に抑制することができるので、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制するための前記癌細胞増殖抑制剤の有効成分として好適である。また、前記DNA、ベクターの詳細としても、前記した本発明のDNA、ベクターの項目に記載した通りである。
前記癌細胞増殖抑制剤中の前記二本鎖核酸分子、DNA、及びベクターの少なくともいずれかの含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記癌細胞増殖抑制剤としては、前記二本鎖核酸分子、DNA、及びベクターの少なくともいずれかそのものであってもよい。
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記二本鎖核酸分子、DNA、及びベクターの少なくともいずれかを所望の濃度に希釈するための生理食塩水、培養液等の希釈用剤や、対象とする細胞内に前記二本鎖核酸分子、DNA、及びベクターの少なくともいずれかを導入(トランスフェクト)するためのトランスフェクション試薬などが挙げられる。
前記癌細胞増殖抑制剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記癌細胞増殖抑制剤の適用対象となる細胞は、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかであり、これらの癌細胞は、体外で培養されている細胞であってもよいし、また、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、腎癌を患う患者の体内に存在する細胞であってもよい。
前記体外で培養されている前立腺癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、LNCaP細胞(Adenocarcinoma由来)、PC−3細胞(adenocarcinoma由来)、DU145細胞(carcinoma由来)などが挙げられる。
前記体外で培養されている膀胱癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、EJ細胞(carcinoma由来)、T24細胞(transitional cell carcinoma由来)、J82細胞(transitional cell carcinoma由来)などが挙げられる。
前記体外で培養されている肺癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、A549細胞(non−small cell lung cancer由来)、Lu−141細胞(Small cell carcinoma由来)、PC−14細胞(adenocarcinoma由来)などが挙げられる。
前記体外で培養されている大腸癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、DLD−1(colorectal adenocarcinoma由来)、BM314細胞(carcinoma由来)、CACO−2(colorectal adenocarcinoma由来)などが挙げられる。
前記体外で培養されている肝癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、HepG2細胞(hepatocellular carcinoma由来)、Hep3B細胞(hepatocellular carcinoma由来)、HuH−7細胞(hepatoma由来)などが挙げられる。
前記体外で培養されている子宮癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ishikawa細胞3H12 No.74(ヒト子宮内膜癌由来)、HEC−1細胞(adenocarcinoma由来)、JHUEM−3細胞(Endometrioid adenocarcinoma由来)などが挙げられる。
前記体外で培養されている乳癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、MCF−7細胞(adenocarcinoma由来)、ZR−75細胞(ductal carcinoma由来)、MDA−MB−231細胞(adenocarcinoma由来)などが挙げられる。
前記体外で培養されている皮膚癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、SK−MEL 28細胞(melanoma由来)、COLO 679細胞(melanoma由来)、C32細胞(melanoma由来)などが挙げられる。
前記体外で培養されている腎癌細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、VMRC−RCZ細胞(carcinoma由来)、KMRC−1細胞(Clear cell renal carcinoma由来)、Caki−2細胞(clear cell carcinoma由来)などが挙げられる。
これらの細胞は、例えば、ATCC(American Type Culture Collection)より入手することができる。
前記癌細胞増殖抑制剤は、例えば、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかに導入(トランスフェクト)することによって、前記細胞に作用させることができる。前記導入の方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法の中から目的に応じて適宜選択することができ、例えば、トランスフェクション試薬を用いる方法、エレクトロポレーションによる方法、磁気粒子を用いる方法、ウイルス感染を利用する方法などが挙げられる。
前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかに対して作用させる前記癌細胞増殖抑制剤の量としても、特に制限はなく、細胞の種類や所望の効果の程度等に応じて適宜選択することができるが、例えば、1x106個の細胞数に対し、有効成分(二本鎖核酸分子)の量として、0.1μg程度が好ましく、5μg程度がより好ましく、15μg程度が特に好ましい。
前記癌細胞増殖抑制剤は、前記二本鎖核酸分子、DNA、及びベクターの少なくともいずれかを含むので、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかに作用させることにより、APP遺伝子及びEBAG9遺伝子の少なくともいずれかの発現抑制を介して、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の増殖を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は、前記二本鎖核酸分子、DNA、及びベクターの少なくともいずれかを前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかに作用させることを特徴とする、癌細胞の増殖抑制方法(腫瘍増殖抑制方法)にも関する。
本発明の医薬は、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかを予防乃至治療するための医薬であり、前記した本発明の癌細胞増殖抑制剤を含み、更に必要に応じてその他の成分を含んでなる。
前記癌細胞増殖抑制剤の詳細としては、前記した本発明の癌細胞増殖抑制剤の項目に記載した通りである。前記癌細胞増殖抑制剤は、前記した本発明の二本鎖核酸分子、DNA、及びベクターの少なくともいずれかを含むので、標的とするAPP遺伝子及びEBAG9遺伝子の少なくともいずれかの発現抑制を介して、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかの増殖を効果的に抑制することができる。即ち、前記癌細胞増殖抑制剤は、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかを予防乃至治療するための医薬として好適に利用可能である。
前記医薬中の前記癌細胞増殖抑制剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬としては、前記癌細胞増殖抑制剤そのものであってもよい。
例えば、前記二本鎖核酸分子は、生体内における二本鎖核酸分子の安定性を高めることができる点で、修飾が施されていることが好ましい。前記二本鎖核酸分子に施し得る修飾の種類としては、特に制限はなく、例えば、2’O−methyl化修飾、ホスホロチオエート化(S化)修飾、LNA(Locked Nucleic Acid)修飾などが挙げられる。また、標的細胞への導入効率を高める等の目的から、例えば、前記二本鎖核酸分子のセンス鎖の5’端、或いは3’端に、ナノ粒子、コレステロール、細胞膜通過ペプチド等の修飾を施すこともまた好ましい。前記二本鎖核酸分子に前記修飾を施す方法としては、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。
また、前記二本鎖核酸分子は、標的細胞への導入効率を高めることができる点で、リポソームや高分子マトリックス等と複合体を形成していることも好ましい。前記複合体を形成する方法としても、特に制限はなく、従来公知の手法を適宜利用することができる。
前記その他の成分としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。前記担体としても、特に制限はなく、例えば、剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記医薬中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記医薬の剤型としては、特に制限はなく、例えば、後述するような所望の投与方法に応じて適宜選択することができ、例えば、経口固形剤(錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等)、経口液剤(内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等)、注射剤(溶液、懸濁液、用事溶解用固形剤等)、軟膏剤、貼付剤、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散剤などが挙げられる。
前記賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸などが挙げられる。前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖などが挙げられる。前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄などが挙げられる。前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸などが挙げられる。前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、トラガント、アラビアゴム、ゼラチンなどが挙げられる。
前記pH調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、EDTA、チオグリコール酸、チオ乳酸などが挙げられる。前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖などが挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカインなどが挙げられる。
前記基剤としては、例えば、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィンなどが挙げられる。前記保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピルなどが挙げられる。
前記医薬は、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかの予防乃至治療に好適である。したがって、前記医薬は、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかに罹患した患者に投与することにより好適に使用することができる。
また、前記医薬の投与回数としても、特に制限はなく、投与対象である患者の年齢、体重、所望の効果の程度等に応じて、適宜選択することができる。
前記医薬は、前記癌細胞増殖抑制剤を含むので、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかを患う個体に投与することにより、APP遺伝子及びEBAG9遺伝子の少なくともいずれかの発現抑制を介して、前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、腎癌細胞の増殖を効果的に抑制し、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかを予防乃至治療することができる。したがって、本発明は、個体に前記癌細胞増殖抑制剤を投与することを特徴とする、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかに対する予防乃至治療方法にも関する。
APP遺伝子及びEBAG9遺伝子の少なくともいずれかの発現を抑制するための本発明の二本鎖核酸分子(siRNA)を、以下のようにして準備した。
APP遺伝子に対するsiRNA(siAPP−A,siAPP−B)と、EBAG9遺伝子に対するsiRNA(siEBAG9NEW−1)は、それぞれのsiRNAのターゲットとする遺伝子配列(以下に記載)とその相補的な配列を、3’末端が2塩基オーバーハングするようなRNAの二本鎖として合成した(RNAi社)。また、EBAG9遺伝子に対するsiRNA(siEBAG9C)は、siRNAのターゲットとする遺伝子配列(以下に記載)とその相補的な配列からなるRNAの二本鎖であり、3’末端に2塩基のオーバーハングを有するもので、Dharmacon社より購入した。前記siEBAG9Cについては、本発明者らにより既に報告されている(Ogushi T,Takahashi S,Takeuchi T,Urano T,Horie−Inoue K,Kumagai J,Kitamura T,Ouchi Y,Muramatsu M,Inoue S:Estrogen receptor−binding fragment−associated antigen 9 is a tumor−promoting and prognostic factor for renal cell carcinoma.Cancer Res.65:3700−3706,2005.)。
また、ネガティブコントロールとして使用したsiRNA(siControl)は、RNAi社にて合成した。
siAPP−A: 5’−GAUCCAUCAGGGACCAAAACC−3’(配列番号:1)
siAPP−B: 5’−GUUCCUGACAAGUGCAAAUUC−3’(配列番号:2)
siEBAG9NEW−1: 5’−CUCAUUCCUAAAGAGAUUAAU−3’(配列番号:15)
siEBAG9C: 5’−AAGAAGAUGCAGCCUGGCAAG−3’(配列番号:22)
siControl: 5’−GUACCGCACGUCAUUCGUAUC−3’(配列番号:23)
前記実施例1で得られた各siRNAを、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、腎癌由来の培養細胞にトランスフェクションし、48時間後に蛋白質サンプルを回収してウエスタンブロット解析を行うことにより、各siRNAの、各培養細胞におけるAPP遺伝子及びEBAG9遺伝子発現に対する抑制効果(ノックダウン効果)を検討した。実験方法の詳細を以下に示す。
前記細胞として、以下の細胞を使用した。
前立腺癌細胞 ・・・ ヒト前立腺癌由来LNCaP細胞(入手元:ATCC(American Type Culture Collection)、No.CRL−1740)
膀胱癌細胞 ・・・ ヒト膀胱癌由来EJ細胞(入手元:JCRB細胞バンク、No.JCRB0710)
肺癌細胞 ・・・ A549細胞(入手元:JCRB細胞バンク、No.JCRB0076)
大腸癌細胞 ・・・ DLD−1細胞(入手元:JCRB細胞バンク、No.JCRB9094)
肝癌細胞 ・・・ HepG2細胞(入手元:ATCC(American Type Culture Collection)、No.HB−8065)
乳癌細胞 ・・・ MCF−7細胞(入手元:ATCC(American Type Culture Collection)、No.HTB−22)
皮膚癌細胞(メラノーマ細胞) ・・・ SK−MEL 28細胞(入手元:RCB細胞バンク、No.RCB1930)
腎癌細胞 ・・・ VMRC−RCZ細胞(入手元:JCRB細胞バンク、No.JCRB0827)
子宮癌細胞 ・・・ ヒト子宮内膜癌由来Ishikawa細胞3H12 No.74(国立霞ヶ浦病院 西田正人氏より供与いただいた。)
LNCaP細胞は、10% fetal calf serum(Sigma)、100units/ml penicillin(Invitrogen)、100μg/ml streptmysin(Invitrogen)を含むRPMI1640(ナカライテスク)で、5%CO2、37℃にて培養した。
EJ細胞、A549細胞、DLD−1細胞、HepG2細胞、MCF−7細胞、SK−MEL 28細胞、VMRC−RCZ細胞、及びヒト子宮内膜癌由来Ishikawa細胞3H12 No.74は、10% fetal calf serum(Sigma)、100units/ml penicillin(Invitrogen)、100μg/ml streptmysin(Invitrogen)を含むDulbaco’s modified Eagle’s medium(DMEM)(Sigma)で、5%CO2、37℃にて培養した。
6穴プレートに、コンフルエントの30〜50%の細胞密度となるように各細胞をまき、その翌日に、Lipofectoamine2000(Invitrogen)を用いて、添付されるプロトコールに従ってsiRNAをトランスフェクションした。導入したsiRNAの量は、siAPP−A及びsiAPP−Bは培地中に50nM、又は200nMとなるように調整した。siEBAG9NEW−1及びsiEBAG9Cは、培地中に0.5nM、5nM、50nM、又は200nMとなるように調整した。
siRNA添加48時間後に、4×Sample Buffer(100mM Tris−HCl pH6.5、20% Glycerol、4% SDS、4% 2−Mercaptoethanol)にて細胞を回収し、100℃で15分間ボイルした。得られたサンプルのOD280nmを測定し、BSAの検量線を用いて蛋白質濃度を算出した。
タンパク質の質量を同一にしたサンプルをSDS−PAGEゲルにて泳動後、Immobilon−P(Millipore)へブロッティングした。蛋白質の検出は、1次抗体として、APP抗体(Cell Signaling Technology社製)或いはEBAG9抗体を、2次抗体として、horseradish peroxidase(HRP)−conjugated anti−rabbit IgG抗体(Amersham Biosciences)を用い、ECL detection system(Amersham Pharmacia Biotech)により行った。前記EBAG9抗体としては、本発明者により作製された抗体を用いた(Tsuchiya F,Ikeda K,Tsutsumi O,Hiroi H,Momoeda M,Taketani Y,Muramatsu M,Inoue S.Molecular cloning and characterization of mouse EBAG9,homolog of a human cancer associated surface antigen:expression and regulation by estrogen.Biochem Biophys Res Commun. 2001;284(1):2−10.)
その後、Stripping Buffer(62.5mM Tris−HCl pH6.7、2% SDS、100mM 2−Mercaptoethanol)にて抗体を除去後、ローディングコントロールとして、一次抗体β−actin(SIGMA)、二次抗体HRP−conjugated anti−mouse IgG(Amersham Biosciences)を用いて検出した。
本実施例2の結果を、図1〜図3B、及び図8A〜図14Bに示す。
APPの蛋白質発現については、LNCaP細胞では、siAPP−A及びsiAPP−Bにおいて共に高いノックダウン効果が認められた(図1)。特に、siAPP−Bにおいて、ノックダウン効果は高く、APPの発現を示すバンドは完全に消失した。
EJ細胞においても、siAPP−Bにおいて高いノックダウン効果が認められた(図2)。また、siAPP−Aにおいても、高いノックダウン効果が認められた(図示せず)。
また、A549細胞、DLD−1細胞、HepG2細胞、Ishikawa細胞3H12 No.74、MCF−7細胞、SK−MEL 28細胞、VMRC−RCZ細胞においても、siAPP−Bにおいてノックダウン効果が認められた(図8A、図9A、図10A、図11A、図12A、図13A、図14A)。
更に、それぞれのsiRNAを0.5nM、5nM、50nMの濃度でトランスフェクションしたサンプルにおいて、EBAG9の発現量を定量化し、検量線を用いて解析したところ、EBAG9の発現量を50%に抑制するsiRNAの濃度は、siEBAG9NEW−1で1.3nMであったが、siEBAG9Cは9.4nMであり、約10倍の差が認められた(図3B)。したがって、EBAG9のノックダウン効果は、siEBAG9NEW−1の方が、siEBAG9Cより、顕著に優れていることが明らかとなった。
また、A549細胞、DLD−1細胞、HepG2細胞、Ishikawa細胞3H12 No.74、MCF−7細胞、SK−MEL 28細胞、VMRC−RCZ細胞においても、siBAG9NEW−1においてノックダウン効果が認められた(図8B、図9B、図10B、図11B、図12B、図13B、図14B)。
また、EBAG9に対するsiRNAは、in vivoにおける腎癌の腫瘍形成を抑制することが報告されており(Ogushi T, Takahashi S, Takeuchi T, Urano T, Horie−Inoue K, Kumagai J, Kitamura T, Ouchi Y, Muramatsu M, Inoue S: Estrogen receptor−binding fragment−associated antigen 9 is a tumor−promoting and prognostic factor for renal cell carcinoma. Cancer Res. 65:3700−3706, 2005.)、EBAG9のノックダウン効果がsiEBAG9Cより顕著に優れているsiEBAG9NEW−1は、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、腎癌においても、腫瘍の増殖を抑制することが示唆された。
前記実施例1で得られた各siRNAについて、ヌードマウスの皮下に移植した腫瘍細胞に対する増殖抑制効果を検討した。実験方法の詳細を以下に示す。なお、細胞培養は、前記実施例2と同様の手法により行った。
−APP遺伝子の発現抑制を介した腫瘍増殖抑制実験−
5週齢、オスのヌードマウスBALB/cA Jcl−nu(日本クレア)を各群10匹ずつ用意し、皮下に腫瘍細胞を移植した。移植する細胞は、LNCaP細胞(3×106cells/匹)若しくはEJ細胞(3×106cells/匹)と、Matrigel(BD Biosciences)とを混合し、合計150μl/匹となるように調整した。
移植後1週目から週2回、siAPP−B若しくはsiControlを皮下の腫瘍に直接注入した。注入するsiRNA 5μg/匹に、GeneSilencer Reagent(Gene Therapy Systems,Inc.)4μl/匹、及び、phenol red free DMEMを混合し、total 50μl/匹に調整した。
移植から7.5週後までの間、腫瘍径を週2回計測し、腫瘍体積を〔0.5×長径(mm)×短径(mm)×短径(mm)〕の式により算出した。結果を図4及び図5に示す。
5週齢、オスのヌードマウスBALB/ cA Jcl−nu(日本クレア)を各群4匹ずつ用意し、皮下に腫瘍細胞を移植した。移植する細胞は、EJ細胞(5×106cells/匹)と、Matrigel(BD Biosciences)とを混合し、合計100μl/匹となるように調整した。移植後から腫瘍径を週2回計測し、腫瘍体積を〔0.5×長径(mm)×短径(mm)×短径(mm)〕の式により算出した。腫瘍体積が200mm3に達した時点から週2回、siEBAG9NEW−1若しくはsiControlを、皮下の腫瘍に直接注入した。注入するsiRNA 10μg/匹に、Lipofectamine2000 2μl/匹、及び、RPMI 100μl/匹を混合し、投与した。siRNAを投与してから4週後までの間、腫瘍径を週2回計測し、腫瘍体積を〔0.5×長径(mm)×短径(mm)×短径(mm)〕の式により算出した。結果を図6及び図7及びに示す。
LNCaP細胞においては、siControl群では、腫瘍体積は指数関数的な増加を示したのに対し、siAPP−B群では、腫瘍体積は著しく小さくなり、移植後8週での腫瘍体積は、siControl群の体積のおよそ六分の一ほどにまで抑制された(図4)。また、siEBAG9NEW−1群では、腫瘍体積は減少し、移植後6週での腫瘍体積は、siControl群の体積のおよそ二分の一ほどにまで抑制された(図6)。
EJ細胞においては、siControl群では、腫瘍体積は指数関数的な増加を示したのに対し、siAPP−B群では、腫瘍体積は著しく小さくなり、移植後5週での腫瘍体積は、siControl群の体積のおよそ三分の一ほどにまで抑制された(図5)。また、siEBAG9NEW−1群では、腫瘍体積は減少し、移植後4週での腫瘍体積は、siControl群の体積のおよそ二分の一以下にまで抑制された(図7)。
A549細胞、DLD−1細胞、HepG2細胞、Ishikawa細胞3H12 No.74、MCF−7細胞、SK−MEL 28細胞、VMRC−RCZ細胞に、前記実施例1で得られたsiAPP−B、又はsiControlをトランスフェクションし、その後の細胞増殖速度を測定することにより、siAPP−Bの、各培養細胞における細胞増殖抑制効果を検討した。実験方法の詳細を以下に示す。
Opti−MEN(Gibco)250μl/穴と、Lipofectamine2000(Invitrogen)10μl/穴を混合し、5分間、37℃でインキュベートした。前記インキュベートした溶液を、Opti−MEN 250μl/穴とsiRNA(最終濃度200nM)との混合液に加え、さらに37℃で20分間インキュベートした後、24穴プレートに添加した。
siRNA添加1日後、及び2日後に、生細胞数測定試薬SF(Cell Count Reagent SF、ナカライテスク)を用いて呈色反応を行い、吸光度(450nm)を測定して細胞数を定量化した。
なお、細胞培養は、前記実施例2と同様の手法により行った。
本実施例4の結果を図15〜図21に示す。
図15〜図21に示されるように、A549細胞、DLD−1細胞、HepG2細胞、Ishikawa細胞3H12 No.74、MCF−7細胞、SK−MEL 28細胞、VMRC−RCZ細胞のいずれの細胞においても、siAPP−Bをトランスフェクションしたことにより、有意に細胞の増殖が抑制された。そのため、siAPP−Bは、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、腎癌においても、腫瘍の増殖を抑制すると考えられた。
更に、これらの二本鎖核酸分子は、in vivoにおいても高い腫瘍増殖抑制効果を有することが示されたことから、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌を予防乃至治療するための医薬の有効成分として好適に利用可能であると考えられる。
Claims (4)
- 前立腺癌細胞、及び膀胱癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制するための癌細胞増殖抑制剤であって、
EBAG9遺伝子の発現を抑制するための二本鎖核酸分子、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むDNA、及び前記DNAを含むベクターの少なくともいずれかを含み、
前記二本鎖核酸分子が、
(a)配列番号:15の標的配列に対応するヌクレオチド配列からなる21塩基長のセンス鎖と、
(b)前記(a)のセンス鎖と二本鎖を形成する、該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む21塩基長のアンチセンス鎖とからなるsiRNAであることを特徴とする癌細胞増殖抑制剤。 - 前立腺癌細胞、膀胱癌細胞、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、子宮癌細胞、乳癌細胞、皮膚癌細胞、及び腎癌細胞の少なくともいずれかの増殖を抑制するための癌細胞増殖抑制剤であって、
APP遺伝子の発現を抑制するための二本鎖核酸分子、前記二本鎖核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含むDNA、及び前記DNAを含むベクターの少なくともいずれかを含み、
前記二本鎖核酸分子が、
(a)配列番号:2の標的配列に対応するヌクレオチド配列からなる21塩基長のセンス鎖と、
(b)前記(a)のセンス鎖と二本鎖を形成する、該センス鎖に相補的なヌクレオチド配列を含む21塩基長のアンチセンス鎖とからなるsiRNAであることを特徴とする癌細胞増殖抑制剤。 - 前立腺癌、及び膀胱癌の少なくともいずれかを予防乃至治療するための医薬であって、請求項1に記載の癌細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする医薬。
- 前立腺癌、膀胱癌、肺癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、乳癌、皮膚癌、及び腎癌の少なくともいずれかを予防乃至治療するための医薬であって、請求項2に記載の癌細胞増殖抑制剤を含むことを特徴とする医薬。
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