JP2010222338A - 核酸移送担体 - Google Patents
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Abstract
【課題】 より毒性の低い、局所投与および全身投与可能で、核酸医薬品の治療患部への到達効率と導入効率を高める臨床応用可能な核酸移送担体を提供する。
【解決手段】 ペプチド界面活性剤を含む核酸移送担体
【選択図】図１
【解決手段】 ペプチド界面活性剤を含む核酸移送担体
【選択図】図１
Description
本発明は、ペプチド界面活性剤を含む核酸の移送担体に関する。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、短い２本鎖ＲＮＡによって特定遺伝子の発現が抑制される現象で、疾患の治療への応用が期待されている。現在の技術では、ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）やｍｉｃｒｏ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を核酸医薬として用いる際の移送担体は、カチオン性のリン脂質が主体であるが、その毒性が指摘されている。また、アテロコラーゲンを移送担体に用いる研究も行われているが、その治療効果の向上にはさらなる改善が必要である。
ｓｉＲＮＡをはじめとする核酸医薬の臨床における応用を考慮すると、核酸医薬品の患部への移送担体は、限りなく毒性が低いことが望まれ、また同時に患部までの到達効率や標的遺伝子の抑制効率が高く、かつ全身投与可能な担体の開発が待たれている。
本発明のペプチド界面活性剤は、Ｇタンパク質結合レセプターウシロドプシンなどの膜タンパク質を安定させる作用やセルフアセンブリングする性質を有することが知られている（非特許文献１及び２）。しかし、核酸の移送担体としての用途はこれまで知られていなかった。
Ｘ Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．１０３，Ｎｏ．４７，１７７０７−１７７１２
Ａ Ｎａｇａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｎｏｓｃｉ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．７，１−７
本発明が解決しようとする課題は、より毒性の低く、患部への到達効率と標的遺伝子の抑制効率が高い臨床応用可能な核酸移送担体を提供することである。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、ペプチド界面活性剤が核酸の移送担体として有用であることを見出し、本発明を完成させた。
したがって、本発明は、下記のとおりである。
［１］ペプチド界面活性剤を含む核酸の移送担体。
［２］ペプチド界面活性剤が、４〜１０の親水性アミノ酸からなる頭部及び１又は２の疎水性アミノ酸からなる尾部からなる、［１］に記載の核酸の移送担体。
［３］核酸の移送担体が、ＡＡＡＡＡＡＤ又はＡＡＡＡＡＡＫである、［１］に記載の核酸の移送担体。
［４］上記［１］−［３］のいずれか１に記載の核酸の移送担体及び核酸を含む、局所投与又は全身投与用医薬品。
［１］ペプチド界面活性剤を含む核酸の移送担体。
［２］ペプチド界面活性剤が、４〜１０の親水性アミノ酸からなる頭部及び１又は２の疎水性アミノ酸からなる尾部からなる、［１］に記載の核酸の移送担体。
［３］核酸の移送担体が、ＡＡＡＡＡＡＤ又はＡＡＡＡＡＡＫである、［１］に記載の核酸の移送担体。
［４］上記［１］−［３］のいずれか１に記載の核酸の移送担体及び核酸を含む、局所投与又は全身投与用医薬品。
本発明の核酸移送担体は、より毒性が低く、局所投与及び全身投与が可能であり、核酸医薬品の治療患部への到達効率と導入効率を高めることができるという効果を有する。
本発明において、ペプチド界面活性剤とは、６〜１０個のアミノ酸残基を含むものであり、その長さは、約２〜３ｎｍであり、従来の界面活性剤、たとえば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＭ）やオクチル−Ｄ−グルコシド（ＯＧ）と同様の特性を示す。
本発明のペプチド界面活性剤は、好ましくは、４〜１０の親水性アミノ酸からなる頭部及び１又は２の疎水性アミノ酸からなる尾部からなる。
より具体的には、ＧＧＧＧＤＤ（Ｇ４Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＤ（Ｇ６Ｄ）、ＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ６Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＤ（Ｇ８Ｄ）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ８Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＤ（Ｇ１０Ｄ）、ＧＧＧＧＫＫ（Ｇ４Ｋ２）、ＧＧＧＧＧＧＫ（Ｇ６Ｋ）、ＧＧＧＧＧＧＫＫ（Ｇ６Ｋ２）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＫ（Ｇ８Ｋ）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＫＫ（Ｇ８Ｋ２）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＫ（Ｇ１０Ｋ）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＫＫ（Ｇ１０Ｋ２）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ１０Ｄ２）、ＡＡＡＡＤＤ（Ａ４Ｄ２）、ＡＡＡＡＡＡＤ（Ａ６Ｄ）、ＡＡＡＡＡＡＤＤ（Ａ６Ｄ２）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＤ（Ａ８Ｄ）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＤＤ（Ａ８Ｄ２）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＤ（Ａ１０Ｄ）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＤＤ（Ａ１０Ｄ２）、ＡＡＡＡＫＫ（Ａ４Ｋ２）、ＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋ）、ＡＡＡＡＡＡＫＫ（Ａ６Ｋ２）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ８Ｋ）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＫＫ（Ａ８Ｋ２）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ１０Ｋ）、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＫＫ（Ａ１０Ｋ２）、ＶＶＶＶＤＤ（Ｖ４Ｄ２）、ＶＶＶＶＶＶＤ（Ｖ６Ｄ）、ＶＶＶＶＶＶＤＤ（Ｖ６Ｄ２）、ＶＶＶＶＶＶＶＶＤ（Ｖ８Ｄ）、ＶＶＶＶＶＶＶＶＤＤ（Ｖ８Ｄ２）、ＶＶＶＶＶＶＶＶＶＶＤ（Ｖ１０Ｄ）、ＶＶＶＶＶＶＶＶＶＶＤＤ（Ｖ１０Ｄ２）、ＶＶＶＶＫＫ（Ｖ４Ｋ２）、ＶＶＶＶＶＶＫ（Ｖ６Ｋ）、ＶＶＶＶＶＶＫＫ（Ｖ６Ｋ２）、ＶＶＶＶＶＶＶＶＫ（Ｖ８Ｋ）、ＶＶＶＶＶＶＶＶＫＫ（Ｖ８Ｋ２）、ＶＶＶＶＶＶＶＶＶＶＫ（Ｖ１０Ｋ）、ＶＶＶＶＶＶＶＶＶＶＫＫ（Ｖ１０Ｋ２）、ＬＬＬＬＤＤ（Ｌ４Ｄ２）、ＬＬＬＬＬＬＤ（Ｌ６Ｄ）、ＬＬＬＬＬＬＤＤ（Ｌ６Ｄ２）、ＬＬＬＬＬＬＬＬＤ（Ｌ８Ｄ）、ＬＬＬＬＬＬＬＬＤＤ（Ｌ８Ｄ２）、ＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＤＤ（Ｌ１０Ｄ２）、ＬＬＬＬＫＫ（Ｌ４Ｋ２）、ＬＬＬＬＬＬＫ（Ｌ６Ｋ）、又はＬＬＬＬＬＬＫＫ（Ｌ６Ｋ２）、ＬＬＬＬＬＬＬＬＫ（Ｌ８Ｋ）、ＬＬＬＬＬＬＬＬＫＫ（Ｌ８Ｋ２）、ＬＬＬＬＬＬＬＬＬＫ（Ｌ１０Ｋ）、ＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＫＫ（Ｌ１０Ｋ２）を挙げることができるが、中でも、ＡＡＡＡＡＡＤ（Ａ６Ｄ）又はＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋ）が好ましく、ＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋ）が特に好ましい。
ペプチド界面活性剤の製造法は、固相合成法もしくは液層合成法によって合成される。当該ペプチドは人工合成可能であるため、生体由来物質を含まず、感染リスクの心配がない。
本発明において、核酸移送担体とは、ｓｉＲＮＡ等のポリヌクレオチドや遺伝子を、生体の意図する組織への移送、遺伝子導入する際に用い、その到達効率と導入効率を高めることができる組成物をいう。
マウス局所投与モデルにおけるＲＮＡｉ効果の検討
ルシフェラーゼ遺伝子を発現する腫瘍細胞を持つマウスにルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡとペプチド界面活性剤を混合した溶液を腫瘍へ直接注射し、ｓｉＲＮＡの導入と遺伝子抑制効果をルシフェラーゼ発光のイメージングで解析したところ、ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液による遺伝子抑制効果を確認した。
ルシフェラーゼ遺伝子を発現する腫瘍細胞を持つマウスにルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡとペプチド界面活性剤を混合した溶液を腫瘍へ直接注射し、ｓｉＲＮＡの導入と遺伝子抑制効果をルシフェラーゼ発光のイメージングで解析したところ、ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液による遺伝子抑制効果を確認した。
＜材料＞
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製
・ペプチド界面活性剤濃度
２濃度：５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ
・ルシフェラーゼ遺伝子抑制ｓｉＲＮＡ
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ＧＬ３ ｓｉＲＮＡ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ社製
・ルシフェリン
ルシフェリン１ｇ（Ｗａｋｏ）をダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）６６．７ｍＬに溶解し、０．２μｍシリンジフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ）を通して滅菌した。シリンジフィルターを通して直接遮光チューブに分注し、−８０℃（−２０℃）で保存した。
・ルシフェラーゼ遺伝子発現腫瘍細胞
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ社）
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製
・ペプチド界面活性剤濃度
２濃度：５０μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ
・ルシフェラーゼ遺伝子抑制ｓｉＲＮＡ
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ＧＬ３ ｓｉＲＮＡ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ社製
・ルシフェリン
ルシフェリン１ｇ（Ｗａｋｏ）をダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）６６．７ｍＬに溶解し、０．２μｍシリンジフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ）を通して滅菌した。シリンジフィルターを通して直接遮光チューブに分注し、−８０℃（−２０℃）で保存した。
・ルシフェラーゼ遺伝子発現腫瘍細胞
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ社）
＜方法＞
・腫瘍モデルマウスの作成
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞を１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ）含有Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞をトリプシン処理で回収し、ダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）に懸濁、９週齢の雄ヌードマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）の皮下に３×１０６細胞／２００μｌを２６Ｇ注射針にて移植し、腫瘍マウスを作成した。
・ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤の調製
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ＧＬ３ ｓｉＲＮＡ５０μｇ（ＰＢＳ（−）１００μＬに溶解）とペプチド界面活性剤を等量混合し（最終投与量が１匹あたり２００μＬになるよう調製）、室温にて２０分間、低速で回転混和した。
・投与
試験群には、ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液を腫瘍部位あたりに２００μｌ投与した。一方、コントロール群はペプチド界面活性剤（５０μｇ／ｍＬと５００μｇ／ｍＬ）のみを２００μｌ投与した。
・Ｉｎ ｖｉｖｏイメージング
ルシフェリン投与前に動物の体重を測定し、ルシフェリン溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）を１５０ｍｇ／ｋｇで２６Ｇ注射針（テルモ社）にて腹腔内投与した。ルシフェリン投与から１０分後、ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）にてイメージングした。イメージングデータはＬＩＶＩＮＧＩＭＡＧＥ２．５１ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）にて解析した。ルシフェラーゼ発光イメージングは、ｓｉＲＮＡ投与直前をｄａｙ０として、ｄａｙ０よりｄａｙ２までを行い、発光量の変化をｓｉＲＮＡの抑制効果とした。
・腫瘍モデルマウスの作成
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞を１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ）含有Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞をトリプシン処理で回収し、ダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）に懸濁、９週齢の雄ヌードマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）の皮下に３×１０６細胞／２００μｌを２６Ｇ注射針にて移植し、腫瘍マウスを作成した。
・ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤の調製
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ＧＬ３ ｓｉＲＮＡ５０μｇ（ＰＢＳ（−）１００μＬに溶解）とペプチド界面活性剤を等量混合し（最終投与量が１匹あたり２００μＬになるよう調製）、室温にて２０分間、低速で回転混和した。
・投与
試験群には、ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液を腫瘍部位あたりに２００μｌ投与した。一方、コントロール群はペプチド界面活性剤（５０μｇ／ｍＬと５００μｇ／ｍＬ）のみを２００μｌ投与した。
・Ｉｎ ｖｉｖｏイメージング
ルシフェリン投与前に動物の体重を測定し、ルシフェリン溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）を１５０ｍｇ／ｋｇで２６Ｇ注射針（テルモ社）にて腹腔内投与した。ルシフェリン投与から１０分後、ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）にてイメージングした。イメージングデータはＬＩＶＩＮＧＩＭＡＧＥ２．５１ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）にて解析した。ルシフェラーゼ発光イメージングは、ｓｉＲＮＡ投与直前をｄａｙ０として、ｄａｙ０よりｄａｙ２までを行い、発光量の変化をｓｉＲＮＡの抑制効果とした。
＜結果＞
結果を図１に示した。コントロール群（ペプチド界面活性剤のみ）では投与後にルシフェラーゼ発光量が増加しているが、試験群では発光量が減弱していた。このことから、ｓｉＲＮＡをペプチド界面活性剤と混合することで腫瘍細胞へのｓｉＲＮＡ導入が促進され、遺伝子発現が抑制されると考えられた。
結果を図１に示した。コントロール群（ペプチド界面活性剤のみ）では投与後にルシフェラーゼ発光量が増加しているが、試験群では発光量が減弱していた。このことから、ｓｉＲＮＡをペプチド界面活性剤と混合することで腫瘍細胞へのｓｉＲＮＡ導入が促進され、遺伝子発現が抑制されると考えられた。
マウス全身投与モデルにおけるＲＮＡｉ効果の検討
ルシフェラーゼ遺伝子を発現する腫瘍を持つマウスにルシフェラーゼ遺伝子抑制ｓｉＲＮＡとペプチド界面活性剤を混合した溶液を尾静脈から投与し、ｓｉＲＮＡの導入と遺伝子抑制効果をルシフェラーゼ発光のイメージングで解析したところ、ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液による遺伝子抑制効果を確認した。
ルシフェラーゼ遺伝子を発現する腫瘍を持つマウスにルシフェラーゼ遺伝子抑制ｓｉＲＮＡとペプチド界面活性剤を混合した溶液を尾静脈から投与し、ｓｉＲＮＡの導入と遺伝子抑制効果をルシフェラーゼ発光のイメージングで解析したところ、ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液による遺伝子抑制効果を確認した。
＜材料＞
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製
・ペプチド界面活性剤濃度
２濃度：５０．０、５００．０μｇ／ｍＬ
・ルシフェラーゼ遺伝子抑制ｓｉＲＮＡ
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ＧＬ３ ｓｉＲＮＡ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ社製）
・ルシフェリン
ルシフェリン１ｇ（Ｗａｋｏ）をダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）６６．７ｍＬに溶解し、０．２μｍシリンジフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ）を通して滅菌した。シリンジフィルターを通して直接遮光チューブに分注し、−８０℃（−２０℃）で保存した。
・ルシフェラーゼ遺伝子発現腫瘍細胞
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ社）
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製
・ペプチド界面活性剤濃度
２濃度：５０．０、５００．０μｇ／ｍＬ
・ルシフェラーゼ遺伝子抑制ｓｉＲＮＡ
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ＧＬ３ ｓｉＲＮＡ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ社製）
・ルシフェリン
ルシフェリン１ｇ（Ｗａｋｏ）をダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）６６．７ｍＬに溶解し、０．２μｍシリンジフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ）を通して滅菌した。シリンジフィルターを通して直接遮光チューブに分注し、−８０℃（−２０℃）で保存した。
・ルシフェラーゼ遺伝子発現腫瘍細胞
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ社）
＜方法＞
・腫瘍モデルマウスの作成
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞を１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ）含有Ｅａｇｌｅ’ ｓ ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養。ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞をトリプシン処理で回収し、ダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）に懸濁、９週齢の雄ヌードマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）の皮下に１．２５×１０６細胞／２００μｌで２６Ｇ注射針にて移植。
・ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤の調製
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ＧＬ３ ｓｉＲＮＡ ５０μｇ（ＰＢＳ（−）１００μＬに溶解）とペプチド界面活性剤を等量混合し（最終投与量が１匹あたり２００μＬになるよう調製）、室温にて２０分間、低速で回転混和した。
・投与
試験群はｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液をマウス尾静脈より２７Ｇ注射針（テルモ社製）にて２００μｌ投与した。コントロール群はペプチド界面活性剤（５００μ／ｍＬ）のみを２００μｌ投与した。
・Ｉｎ ｖｉｖｏイメージング
ルシフェリン投与前に動物の体重を測定し、ルシフェリン溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）を１５０ｍｇ／ｋｇで２６Ｇ注射針（テルモ社）にて腹腔内投与した。ルシフェリン投与から１０分後、ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）にてイメージングした。イメージングデータはＬＩＶＩＮＧＩＭＡＧＥ２．５１ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）にて解析した。ルシフェラーゼ発光イメージングは、ｓｉＲＮＡ投与直前をｄａｙ０として、ｄａｙ０よりｄａｙ２までを行い、発光量の変化をｓｉＲＮＡの抑制効果とした。
・腫瘍モデルマウスの作成
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞を１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ）含有Ｅａｇｌｅ’ ｓ ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養。ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞をトリプシン処理で回収し、ダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）に懸濁、９週齢の雄ヌードマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）の皮下に１．２５×１０６細胞／２００μｌで２６Ｇ注射針にて移植。
・ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤の調製
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ＧＬ３ ｓｉＲＮＡ ５０μｇ（ＰＢＳ（−）１００μＬに溶解）とペプチド界面活性剤を等量混合し（最終投与量が１匹あたり２００μＬになるよう調製）、室温にて２０分間、低速で回転混和した。
・投与
試験群はｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液をマウス尾静脈より２７Ｇ注射針（テルモ社製）にて２００μｌ投与した。コントロール群はペプチド界面活性剤（５００μ／ｍＬ）のみを２００μｌ投与した。
・Ｉｎ ｖｉｖｏイメージング
ルシフェリン投与前に動物の体重を測定し、ルシフェリン溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）を１５０ｍｇ／ｋｇで２６Ｇ注射針（テルモ社）にて腹腔内投与した。ルシフェリン投与から１０分後、ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）にてイメージングした。イメージングデータはＬＩＶＩＮＧＩＭＡＧＥ２．５１ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）にて解析した。ルシフェラーゼ発光イメージングは、ｓｉＲＮＡ投与直前をｄａｙ０として、ｄａｙ０よりｄａｙ２までを行い、発光量の変化をｓｉＲＮＡの抑制効果とした。
＜結果＞
結果を図２に示した。コントロール群（界面活性剤のみ）では投与後２日目でルシフェラーゼ発光量が増加しているが、試験群では発行量が減弱した。このことから、ｓｉＲＮＡをペプチド界面活性剤に混合して全身投与すると、腫瘍細胞へのｓｉＲＮＡ導入がペプチド界面活性剤によって促進され、遺伝子発現が抑制されると考えられた。
結果を図２に示した。コントロール群（界面活性剤のみ）では投与後２日目でルシフェラーゼ発光量が増加しているが、試験群では発行量が減弱した。このことから、ｓｉＲＮＡをペプチド界面活性剤に混合して全身投与すると、腫瘍細胞へのｓｉＲＮＡ導入がペプチド界面活性剤によって促進され、遺伝子発現が抑制されると考えられた。
マウス局所投与モデルにおけるＲＮＡｉ効果の検討
ルシフェラーゼ遺伝子を発現する腫瘍細胞を持つマウスに細胞増殖抑制効果をもつｓｉＲＮＡとペプチド界面活性剤を混合した溶液を腫瘍へ直接注射し、細胞増殖抑制効果を腫瘍サイズ計測により解析したところ、ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液による細胞増殖抑制効果を確認した。
ルシフェラーゼ遺伝子を発現する腫瘍細胞を持つマウスに細胞増殖抑制効果をもつｓｉＲＮＡとペプチド界面活性剤を混合した溶液を腫瘍へ直接注射し、細胞増殖抑制効果を腫瘍サイズ計測により解析したところ、ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液による細胞増殖抑制効果を確認した。
＜材料＞
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製
・ペプチド界面活性剤濃度
５００μｇ／ｍＬ
・腫瘍細胞抑制ｓｉＲＮＡ
ＥＺＨ２ ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ社製）
・ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ
ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）
・ルシフェリン
ルシフェリン１ｇ （Ｗａｋｏ）をダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）６６．７ｍＬに溶解し、０．２μｍシリンジフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ）を通して滅菌した。シリンジフィルターを通して直接遮光チューブに分注し、−８０℃（−２０℃）で保存。
・ルシフェラーゼ遺伝子発現腫瘍細胞
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ社）
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製
・ペプチド界面活性剤濃度
５００μｇ／ｍＬ
・腫瘍細胞抑制ｓｉＲＮＡ
ＥＺＨ２ ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ社製）
・ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ
ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）
・ルシフェリン
ルシフェリン１ｇ （Ｗａｋｏ）をダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）６６．７ｍＬに溶解し、０．２μｍシリンジフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ）を通して滅菌した。シリンジフィルターを通して直接遮光チューブに分注し、−８０℃（−２０℃）で保存。
・ルシフェラーゼ遺伝子発現腫瘍細胞
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ社）
＜方法＞
・腫瘍モデルマウスの作成
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞を１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ）含有Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養する。ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞をトリプシン処理で回収し、ダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）に懸濁、９週齢の雄ヌードマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）の皮下に２×１０６細胞／２００μｌを２６Ｇ注射針にて移植し、腫瘍マウスを作成する。
・ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤の調製
ｓｉＲＮＡ ２５μｇとペプチド界面活性剤を等量ずつ混合（最終量を１匹あたり２００μＬ）し、室温にて２０分間、低速で回転混和した。
・投与
試験群には、ＥＺＨ２ ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液を腫瘍部位あたりに２００μｌ投与した。一方、コントロール群はＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液を腫瘍あたり２００μｌ投与した。投与はｄａｙ０，ｄａｙ４，ｄａｙ８の３回投与とした。
・腫瘍サイズの計測
デジタルノギスによる短径、長径、高さ計測をｓｉＲＮＡ投与直前をｄａｙ０として、ｄａｙ０，ｄａｙ４，ｄａｙ８に行い、腫瘍サイズ（三辺の積）の変化を腫瘍細胞増殖抑制効果とした。
・腫瘍モデルマウスの作成
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞を１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ）含有Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養する。ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞をトリプシン処理で回収し、ダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）に懸濁、９週齢の雄ヌードマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）の皮下に２×１０６細胞／２００μｌを２６Ｇ注射針にて移植し、腫瘍マウスを作成する。
・ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤の調製
ｓｉＲＮＡ ２５μｇとペプチド界面活性剤を等量ずつ混合（最終量を１匹あたり２００μＬ）し、室温にて２０分間、低速で回転混和した。
・投与
試験群には、ＥＺＨ２ ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液を腫瘍部位あたりに２００μｌ投与した。一方、コントロール群はＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液を腫瘍あたり２００μｌ投与した。投与はｄａｙ０，ｄａｙ４，ｄａｙ８の３回投与とした。
・腫瘍サイズの計測
デジタルノギスによる短径、長径、高さ計測をｓｉＲＮＡ投与直前をｄａｙ０として、ｄａｙ０，ｄａｙ４，ｄａｙ８に行い、腫瘍サイズ（三辺の積）の変化を腫瘍細胞増殖抑制効果とした。
＜結果＞
結果を図３に示した。コントロール群では投与後ｄａｙ４，ｄａｙ８と腫瘍サイズが増加しているが、試験群では腫瘍サイズが減少していた。このことから、ｓｉＲＮＡをペプチド界面活性剤と混合することで腫瘍細胞へのｓｉＲＮＡ導入が促進され、腫瘍細胞の増殖が抑制されると考えられた。
結果を図３に示した。コントロール群では投与後ｄａｙ４，ｄａｙ８と腫瘍サイズが増加しているが、試験群では腫瘍サイズが減少していた。このことから、ｓｉＲＮＡをペプチド界面活性剤と混合することで腫瘍細胞へのｓｉＲＮＡ導入が促進され、腫瘍細胞の増殖が抑制されると考えられた。
マウス局所投与モデルにおけるＲＮＡｉ効果の検討
ルシフェラーゼ遺伝子を発現する腫瘍細胞を持つマウスに腫瘍成長抑制効果をもつｓｉＲＮＡとペプチド界面活性剤を混合した溶液を腫瘍へ直接注射し、標的遺伝子のｍＲＮＡ量を定量ＰＣＲにより解析したところ、ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液による標的遺伝子の抑制効果が確認された。
ルシフェラーゼ遺伝子を発現する腫瘍細胞を持つマウスに腫瘍成長抑制効果をもつｓｉＲＮＡとペプチド界面活性剤を混合した溶液を腫瘍へ直接注射し、標的遺伝子のｍＲＮＡ量を定量ＰＣＲにより解析したところ、ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液による標的遺伝子の抑制効果が確認された。
＜材料＞
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製
・ペプチド界面活性剤濃度
５００μｇ／ｍＬ
・腫瘍成長抑制ｓｉＲＮＡ
ＥＺＨ２ ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ社製）
・ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ
ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）
・ルシフェラーゼ遺伝子発現腫瘍細胞
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ社）
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製
・ペプチド界面活性剤濃度
５００μｇ／ｍＬ
・腫瘍成長抑制ｓｉＲＮＡ
ＥＺＨ２ ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ社製）
・ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ
ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）
・ルシフェラーゼ遺伝子発現腫瘍細胞
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ社）
＜方法＞
・腫瘍モデルマウスの作成
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞を１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ）含有Ｅａｇｉｅ’ｓ ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養する。ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞をトリプシン処理で回収し、ダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）に懸濁、９週齢の雄ヌードマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）の皮下に２×１０６細胞／２００μｌを２６Ｇ注射針にて移植し、腫瘍マウスを作成する。
・ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤の調製
ｓｉＲＮＡ ２５μｇとペプチド界面活性剤を等量ずつ混合（最終量を１匹あたり２００μＬ）し、室温にて２０分間、低速で回転混和した。
・投与
試験群には、ＥＺＨ２ ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液を腫瘍部位あたりに２００μｌ投与した。一方、コントロール群はＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液を腫瘍あたり２００μｌ投与した。投与は３日間の連続投与とした。
・組織の固定・保存
試験群及びコントロール群の腫瘍はｄａｙ６に摘出し、液体窒素にて保存し、使用時まで−８０℃にて冷凍保存した。
・ＲＮＡ抽出
腫瘍をホモジナイズし、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いてＲＮＡを抽出した。
・ｃＤＮＡの合成
Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ ｗｉｔｈ ＲＮＡｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてｓｉＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。
・リアルタイムＰＣＲ
Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（インビロトジェン社製）とＴａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてＥＺＨ２を標的とし、ＧＡＰＤＨを内部標準としてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７７００リアルタイムＰＣＲシステムによって定量解析を行った。
・腫瘍モデルマウスの作成
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞を１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ）含有Ｅａｇｉｅ’ｓ ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養する。ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞をトリプシン処理で回収し、ダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）に懸濁、９週齢の雄ヌードマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）の皮下に２×１０６細胞／２００μｌを２６Ｇ注射針にて移植し、腫瘍マウスを作成する。
・ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤の調製
ｓｉＲＮＡ ２５μｇとペプチド界面活性剤を等量ずつ混合（最終量を１匹あたり２００μＬ）し、室温にて２０分間、低速で回転混和した。
・投与
試験群には、ＥＺＨ２ ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液を腫瘍部位あたりに２００μｌ投与した。一方、コントロール群はＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液を腫瘍あたり２００μｌ投与した。投与は３日間の連続投与とした。
・組織の固定・保存
試験群及びコントロール群の腫瘍はｄａｙ６に摘出し、液体窒素にて保存し、使用時まで−８０℃にて冷凍保存した。
・ＲＮＡ抽出
腫瘍をホモジナイズし、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いてＲＮＡを抽出した。
・ｃＤＮＡの合成
Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ ｗｉｔｈ ＲＮＡｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてｓｉＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。
・リアルタイムＰＣＲ
Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ−ＵＤＧ（インビロトジェン社製）とＴａｑｍａｎ Ｐｒｏｂｅ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてＥＺＨ２を標的とし、ＧＡＰＤＨを内部標準としてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７７００リアルタイムＰＣＲシステムによって定量解析を行った。
＜結果＞
結果を図４に示した。コントロール群のＥＺＨ２ ｍＲＮＡ発現量を１とした際の試験群のＥＺＨ２ ｍＲＮＡ発現量が０．５３であった。このことから、ｓｉＲＮＡをペプチド界面活性剤と混合することで腫瘍細胞における標的遺伝子抑制効果が確認された。
結果を図４に示した。コントロール群のＥＺＨ２ ｍＲＮＡ発現量を１とした際の試験群のＥＺＨ２ ｍＲＮＡ発現量が０．５３であった。このことから、ｓｉＲＮＡをペプチド界面活性剤と混合することで腫瘍細胞における標的遺伝子抑制効果が確認された。
マウス全身投与モデルにおけるＲＮＡｉ効果の検討
ルシフェラーゼ遺伝子を発現する腫瘍を尾静脈投与したマウスに腫瘍成長抑制効果をもつｓｉＲＮＡとペプチド界面活性剤を混合した溶液を尾静脈から投与し、全身性のがん転移抑制効果をルシフェラーゼ発光のイメージングにより解析したところ、ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液による全身性のがん転移抑制効果を確認した。
ルシフェラーゼ遺伝子を発現する腫瘍を尾静脈投与したマウスに腫瘍成長抑制効果をもつｓｉＲＮＡとペプチド界面活性剤を混合した溶液を尾静脈から投与し、全身性のがん転移抑制効果をルシフェラーゼ発光のイメージングにより解析したところ、ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液による全身性のがん転移抑制効果を確認した。
＜材料＞
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製
・ペプチド界面活性剤濃度
５００．０μｇ／ｍＬ
・腫瘍増殖抑制ｓｉＲＮＡ
ＥＺＨ２ ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ社製）
ＫＩＦ１１ ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社製）
・ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ
ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）
・ルシフェリン
ルシフェリン１ｇ （Ｗａｋｏ）をダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）６６．７ｍＬに溶解し、０．２ｕｍシリンジフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ）を通して滅菌した。シリンジフィルターを通して直接遮光チューブに分注し、−８０℃（−２０℃）で保存。
・ルシフェラーゼ遺伝子発現腫瘍細胞
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ社）
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製
・ペプチド界面活性剤濃度
５００．０μｇ／ｍＬ
・腫瘍増殖抑制ｓｉＲＮＡ
ＥＺＨ２ ｓｉＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ社製）
ＫＩＦ１１ ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社製）
・ネガティブコントロールｓｉＲＮＡ
ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）
・ルシフェリン
ルシフェリン１ｇ （Ｗａｋｏ）をダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）６６．７ｍＬに溶解し、０．２ｕｍシリンジフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ）を通して滅菌した。シリンジフィルターを通して直接遮光チューブに分注し、−８０℃（−２０℃）で保存。
・ルシフェラーゼ遺伝子発現腫瘍細胞
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６（Ｘｅｎｏｇｅｎ，Ａｌａｍｅｄａ社）
＜方法＞
・腫瘍モデルマウスの作成
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞を１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ）含有Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養。ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞をトリプシン処理で回収し、ダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）に懸濁、９週齢の雄スキッドマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）の尾静脈に２×１０６細胞／２００μｌで２６Ｇ注射針にて移植。
・ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤の調製
各ｓｉＲＮＡ５０μｇとペプチド界面活性剤を等量ずつ混合（最終量を１匹あたり２００μＬ）し、室温にて２０分間、低速で回転混和した。
・投与
試験群はＥＺＨ２ ｓｉＲＮＡまたはＫＩＦ１１ ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液をマウス尾静脈より２７Ｇ注射針（テルモ社製）にて２００μｌ投与した。コントロール群はＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液を尾静脈より２７Ｇ注射針（テルモ社製）にて２００μｌ投与した。
・Ｉｎ ｖｉｖｏイメージング
ルシフェリン投与前に動物の体重を測定し、ルシフェリン溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）を１５０ｍｇ／ｋｇで２６Ｇ注射針（テルモ社）にて腹腔内投与した。ルシフェリン投与から１０分後、ＩＶＩＳＩｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）にてイメージングした。イメージングデータはＬＩＶＩＮＧＩＭＡＧＥ２．５１ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）にて解析した。ルシフェラーゼ発光イメージングは、ｓｉＲＮＡ投与直前をｄａｙ０として、ｄａｙ０，ｄａｙ９，ｄａｙ１２，ｄａｙ１５までを行い、発光量の変化を腫瘍細胞抑制とした。
・腫瘍モデルマウスの作成
ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞を１０％ＦＢＳ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ）含有Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養。ＰＣ−３Ｍ−ｌｕｃ−Ｃ６細胞をトリプシン処理で回収し、ダルベッコＰＢＳ（Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋不含）に懸濁、９週齢の雄スキッドマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）の尾静脈に２×１０６細胞／２００μｌで２６Ｇ注射針にて移植。
・ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤の調製
各ｓｉＲＮＡ５０μｇとペプチド界面活性剤を等量ずつ混合（最終量を１匹あたり２００μＬ）し、室温にて２０分間、低速で回転混和した。
・投与
試験群はＥＺＨ２ ｓｉＲＮＡまたはＫＩＦ１１ ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液をマウス尾静脈より２７Ｇ注射針（テルモ社製）にて２００μｌ投与した。コントロール群はＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合液を尾静脈より２７Ｇ注射針（テルモ社製）にて２００μｌ投与した。
・Ｉｎ ｖｉｖｏイメージング
ルシフェリン投与前に動物の体重を測定し、ルシフェリン溶液（１５ｍｇ／ｍＬ）を１５０ｍｇ／ｋｇで２６Ｇ注射針（テルモ社）にて腹腔内投与した。ルシフェリン投与から１０分後、ＩＶＩＳＩｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）にてイメージングした。イメージングデータはＬＩＶＩＮＧＩＭＡＧＥ２．５１ソフトウェア（Ｘｅｎｏｇｅｎ）にて解析した。ルシフェラーゼ発光イメージングは、ｓｉＲＮＡ投与直前をｄａｙ０として、ｄａｙ０，ｄａｙ９，ｄａｙ１２，ｄａｙ１５までを行い、発光量の変化を腫瘍細胞抑制とした。
＜結果＞
結果を図５に示した。コントロール群（界面活性剤のみ）では投与後６日目よりルシフェラーゼ発光量の増加が確認されるが、試験群ではルシフェラーゼ発光量の増加は確認されなかった。このことから、ｓｉＲＮＡをペプチド界面活性剤に混合して全身投与すると、腫瘍細胞へのｓｉＲＮＡ導入がペプチド界面活性剤によって促進され、全身性のがん転移が抑制されると考えられた。
結果を図５に示した。コントロール群（界面活性剤のみ）では投与後６日目よりルシフェラーゼ発光量の増加が確認されるが、試験群ではルシフェラーゼ発光量の増加は確認されなかった。このことから、ｓｉＲＮＡをペプチド界面活性剤に混合して全身投与すると、腫瘍細胞へのｓｉＲＮＡ導入がペプチド界面活性剤によって促進され、全身性のがん転移が抑制されると考えられた。
界面活性剤ペプチドの肝機能に与える影響についての検討
正常マウスにｓｉＲＮＡ／界面活性剤ペプチド混合液を尾静脈投与し、血清中のＧＯＴ，ＧＰＴ濃度を測定し、肝毒性がないことを確認した。
正常マウスにｓｉＲＮＡ／界面活性剤ペプチド混合液を尾静脈投与し、血清中のＧＯＴ，ＧＰＴ濃度を測定し、肝毒性がないことを確認した。
＜材料＞
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製
・ペプチド界面活性剤濃度
５００．０μｇ／ｍＬ
・ｓｉＲＮＡ
ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａ社製）
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製
・ペプチド界面活性剤濃度
５００．０μｇ／ｍＬ
・ｓｉＲＮＡ
ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａ社製）
＜方法＞
・ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤の調製
各ｓｉＲＮＡ ５０μｇとペプチド界面活性剤を等量ずつ混合（最終量を１匹あたり２００μＬ）し、室温にて２０分間、低速で回転混和した。
・サンプル調整
９週齢の雄ＩＣＲマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）の尾静脈にｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合２７Ｇ注射針（テルモ社製）にて２００μｌ投与し、６時間後に腹部大静脈より採血した。１０００×ｇで１５分間の遠心分離により血清を分離した。
・測定
富士ドライケム（富士フィルム社製）によりＧＯＴ，ＧＰＴを測定した。
・ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤の調製
各ｓｉＲＮＡ ５０μｇとペプチド界面活性剤を等量ずつ混合（最終量を１匹あたり２００μＬ）し、室温にて２０分間、低速で回転混和した。
・サンプル調整
９週齢の雄ＩＣＲマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）の尾静脈にｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合２７Ｇ注射針（テルモ社製）にて２００μｌ投与し、６時間後に腹部大静脈より採血した。１０００×ｇで１５分間の遠心分離により血清を分離した。
・測定
富士ドライケム（富士フィルム社製）によりＧＯＴ，ＧＰＴを測定した。
＜結果＞
結果を図６、図７に示した。試験群では血清中ＧＯＴ値とＧＰＴ値は正常値を示した。このことからｓｉＲＮＡとペプチド界面活性剤の混合液を全身投与しても肝機能は変わらず、肝毒性がないことが明らかとなった。
結果を図６、図７に示した。試験群では血清中ＧＯＴ値とＧＰＴ値は正常値を示した。このことからｓｉＲＮＡとペプチド界面活性剤の混合液を全身投与しても肝機能は変わらず、肝毒性がないことが明らかとなった。
界面活性剤ペプチドによる免疫応答性の検討
正常マウスにｓｉＲＮＡ／界面活性剤ペプチド混合液を尾静脈投与し、ＥＬＩＳＡ法により血清中のインターフェロンアルファ、インターフェロンガンマ、ＭＣＰ−１、インターロイキン１２、インターロイキン６、ケモカイン濃度を測定し、免疫応答性がないことを確認した。
正常マウスにｓｉＲＮＡ／界面活性剤ペプチド混合液を尾静脈投与し、ＥＬＩＳＡ法により血清中のインターフェロンアルファ、インターフェロンガンマ、ＭＣＰ−１、インターロイキン１２、インターロイキン６、ケモカイン濃度を測定し、免疫応答性がないことを確認した。
＜材料＞
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製
・ペプチド界面活性剤濃度
５００．０μｇ／ｍＬ
・ｓｉＲＮＡ
ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製
・ペプチド界面活性剤濃度
５００．０μｇ／ｍＬ
・ｓｉＲＮＡ
ＡｌｌＳｔａｒｓ Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ（ＱＩＡＧＥＮ社製）
＜方法＞
・ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤の調製
各ｓｉＲＮＡ ５０μｇとペプチド界面活性剤を等量ずつ混合（最終量を１匹あたり２００μＬ）し、室温にて２０分間、低速で回転混和した。
・サンプル調整
９週齢の雄ＩＣＲマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）の尾静脈にｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合２７Ｇ注射針（テルモ社製）にて２００μｌ投与し、６時間後に腹部大静脈より採血した。１０００×ｇで１５分間の遠心分離により血清を分離した。
・測定
Ｐｒｏｃａｒｔａ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｓｓａｙ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）によりインターフェロンアルファ、インターフェロンガンマ、ＭＣＰ−１、インターロイキン１２、インターロイキン６、ケモカイン濃度を測定した。
・ｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤の調製
各ｓｉＲＮＡ ５０μｇとペプチド界面活性剤を等量ずつ混合（最終量を１匹あたり２００μＬ）し、室温にて２０分間、低速で回転混和した。
・サンプル調整
９週齢の雄ＩＣＲマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ，Ｏｓａｋａ）の尾静脈にｓｉＲＮＡ／ペプチド界面活性剤混合２７Ｇ注射針（テルモ社製）にて２００μｌ投与し、６時間後に腹部大静脈より採血した。１０００×ｇで１５分間の遠心分離により血清を分離した。
・測定
Ｐｒｏｃａｒｔａ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ａｓｓａｙ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）によりインターフェロンアルファ、インターフェロンガンマ、ＭＣＰ−１、インターロイキン１２、インターロイキン６、ケモカイン濃度を測定した。
＜結果＞
結果を図８、図９、図１０、図１１、図１２、図１３に示した。コントロール群（非投与群）と試験群を比較し血清中ンターフェロンアルファ、インターフェロンガンマ、ＭＣＰ−１、インターロイキン１２、インターロイキン６、ケモカイン濃度に差は認められなかった。このことからｓｉＲＮＡとペプチド界面活性剤の混合液を全身投与しても免疫応答反応が惹起されないことが明らかとなった。
結果を図８、図９、図１０、図１１、図１２、図１３に示した。コントロール群（非投与群）と試験群を比較し血清中ンターフェロンアルファ、インターフェロンガンマ、ＭＣＰ−１、インターロイキン１２、インターロイキン６、ケモカイン濃度に差は認められなかった。このことからｓｉＲＮＡとペプチド界面活性剤の混合液を全身投与しても免疫応答反応が惹起されないことが明らかとなった。
＜総合考察＞
実施例１と実施例２と結果を併せ、ペプチド界面活性剤が、局所投与及び全身投与の両方でｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制に有用であると考えられた。
実施例３と実施例４、実施例５の結果を併せ、ペプチド界面活性剤が、局所投与及び全身投与の両方でｓｉＲＮＡによる腫瘍細胞増殖抑制に有用であると考えられた。
実施例６と実施例７の結果を併せ、ペプチド界面活性剤は肝毒性がなく、免疫反応を惹起しないことから生体に安全な核酸移送担体であると考えられた。
実施例１と実施例２と結果を併せ、ペプチド界面活性剤が、局所投与及び全身投与の両方でｓｉＲＮＡによる遺伝子発現抑制に有用であると考えられた。
実施例３と実施例４、実施例５の結果を併せ、ペプチド界面活性剤が、局所投与及び全身投与の両方でｓｉＲＮＡによる腫瘍細胞増殖抑制に有用であると考えられた。
実施例６と実施例７の結果を併せ、ペプチド界面活性剤は肝毒性がなく、免疫反応を惹起しないことから生体に安全な核酸移送担体であると考えられた。
Claims (4)
- ペプチド界面活性剤を含む核酸の移送担体。
- ペプチド界面活性剤が、４〜１０の親水性アミノ酸からなる頭部及び１又は２の疎水性アミノ酸からなる尾部からなる、請求項１に記載の核酸の移送担体。
- 核酸の移送担体が、ＡＡＡＡＡＡＤ又はＡＡＡＡＡＡＫである、請求項１に記載の核酸の移送担体。
- 請求項１−３のいずれか１項に記載の核酸の移送担体及び核酸を含む、局所投与又は全身投与用医薬品。
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Cited By (4)
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|---|---|---|---|---|
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