JP2015519374A - ペプチド界面活性剤を使用した分子の持続送達およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2012年5月31に出願された米国仮特許出願第61/653,782号の恩典を主張する。上記出願の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
a.(Φ)m(+)n(式(1))、
b.(+)n(Φ)m(式(2))、
c.(Φ)m(−)n(式(3))、
d.(−)n(Φ)m(式(4))、
e.(−)n(Φ)m(−)n(式(5))、
f.(+)n(Φ)m(+)n(式(6))、
g.(Φ)m(−)n(Φ)m(式(7))、
h.(Φ)m(+)n(Φ)m(式(8))、
i.(+)n(Φ)m(−)n(式(9))および
j.(−)n(Φ)m(+)n(式(10))、
式中:
(Φ)は、独立して、各事象に対し、疎水性側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し;好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはプロリンであり;
(+)は、独立して、各事象に対し、生理的pHでカチオン性である側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し;好ましくはヒスチジン、リジンまたはアルギニンであり;
(−)は、独立して、各事象に対し、生理的pHでアニオン性である側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し;好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸であり;
末端アミノ酸は任意で置換され;
各事象に対するmは、5以上の整数を表し;ならびに
各事象に対するnは、1以上の整数を表し;
さらに、生物活性剤はナノ構造内に封入される。
a.(Φ)m(+)n(式(1))、
b.(+)n(Φ)m(式(2))、
c.(Φ)m(−)n(式(3))、
d.(−)n(Φ)m(式(4))、
e.(−)n(Φ)m(−)n(式(5))、
f.(+)n(Φ)m(+)n(式(6))、
g.(Φ)m(−)n(Φ)m(式(7))、
h.(Φ)m(+)n(Φ)m(式(8))、
i.(+)n(Φ)m(−)n(式(9))、
j.(−)n(Φ)m(+)n(式(10))、
式中:
ペプチドのナノ構造への自己組織化に好適で、ナノ構造を形成させる条件下において
(Φ)は、独立して、各事象に対し、疎水性側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し;好ましくはアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはプロリンであり;
(+)は、独立して、各事象に対し、生理的pHでカチオン性である側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し;好ましくはヒスチジン、リジンまたはアルギニンであり;
(−)は、独立して、各事象に対し、生理的pHでアニオン性である側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し;好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸であり;
末端アミノ酸は任意で置換され;
各事象に対するmは、5以上の整数を表し;ならびに
各事象に対するnは、1以上の整数を表す。
式(1)〜(10)の各々を、左から右に読むと、N末端からC末端までのアミノ酸配列に対応する。
材料および方法
界面活性剤様、自己組織化ペプチド.両親媒性ペプチド、アセチル−AAAAAAK−CONH2(ac−A6K−CONH2;配列番号:1)、KAAAAAA−CONH2(KA6−CONH2;配列番号:2)、アセチル−AAAAAAD−COOH(ac−A6D−COOH;配列番号:3)、およびDAAAAAA−COOH(DA6−COOH;配列番号:4)を購入した(SynBioSci、Livermore、CA)。ペプチドの純度は、エレクトロスプレーイオン化−四重極型−飛行時間型(ESI−Q−TOF)質量分析により決定すると、約92%であった。ペプチドは粉末で受け取り、リン酸緩衝液生理食塩水、(PBS、100mM KH2PO4、10mM Na2HPO4、137mM NaCl、2.7mM KCl、pH7.4)に分散させ、10min間、浴中超音波処理器を用いて超音波処理し、可溶化および分散を促進させた。ペプチド溶液をその後、15min間平衡化させ、モノマを自己会合させ、アミコンウルトラ3kDaMWCOに通して濾過して非会合ペプチドモノマおよび他の合成残留分子を除去し、再懸濁させ、0.4μmフィルタに通して濾過し大きなペプチドベシクル凝集物を除去し、室温でさらに研究の間貯蔵した。
溶液中のペプチドを、エレクトロスプレーイオン化−四重極型−飛行時間型(ESI−Q−TOF)質量分析により特徴付けした。ペプチド断片の分離を、Zorbax 300 Extend−C18カラム(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)、およびAgilent 6510 Q−TOF(噴霧圧力:3.8kV、ガス温度:275℃、ネブライザーガス:10psi、および乾燥ガス:4L/min)に連結させたAgilent1200シリーズクロマトグラフィーシステムを使用して実施した。走査モードにおける陽イオンデータ依存取得範囲は100−1799m/zであり、MS/MSモードでは、100−2000m/zであった。MS/MS取得の電荷優先度は+2(電荷)、+3、>+3、未知、+1であった。データを収集し、Agilent MassHunterソフトウェア(Agilent, Technologies, Palo Alto, CA)を使用して解析した。ペプチド同定、割当、および可能なアミノ酸化学修飾を、MS/MSスペクトルの検査により、ProteinProspectorソフトウェア(http://prospector.ucsf.edu/)を使用することにより実施した。
この研究で我々が試験したペプチド配列の設計に対する理論的根拠は、生体膜中に存在するリン脂質の長さおよび構造に似ていることであった。ac−A6K−CONH2(配列番号:1)、KA6;−CONH2(配列番号:2)、およびac−A6D−COOH(配列番号:3)ペプチドは、6個のアラニンから構成される疎水性尾部および荷電側鎖を有するアミノ酸である親水性頭部を有する。頭部および尾部の両方に極性基を有する自己組織化両親媒性ペプチド、DA6−COOH(配列番号:4)もまた合成し、形態学的、物理化学的、およびペプチド−細胞相互作用分析の結果を、界面活性剤様ペプチドのものと比較した。脂質およびアニオン性界面活性剤のように、脂質様ペプチドは、脂質に基づく系で起こるものに類似するように、水溶液中で隔離し、自己組織化し、ナノ構造を形成する[6,16]。界面活性剤様ペプチドの、150mMの電解質を含むPBS溶液への添加により、ペプチドモノマの自己組織化による濁った懸濁液の形成が得られる。
ペプチドをHPLCにより分離し、ESI−Q−TOF質量分析により分析した(図2)。全ての荷電状態に対する抽出クロマトグラムの合わせたピーク積分を使用する定量分析は、ペプチドの純度が90%〜92%の間であったことを明らかにする。図2におけるMSスペクトルにおいて見られるように、試料は微量のより短い、場合によっては、より長いペプチドを含み、これは、合成ペプチド調製物では普通である。MSスペクトル中に存在する割り当てられていないピークは、+1荷電ペプチドの起源内(intra−source)断片化による。
我々はAFMを使用して、両親媒性ペプチドアセンブリの形態を研究した。前に、我々はベシクルおよびナノチューブの形成が実験条件に依存することを報告した[6、7、10]。本明細書では、実験条件は一貫してナノベシクルの形成へと導いた。図3は、両親媒性ペプチドアセンブリのサイズが使用したペプチドの型に依存したことを示す。ペプチドベシクルのサイズ分布分析は、リジンを含む、正電荷を持つac−A6K−CONH2(配列番号:1)およびKA6−CONH2(配列番号:2)ペプチドの自己組織化は、負電荷を持つac−A6D−COOH(配列番号:3)およびDA6−COOH(配列番号:4)ペプチドの会合から得られたものと比べてより大きな粒子となることを示した(図3、挿入図、および表1)。これはおそらく、リジンに比べ、アスパラギン酸の側鎖がより小さいことによるであろう。これにより、ナノベシクル二重層におけるペプチドのより良好な充填が可能になる。
ペプチドナノベシクルの流体力学半径、Rhを、DLSにより決定した。PBS pH7.4中、25℃の分散された両親媒性ペプチドベシクルの強度時間相関関数および対応する逆ラプラス変換分析を図4に示す。実線は、CONTINアルゴリズムを使用して得られた最良適合結果を表す。光散乱データの逆ラプラス変換分析により、単峰性ペプチドベシクルサイズ分布が得られたが、KA6−CONH2(配列番号:2)ベシクル懸濁液の場合は除かれ、この場合、ピーク分析は、164nmおよび906nmの平均直径を有するナノベシクルの存在を示し;後者はおそらく、個々のベシクルの凝集物を表す(図4)。ac−A6K−CONH2(配列番号:1)ペプチドナノベシクルの平均直径は122nmである(図4および表2)。ac−A6K−CONH2(配列番号:1)およびKA6−CONH2(配列番号:2)ペプチドナノベシクルのDLS測定は、マイカ上に堆積させたナノベシクルのAFMにより決定されたサイズとよく一致する。しかしながら、ac−A6D−COOH(配列番号:3)およびDA6−COOH(配列番号:4)ペプチドベシクルのDLS分析は、それぞれ、直径97nmおよび137nmを有する粒子を明らかにした。これらの値は、AFMでは、ネックレス様構造およびナノベシクルクラスターを示した、個々のac−A6D−COOH(配列番号:3)およびDA6−COOH(配列番号:4)ペプチドナノベシクルに対してAFM分析により決定されたベシクル直径から外れていた。しかしながら、データの検査により、DLSデータ分析によりナノベシクルクラスターに対して決定されたものに類似する粒子直径が得られたことが示され、これらのクラスターは、DLSが実施されたPBS溶液中で安定であることが示唆される(表1、図4)。
静電現象は多くの生物学的プロセスにおいて重要である。ナノ粒子系上に電荷を導入すると、それらの生物学的および物理化学的特性を変化させることができる[20]。極性溶媒中に分散されたベシクルのコロイド安定性は、同様に荷電させた粒子表面間の静電反発と関連する。PBS中のペプチドナノベシクル製剤の安定性を決定するために、我々はそれらの表面電位値を測定した。
自己組織化ペプチドナノベシクルを薬物送達適用において使用することができるかどうかを決定するために、我々は、蛍光プローブCFのナノベシクル二重層を通じた放出動力学を測定した。図8は、界面活性剤様ac−A6K−CONH2(配列番号:1)ペプチドから構成されるペプチドベシクルが、ベシクルの内側に捕捉されたCFを、長期間保持したことを示す。放出実験(すなわち、ベシクルの遠心分離および再懸濁)において使用される条件では、ac−A6K−CONH2(配列番号:1)ペプチドナノベシクルを通じたCF放出は7h後およそ50%であった。ac−A6D−COOH(配列番号:3)に基づく製剤の場合、ベシクルは、個々の期間において最初に負荷したCFの13%を保持した。KA6−CONH2(配列番号:2)およびDA6−COOH(配列番号:4)ペプチドから構成されるベシクルは、2〜3時間以内にCFを完全に放出した。
我々は次に、ナイルレッドをプローブ分子として使用し、ペプチドベシクル二重層の疎水性特性および構造統合性を研究した。ナイルレッドは疎水性モデル薬物として考えられ、これは、リポソーム二重層安定性を評価するために使用される[23]。水中でナイルレッドにより放出される蛍光は非常に弱く、約660nmで極大を示す。しかしながら、ナイルレッドが極性溶媒との接触から遮断された疎水性環境に埋められると、強度は増加し、極大はブルーシフトする。自己組織化ペプチドベシクルに組み込まれたナイルレッドの発光スペクトルを図7に示す。
4つの両親媒性ペプチドの存在下でのCaco−2細胞の生存率を分析し、結果から、全てのペプチドは24hおよび48h後、細胞増殖に影響しなかったことが示唆される。図9は、Caco−2細胞が2日の培養で約5倍の細胞数増加を示すことを図示し、両親媒性ペプチドの存在下での細胞の活発な増殖が示唆される。自己組織化ペプチドのCaco−2細胞生存率に対する効果を定量的に評価するために、我々は、0.2mg/mLおよび1.0mg/mLのペプチドを添加して、MTTアッセイを使用した。これらのペプチド濃度は、ペプチドのCMC値よりも高く、よって、ペプチドナノベシクルならびにペプチドモノマが系中に存在する。図9に示されるように、細胞をペプチドとインキュベートした場合、細胞生存率の変化は観察されなかった(t検定p<0.05)。
脂質様ペプチドナノベシクルが、親水性および/または疎水性薬物化合物の封入により、薬物送達適用のために使用することができることを確証したが、我々はペプチドナノベシクルの、治療分子のバイオアベイラビリティを促進および増幅する能力を研究するように設定した。多くの疾患の管理の成功には、効率的な薬物送達が要求される。しかしながら、有効濃度の治療薬の送達は、胃腸管の上皮層または血液脳関門の低い透過性のために困難である。バイオアベイラビリティを増加させるために、様々な透過エンハンサーが開発されている。トランスウェルフィルタ増殖Caco−2上皮細胞は、上皮透過性を研究するためのインビトロモデル系として考えられる[24]。自己組織化ペプチドのCaco−2細胞単層を通る透過性に対する効果を評価するために、我々は高分子量親水性マーカーFITC−デキストランMW4.4kDaを使用した。傍細胞透過性は、複数の膜貫通タンパク質から構成される細胞のタイトジャンクションにより調節され、上皮層を通る管腔流体および分子の流れを調節するための半透性ゲートとして機能する。
自己組織化ペプチドは上皮細胞単層と相互作用し、傍細胞透過性およびFITC−デキストラン輸送を増加させることを観察したので、我々は、P−糖タンパク質媒介流出を試験することにより、透過性のメカニズムを調査し始めた。P−糖タンパク質は、主に、血液脳関門に関与するヒト脳毛細血管を含む上皮層の頂端表面に局在し、多くの薬物の活発な流出と関連する[25]。薬物溶解度を改善する医薬製剤に含められる特定の界面活性剤もまた、P−糖タンパク質と相互作用し、よって、薬物動態パラメータに影響する[26,27]。
自己組織化し、ナノベシクルを形成する全てのペプチドを、疎水性尾部および親水性頭部を考慮して設計した。我々の結果から、ペプチドの界面活性剤特性のみおよびナノベシクルの形成が必要であるが、効率的な薬物送達系の開発のために十分な条件ではないことが示される。全てのペプチドベシクルはそれらの巨視的な組織化を維持するが、それらのいくらかは封入された分子を長期間保持することができない。我々は、疎水性プローブナイルレッドのベシクル二重層内への封入および親水性CFのサイズ約126nmを有するac−A6K−CONH2(配列番号:1)ペプチドナノベシクルを通じた長期放出を観察した。ac−A6D−COOH(配列番号:3)の自己組織化により、約43nmの小さなナノベシクルが得られ、これらは効率的に疎水性ナイルレッドをペプチド二重層内に封入するが、負電荷を持つCFを、ac−A6K−CONH2(配列番号:1)ペプチドベシクルに比べてより速く放出してしまう。これらの結果から、ナノベシクルのサイズおよびそれらの負荷容量は、ベシクルを形成するために使用される自己組織化ペプチドモノマの電荷を変化させることにより、薬物の放出動力学を制御する手段を提供することが示唆される。
生物脂質に触発され、我々は、疎水性および親水性分子の薬物送達適用のために使用することができるナノベシクルを形成する、自己組織化特性を有する、両親媒性、界面活性剤様ペプチドを考案した。我々は、溶液中のペプチドベシクルの物理化学的および形態学的特性を調査し、我々はペプチド製剤の良好なインビトロ生体適合性を観察した。我々は、ペプチドナノベシクルは、P−糖タンパク質系との相互作用により、上皮単層を通じた輸送を促進することを証明した。細胞増殖研究は、両親媒性ペプチドは、Caco−2細胞培養における細胞増殖に影響しなかったことを示した。自己組織化ペプチドベシクルは、生物医学において潜在的有用性を有する新しい型のナノ材料を表す。これらの両親媒性ペプチドは、単一アミノ酸レベルで容易に設計することができるだけでなく、標準ペプチド合成により容易に製造される。我々の結果はさらに、治療特性を有する分子が封入され、体内で徐々に送達される、ペプチドに基づく薬物送達系の開発に対する理解を提供する。
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Claims (27)
- 自己組織化ナノ構造および生物活性分子を含む薬物送達組成物であって、前記ナノ構造は複数の界面活性剤ペプチドを含み、前記界面活性剤ペプチドは、下記からなる群より選択される式を有し:
a.(Φ)m(+)n(式(1))、
b.(+)n(Φ)m(式(2))、
c.(Φ)m(−)n(式(3))、
d.(−)n(Φ)m(式(4))、
e.(−)n(Φ)m(−)n(式(5))、
f.(+)n(Φ)m(+)n(式(6))、
g.(Φ)m(−)n(Φ)m(式(7))、
h.(Φ)m(+)n(Φ)m(式(8))、
i.(+)n(Φ)m(−)n(式(9))、
j.(−)n(Φ)m(+)n(式(10))、
式中:
(Φ)は、独立して、各事象に対し、疎水性側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し;
(+)は、独立して、各事象に対し、生理的pHでカチオン性である側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し;
(−)は、独立して、各事象に対し、生理的pHでアニオン性である側鎖を含む天然もしくは非天然アミノ酸を表し;
前記末端アミノ酸は任意で置換され;
各事象に対するmは、5以上の整数を表し;ならびに
各事象に対するnは、1以上の整数を表し;
さらに、前記生物活性剤はナノ構造内に封入される、
薬物送達組成物。 - 前記界面活性剤ペプチドは、式(1)または式(3)を有する、請求項1に記載の組成物。
- (Φ)は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびプロリンからなる群より選択される、請求項2に記載の組成物。
- (Φ)はアラニンである、請求項3に記載の組成物。
- (+)はヒスチジン、リジンまたはアルギニンからなる群より選択される、請求項3または4に記載の組成物。
- (−)はアスパラギン酸またはグルタミン酸からなる群より選択される、請求項3または4に記載の組成物。
- 前記界面活性剤ペプチドのN末端アミノ酸はアセチル基により置換される、請求項1に記載の組成物。
- 前記界面活性剤ペプチドのC末端アミノ酸はアミノ基で置換される、請求項1に記載の組成物。
- nは1である、請求項1に記載の組成物。
- mは5、6または7である、請求項1に記載の組成物。
- mは6である、請求項9に記載の組成物。
- 前記界面活性剤ペプチドはac−AAAAAAK−CONH2(配列番号:1)、KAAAAAA(配列番号:2)、ac−AAAAAAD−COOH(配列番号:3)およびDAAAAAA−COOH(配列番号:4)からなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
- 前記界面活性剤ペプチドはac−AAAAAAK−CONH2(配列番号:1)およびac−AAAAAAD−COOH(配列番号:3)からなる群より選択される、請求項12に記載の組成物。
- 前記ナノ構造はナノベシクルである、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記生物活性分子は疎水性である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記生物活性分子は親水性である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記生物活性分子は核酸である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記界面活性剤ペプチドはアセチル化N末端を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記界面活性剤ペプチドはC末端に正電荷を持つアミノ酸を有する、請求項1または請求項18に記載の組成物。
- 前記界面活性剤ペプチドはアミド化されたC末端を有する、請求項1、18または19のいずれか1項に記載の組成物。
- さらにリポソームを含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の組成物。
- 生物活性分子を被験体に投与するための方法であって、前記被験体に、請求項1〜21のいずれか1項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 前記生物活性分子は、前記被験体の胃腸管に、または血液脳関門を横切って送達される、請求項22に記載の方法。
- 前記生物活性分子は胃腸管に送達される、請求項23に記載の方法。
- 前記界面活性剤ペプチドは負電荷を持つ、請求項24に記載の方法。
- 前記組成物中の前記生物活性分子は放出制御プロファイルを有する、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 生物活性分子を前記界面活性剤ペプチドと、水溶液中、自己組織化に好適な条件下で接触させることを含む、請求項1〜21のいずれか1項に記載の組成物を調製する方法。
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