WO2010024262A1 - トランスフェクション剤 - Google Patents

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WO2010024262A1
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peptide surfactant
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peptide
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大蔵 吉田
次郎 武井
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株式会社スリー・ディー・マトリックス
学校法人日本医科大学
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    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
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    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
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    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein

Definitions

  • the present invention relates to a transfection agent containing a peptide surfactant.
  • RNAi can suppress the expression of a specific gene, it is expected to be applied to the treatment of diseases.
  • the transfection agent used when transfection of siRNA into cells is mainly cationic phospholipid, and its toxicity has been pointed out.
  • transfection agents are desired to have an extremely low toxicity, and development of transfection agents with lower toxicity is awaited.
  • Peptide surfactants are known to have the action of stabilizing membrane proteins such as the G protein-coupled receptor bovine rhodopsin and the property of self-organization (Non-patent Documents 1 and 2).
  • Non-patent Documents 1 and 2 Non-patent Documents 1 and 2.
  • its use as a transfection agent has not been known.
  • X Zhao et al., PNAS, Vol.103, No. 47, 17707-17712 A Nagai et al., J. Nanosci. Nanotechnol. Vol. 7, No. 7, 1-7
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a clinically applicable transfection agent with lower toxicity.
  • a peptide surfactant is useful as a transfection agent, and has completed the present invention.
  • a transfection agent comprising a peptide surfactant, 2.
  • a pharmaceutical comprising the transfection agent according to any one of 1 to 3 above and a nucleic acid, It is.
  • transduced into 3 types of human malignant glioma culture cells by the peptide surfactant is confirmation of the RNA interference effect by siRNA introduce
  • transduced into 3 types of human malignant glioma culture cells by the peptide surfactant is confirmation of the RNA interference effect by siRNA introduce
  • a peptide surfactant includes 6 to 10 amino acid residues, and has a length of about 2 to 3 nm.
  • Conventional surfactants such as n-dodecyl- ⁇ It exhibits the same characteristics as -D-maltoside (DM) and octyl-D-glucoside (OG).
  • the peptide surfactant of the present invention preferably comprises a head composed of 4 to 10 hydrophilic amino acids and a tail composed of 1 or 2 hydrophobic amino acids.
  • GGGGDD G4D2
  • GGGGGGDD G6D2
  • GGGGGGGGDD G8D2
  • GGGGGGGGGDD G10D2
  • AAAAAAD A6D
  • A6AA A6AA, A6A, A6A, A6A, A6A , VVVVVDD (V6D2), VVVVVVK (V6K), VVVVVVKK (V6K2), LLLLLLD (L6D), LLLLLLDDD (L6D2), LLLLLLLK (L6K), or LLLLLALK6 (A6)
  • AAAAAAK A6K
  • AAAAAAAAK AAAAAAK
  • AAAAAAAAK A6K
  • AAAAAAAAK A6K
  • the peptide surfactant of the present invention can be produced using a conventionally known solid phase synthesis method.
  • Such an artificially synthesized peptide does not contain a substance derived from a living body and can be preferably used because there is no concern about infectivity.
  • the term “transfection agent” refers to a composition that can be used to introduce a polynucleotide or gene such as siRNA into a cell and increase its introduction efficiency.
  • the transfection agent of the present invention can be blended with pharmaceuticals together with desired nucleic acids.
  • the pharmaceutical product of the present invention can be used for either oral administration or parenteral administration.
  • the nucleic acid used in the pharmaceutical product of the present invention is a part of the base sequence of a gene to be used as a target for treatment or the like, and is composed of DNA or RNA nucleic acid. A gene that can control the function of a gene. Such nucleic acids are generally known as nucleic acid drugs.
  • a decoy nucleic acid medicine a drug that inhibits gene expression by binding a transcriptional regulator to an oligonucleotide with the same sequence as a certain region (cis element) of DNA in the nucleus to which the transcriptional regulator binds
  • Nucleic acid aptamers that can specifically bind to other molecules, ribozymes that have catalytic activity to cleave RNAs, and antisense RNAs or target genes that inhibit gene expression by complementary binding to specific regions of the target gene mRNA Examples include siRNA that degrades mRNA by binding to a specific region of mRNA together with an RNA silencing complex.
  • Decoy nucleic acid drugs, nucleic acid aptamers, and ribozymes are highly specific nucleic acids that have a three-dimensional structure.
  • Antisense RNA is a single-stranded RNA oligomer that has a part of the reverse side of the mRNA sequence, and siRNA is the target.
  • These nucleic acids can be artificially produced by a chemical reaction using a nucleic acid synthesizer, or can be produced from cultured cells using a vector.
  • biopharmaceuticals consisting of chemical substances in living organisms are attracting attention in terms of their target specificity and biological safety.
  • One of the biopharmaceuticals includes nucleic acid drugs, which are currently being developed by many research institutions and pharmaceutical companies.
  • nucleic acid drugs siRNA-specific gene suppression effects have attracted attention in recent years, and siRNA drugs for various diseases are being developed.
  • An example of a therapeutic effect expected by using siRNA is treatment of glioblastoma, which is a kind of brain tumor. In glioblastoma, it is known that RNAi targeting MMP-2 induces apoptosis of tumor cells and suppresses tumor growth.
  • Pharmaceutical forms include tablets, capsules, granules, syrups and the like. These pharmaceuticals can be produced using additives in normal pharmaceutical production.
  • the dosage of the pharmaceutical product of the present invention is not particularly limited.
  • it is 0.001 to 10 mg / kg body weight per day.
  • the above dose can be administered once a day or divided into 2 to 3 times a day, and can be appropriately increased or decreased depending on the age, disease state, and symptoms.
  • the additive examples include lactose, dextrin, sucrose, mannitol, corn starch, sorbitol, crystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone and the like, and these can be used alone or in appropriate combination.
  • These pharmaceuticals can be produced by a method suitable for each pharmaceutical form according to the description of the Japanese Pharmacopoeia.
  • a flavoring agent, a coloring agent, a sweetener, etc. can also be used suitably.
  • the content of these additives can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • quasi drugs examples include tablets, capsules, granules, jellies, and drinks. These quasi-drugs can be manufactured using the additives in normal quasi-drug manufacture. Furthermore, these quasi drugs may contain other active ingredients such as vitamins. In addition, additives such as sweeteners, flavoring agents, coloring agents, and antioxidants may be used alone or in appropriate combination. These quasi drugs can be produced by methods well known to those skilled in the art.
  • Cytotoxicity evaluation was performed using cultured human cells for two types of peptide surfactant and cationic liposome gene transfer agent that are currently widely used.
  • Peptide surfactant (sequence: Ac-AAAAAAK-NH 2 , manufactured by Celtek) 2. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 3. siFECTOR (B-Bridge International, Inc.) ⁇ Cell culture of human malignant glioma (U87MG, purchased from ATCC) ⁇ MTT assay reagent (quantification of cell proliferation number) CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit (Promega)
  • ⁇ Method> Cells were seeded in 96-well plates (cell density: 2 ⁇ 10 4 / well) according to ATCC recommended protocol and incubated overnight. Replaced with fresh medium and added additive (final concentrations: 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ⁇ g / ml) . Cells were cultured for 24 hours. Thereafter, CellTiter 96 Aqueous One Solution was added (20 ⁇ l / well), and after 4 hours, the absorbance at 495 nm was measured with a plate reader, and the number of viable cells was quantified.
  • the toxicity of the peptide surfactant was the lowest.
  • the LD50 was 285.9 ⁇ g / ml peptide surfactant, 42.49 ⁇ g / ml Lipofectamine 2000, and 25.3 ⁇ g / ml siFECTOR.
  • the peptide surfactant showed no cytotoxicity at 25 ⁇ g / ml or less.
  • ⁇ Material> • Peptide surfactant sequence: Ac-AAAAAAK-NH 2 , manufactured by Celtek • siRNA siRNA / MMP-2, manufactured by Santa Cruz, siRNA fluorescent labeling reagent Label IT Cy-3 Labeling Kit, manufactured by Mirus, 3 types of cultured human malignant glioma cells (U87MG, T98G, U251MG, purchased from ATCC, respectively) ⁇ Method> Cy3 was labeled with siRNA fluorescent labeling reagent on siRNA / MMP-2 according to Mirus protocol. According to the ATCC protocol, 5000 cells were seeded on a chambered slide glass and placed overnight.
  • the medium was removed, and added to 1 ml of the medium so that the final concentration was 50 nM of siRNA and 20 ⁇ g / ml of peptide surfactant, followed by culturing for 8 hours.
  • siRNA was cultured in 1 ml of medium so that the final concentration was 50 nM.
  • fluorescence observation with a Cy3 filter and observation with clear vision were performed.
  • Time-dependent analysis of the amount of siRNA introduced into cells by peptide surfactant The time-dependent change in the amount of siRNA introduced into cells by the peptide surfactant was examined by observing fluorescence-labeled siRNA under a microscope.
  • Peptide surfactant sequence Ac-AAAAAAK-NH 2 , manufactured by Celtek • Peptide surfactant concentration 0, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 25.0 ⁇ g / mL ⁇ SiRNA siRNA / MMP-2, manufactured by Santa Cruz, siRNA fluorescent labeling reagent Label IT Cy-3 Labeling Kit, manufactured by Mirus, 3 types of cultured human malignant glioma cells (purchased from U87MG, T98G, U251MG, ATCC)
  • Cy3 was labeled with siRNA fluorescent labeling reagent on siRNA / MMP-2 according to the standard protocol of Miras. Labeled siRNA was mixed with a peptide surfactant. For 1 ⁇ 10 5 cells seeded in a 24-well plate containing 1 ml / well of medium, the final concentration was 50 nM for siRNA and 20 ⁇ g / ml for peptide surfactant. Incubated for 2, 4, 8, 16, and 24 hours. After washing the wells with PBS, the cells were collected and transferred to a 96-well plate, and the fluorescence was measured.
  • Peptide surfactant sequence Ac-AAAAAAK-NH 2 , manufactured by Celtek • Peptide surfactant concentration 0, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 25.0 ⁇ g / mL ⁇ SiRNA siRNA / MMP-2, manufactured by Santa Cruz, siRNA fluorescent labeling reagent Label IT Cy-3 Labeling Kit, manufactured by Mirus, 3 types of cultured human malignant glioma cells (purchased from U87MG, T98G, U251MG, ATCC)
  • Cy3 was labeled with siRNA fluorescent labeling reagent on siRNA / MMP-2 according to the standard protocol of Miras. Labeled siRNA was mixed with a peptide surfactant. For 1 ⁇ 10 5 cells seeded in a 24-well plate containing 1 ml / well of medium, the final concentration is 50 nM for siRNA, 0, 0.5, 1, 5, 10, 20, 25 ⁇ g / g for peptide surfactant. The solution was administered in a volume of ml and cultured for 8 hours. After washing the wells with PBS, the cells were collected and transferred to a 96-well plate, and the fluorescence was measured.
  • Peptide surfactant sequence Ac-AAAAAAK-NH 2 , manufactured by Celtek ⁇ Three types of cell human malignant glioma cultured cells (purchased from U87MG, T98G, U251MG, ATCC)
  • ⁇ Method> According to the standard protocol of ATCC, 1 ⁇ 10 5 cells were seeded in a 24-well plate and cultured overnight. After removing the medium, the following solution was added to the same culture conditions as described above so that the final concentration was as follows, followed by culturing for 8 hours.
  • siRNA 50 nM / peptide surfactant 20 ⁇ g / ml The siRNA was reverse transcribed into cDNA using Taqman Gene Expression Cell-to-Ct Kit (Applied Biosystems). The gene expression assay (Applied Biosystems) targeted MMP-2 and beta actin as an internal standard, and quantitative analysis was performed using an Applied Biosystems 7500 real-time PCR system.
  • ⁇ MMP-2 mRNA expression was significantly suppressed only when siRNA 50 nM / peptide surfactant 20 ⁇ g / ml was administered.
  • -Since siRNA alone has no effect of introducing into cells, it was considered that siRNA was incorporated into cells by the effect of siRNA introduction of the peptide surfactant, resulting in an RNA interference effect.
  • ⁇ Suppression of MMP-2 gene is not observed in a mixture of scrambled oligo RNA and peptide surfactant that has no homology in the human genome and has no specificity for the gene. It was thought that this was not a non-specific reaction that did not depend on.

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Abstract

　より毒性の低い臨床応用可能なトランスフェクション剤の提供。 　ペプチド界面活性剤を含むトランスフェクション剤。

Description

トランスフェクション剤
　本発明は、ペプチド界面活性剤を含むトランスフェクション剤に関する。
　ＲＮＡｉは、特定遺伝子の発現を抑制することができることから、疾患の処置への応用が期待されている。現在の技術では、ｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクションする際に用いられるトランスフェクション剤は、カチオン性のリン脂質が主体であり、その毒性が指摘されている。
　しかし、ｓｉＲＮＡをはじめとする核酸医薬の臨床における応用を考慮すると、トランスフェクション剤は、限りなく毒性が低いことが望まれ、より毒性の低いトランスフェクション剤の開発が待たれている。
　ペプチド界面活性剤は、Ｇタンパク質結合レセプターウシロドプシンなどの膜タンパク質を安定させる作用や自己組織化する性質を有することが知られている（非特許文献１及び２）。しかし、トランスフェクション剤としての用途は知られていなかった。
X Zhao et al., PNAS, Vol.103, No. 47, 17707-17712 A Nagai et al., J. Nanosci. Nanotechnol. Vol. 7, No.7, 1-7
　本発明が解決しようとする課題は、より毒性の低い臨床応用可能なトランスフェクション剤を提供することである。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、ペプチド界面活性剤がトランスフェクション剤として有用であることを見出し、本発明を完成させた。
　したがって、本発明は、
　１．ペプチド界面活性剤を含むトランスフェクション剤、
　２．ペプチド界面活性剤が、４～１０の親水性アミノ酸からなる頭部及び１又は２の疎水性アミノ酸からなる尾部からなる、上記１に記載のトランスフェクション剤、
　３．ペプチド界面活性剤が、ＡＡＡＡＡＡＤ又はＡＡＡＡＡＡＫである、上記１に記載のトランスフェクション剤、
　４．上記１～３のいずれか１に記載のトランスフェクション剤及び核酸を含む、医薬品、
である。
ペプチド界面活性剤とカチオン性リポソーム遺伝子導入剤（リポフェクトアミン2000、siFECTOR）の細胞毒性比較である。 ペプチド界面活性剤によるｓｉＲＮＡのヒト悪性グリオーマ培養細胞3種への導入量の経時変化解析である。 ペプチド界面活性剤濃度とｓｉＲＮＡ導入効率の関係の解析である。 ペプチド界面活性剤によってヒト悪性グリオーマ培養細胞3種に導入されたｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉効果の確認である。 ペプチド界面活性剤によってヒト悪性グリオーマ培養細胞3種に導入されたｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉効果の確認である。 ペプチド界面活性剤によってヒト悪性グリオーマ培養細胞3種に導入されたｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉効果の確認である。
　本発明において、ペプチド界面活性剤とは、６～１０個のアミノ酸残基を含むものであり、その長さは、約２～３nmであり、従来の界面活性剤、たとえば、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（ＤＭ）やオクチル－Ｄ－グルコシド（ＯＧ）と同様の特性を示す。
　本発明のペプチド界面活性剤は、好ましくは、４～１０の親水性アミノ酸からなる頭部及び１又は２の疎水性アミノ酸からなる尾部からなる。
　より具体的には、ＧＧＧＧＤＤ（Ｇ４Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ６Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ８Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ１０Ｄ２）、ＡＡＡＡＡＡＤ（Ａ６Ｄ）、ＡＡＡＡＡＡＤＤ（Ａ６Ｄ２）、ＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋ）、ＡＡＡＡＡＡＫＫ（Ａ６Ｋ２）、ＶＶＶＶＶＶＤ（Ｖ６Ｄ）、ＶＶＶＶＶＶＤＤ（Ｖ６Ｄ２）、ＶＶＶＶＶＶＫ（Ｖ６Ｋ）、ＶＶＶＶＶＶＫＫ（Ｖ６Ｋ２）、ＬＬＬＬＬＬＤ（Ｌ６Ｄ）、ＬＬＬＬＬＬＤＤ（Ｌ６Ｄ２）、ＬＬＬＬＬＬＫ（Ｌ６Ｋ）、又はＬＬＬＬＬＬＫＫ（Ｌ６Ｋ２）を挙げることができるが、中でも、ＡＡＡＡＡＡＤ（Ａ６Ｄ）又はＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋ）が好ましく、ＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋ）が特に好ましい。
　本発明のペプチド界面活性剤は、従来公知の固相合成法を用いて製造することができる。またこのような、人工的に合成されたペプチドは、生体由来の物質を含まず、感染性の心配がないことから、好ましく用いることができる。
　本発明において、トランスフェクション剤とは、ｓｉＲＮＡ等のポリヌクレオチドや遺伝子を細胞内に導入する際に用い、その導入効率を高めることができる組成物をいう。
　本発明のトランスフェクション剤は、所望の核酸とともに、医薬品に配合することができる。また、本発明の医薬品は、経口投与または非経口投与のいずれにおいても使用することができる。
　本発明の医薬品に用いる核酸は、治療などの標的となる遺伝子の塩基配列の一部をそのまま又は修飾して使うものであり、ＤＮＡまたはＲＮＡの核酸から構成されており、生体内において、所望の遺伝子の機能を制御することができるものをいう。このような核酸は、一般には、核酸医薬として知られている。
　たとえば、転写調節因子が結合する核内のＤＮＡの一定領域（シスエレメント）と同じ配列のオリゴヌクレオチドに転写調節因子を結合させることにより遺伝子発現を阻害する薬をおとり型核酸医薬（デコイ）、特定の分子と特異的に結合することができる核酸アプタマー、ＲＮＡを切断する触媒活性があるリボザイム、標的遺伝子のｍＲＮＡの特定領域に相補的に結合して遺伝子発現を抑制するアンチセンスＲＮＡや標的遺伝子のｍＲＮＡの特定領域にＲＮＡサイレンシング複合体と共に結合することでｍＲＮＡを分解するｓｉＲＮＡを挙げることができる。おとり型核酸医薬、核酸アプタマー、リボザイムは高度に特異的な３次元構造を取る核酸で、アンチセンスＲＮＡはｍＲＮＡ配列の一部の逆鎖側の配列を持つ一本鎖ＲＮＡオリゴマーで、ｓｉＲＮＡは標的遺伝子のｍＲＮＡの一部と同じ配列を有する短い二本鎖ＲＮＡである。これらの核酸は、核酸合成機を用いて化学的反応により人工的に作ることができ、またベクターを用いて培養細胞で作ることもできる。
　これまでの医薬品は低分子化合物が主流であったが、現在、生体が持つ化学物質から成るバイオ医薬品が、その標的特異性と生物学的安全性の点で注目されている。バイオ医薬品の一つには核酸医薬が含まれ、現在多くの研究機関や製薬企業で開発が進められている。核酸医薬の中でも近年特にｓｉＲＮＡの特異的な遺伝子抑制効果が注目されており、様々な疾患に対するｓｉＲＮＡ医薬品の開発が進められている。ｓｉＲＮＡを用いることで治療効果が見込まれる例として、脳腫瘍の１種である膠芽腫の治療が挙げられる。膠芽腫において、ＭＭＰ－２を標的としたＲＮＡiによって腫瘍細胞のアポトーシスが誘導され、腫瘍成長が抑制される効果が知られている。
　医薬品の形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤などが挙げられる。これら医薬品は、通常の医薬製造における添加剤を使用して製造することができる。
　本発明の医薬品の投与量は特に限定されないが、たとえば、非経口投与の場合には一日あたり０．００１～１０ｍｇ／ｋｇ体重である。上記投与量は１日１回または２～３回に分けて投与することができ、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。
　添加剤の具体例としては、ラクトース、デキストリン、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ソルビトール、結晶性セルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられ、これらを単独または適宜組合わせて使用することができる。これら医薬品は、日本薬局方の記載に従い、各々の医薬品の形態に適した方法で製造することができる。また、香味料、着色料、甘味料など適宜使用することもできる。これら添加剤の含有量は当業者に適切に選択され得る。
　医薬部外品の形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ゼリー剤、ドリンク剤などが挙げられる。これら医薬部外品は、通常の医薬部外品製造における添加剤を使用して製造することができる。さらに、これら医薬部外品は、例えばビタミン類などの他の有効成分を含有することもできる。また、甘味料、香味料、着色料、酸化防止剤などの添加剤を単独または適宜組み合わせて使用することもできる。これら医薬部外品は、当業者に周知の方法で製造することができる。
　ペプチド界面活性剤とカチオン性リポソーム遺伝子導入剤の細胞毒性比較
　ペプチド界面活性剤と現在広く使用されているカチオン性リポソーム遺伝子導入剤２種について、ヒト培養細胞を用いて細胞毒性評価を行った。
＜材料＞
・添加物質
１．ペプチド界面活性剤（配列：Ａｃ－ＡＡＡＡＡＡＫ－ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製）
２．リポフェクトアミン2000(インビトロジェン社製)
３．siFECTOR (B-Bridge International, Inc.社製)
・細胞
ヒト悪性グリオーマ培養細胞（U87MG、ＡＴＣＣから購入）
・ＭＴＴアッセイ試薬（細胞増殖数定量）
CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assayキット（プロメガ社製）
＜方法＞
　ＡＴＣＣ推奨プロトコルに従って、細胞を９６ウェルプレートに播種し（細胞密度：２×１０４／well）、一晩インキュベーションした。新鮮な培地に交換し、添加物質を添加した（最終濃度：0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500μg/ml）。細胞を２４時間培養した。その後、CellTiter 96 Aqueous One Solutionを添加（２０μl／well）し、４時間後、プレートリーダーで４９５nmの吸光光度を測定し、生存細胞数の定量を行った。
　図１から明らかなとおり、ペプチド界面活性剤の毒性が最も低かった。ＬＤ５０は、ペプチド界面活性剤が２８５．９μg/ml、リポフェクトアミン2000が４２．４９μg/ml、siFECTORが２５．３μg/mlであった。ペプチド界面活性剤は２５μg/ml以下では細胞毒性を示さなかった。
ペプチド界面活性剤による細胞へのｓｉＲＮＡ導入の確認
　ペプチド界面活性剤によってｓｉＲＮＡが細胞に導入されたことを、蛍光標識したｓｉＲＮＡを顕微鏡観察することで確認した。
＜材料＞
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ－ＡＡＡＡＡＡＫ－ＮＨ２、Celtek社製
・ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ／ＭＭＰ－２、Santa Cruz社製
・ｓｉＲＮＡ蛍光標識試薬
Label IT Cy-3 Labelling Kit、Mirus社製
・細胞
ヒト悪性グリオーマ培養細胞3種（Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１ＭＧ、それぞれＡＴＣＣから購入）
＜方法＞
　Mirus社プロトコルに従い、ｓｉＲＮＡ／ＭＭＰ－２にｓｉＲＮＡ蛍光標識試薬でＣｙ３を標識した。ＡＴＣＣのプロトコルに従い、培養チャンバー付きスライドグラス（Chambered slide glass）に５０００個の細胞を播種し一晩置いた。培地を除去し、最終濃度がｓｉＲＮＡ　５０nM、ペプチド界面活性剤２０μg/mlとなるよう、培地１mlに加え、８時間培養を行った。対照群は、ｓｉＲＮＡのみを最終濃度が５０nMとなるよう、培地１mlで培養を行った。倒立蛍光顕微鏡で、Ｃｙ３用のフィルターでの蛍光観察と明視での観察を行った。
＜結果＞
　３種の細胞すべてにおいて、ペプチド界面活性剤とｓｉＲＮＡの両方を加えた試験群でＣｙ３標識したｓｉＲＮＡ　の取り込みが確認された。ｓｉＲＮＡのみを加えた対照群では、いずれの細胞においても標識されたｓｉＲＮＡの取り込みは認められなかった。
ペプチド界面活性剤によるｓｉＲＮＡの細胞への導入量の経時変化解析
　ペプチド界面活性剤による細胞へのｓｉＲＮＡ導入量の経時的変化を、蛍光標識したｓｉＲＮＡを顕微鏡観察することで検討した。
＜材料＞
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ－ＡＡＡＡＡＡＫ－ＮＨ２、Celtek社製
・ペプチド界面活性剤濃度
0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、25.0μg/mL
・ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ／ＭＭＰ－２、Santa Cruz社製
・ｓｉＲＮＡ蛍光標識試薬
Label IT Cy-3 Labelling Kit、Mirus社製
・細胞
ヒト悪性グリオーマ培養細胞3種（U87MG、T98G、U251MG、ＡＴＣＣから購入）
＜方法＞
　Ｍｉｒｕｓ社標準プロトコルに従い、ｓｉＲＮＡ／ＭＭＰ－２にｓｉＲＮＡ蛍光標識試薬でＣｙ３を標識した。ラベルしたｓｉＲＮＡをペプチド界面活性剤と混合した。培地が１ml/well入った24wellプレートに播種した１×１０５個の細胞に対して、最終濃度がｓｉＲＮＡは５０nM、ペプチド界面活性剤は２０μg/mlになるよう投与して、０．５、１、２、４、８、１６及び２４時間培養した。ＰＢＳでウェルを洗浄後、細胞を回収して９６ウェルプレートに移して蛍光光度を測定した。
　結果を図２に示した。
・培養１～８時間では、相対蛍光単位（ＲＦＵ）がほぼ比例的に増加し、時間に比例してｓｉＲＮＡが細胞に取り込まれることがわかった。
・培養８時間以降は、ほとんどプラトーに達していた。
ペプチド界面活性剤濃度とｓｉＲＮＡ導入効率の関係の解析
　ｓｉＲＮＡの細胞への導入効率がペプチド界面活性剤濃度にどのように依存するかを、蛍光標識したｓｉＲＮＡを顕微鏡観察することで検討した。
＜材料＞
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ－ＡＡＡＡＡＡＫ－ＮＨ２、Celtek社製
・ペプチド界面活性剤濃度
0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、25.0μg/mL
・ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ／ＭＭＰ－２、Santa Cruz社製
・siRNA蛍光標識試薬
Label IT Cy-3 Labelling Kit、Mirus社製
・細胞
ヒト悪性グリオーマ培養細胞3種（U87MG、T98G、U251MG、ＡＴＣＣから購入）
＜方法＞
　Ｍｉｒｕｓ社標準プロトコルに従い、ｓｉＲＮＡ／ＭＭＰ－２にｓｉＲＮＡ蛍光標識試薬でＣｙ３を標識した。ラベルしたｓｉＲＮＡ　をペプチド界面活性剤と混合した。培地が１ml/well入った２４ウェルプレートに播種した１×１０５個の細胞に対して、最終濃度がｓｉＲＮＡは５０nM、ペプチド界面活性剤は0、0.5、1、5、10、20、25μg/mlになるよう投与して、８時間培養した。ＰＢＳでウェルを洗浄後、細胞を回収して９６ウェルプレートに移して蛍光光度を測定した。
　結果を図３に示した。
・Ｙ９８Ｇにおいて１０μg/ml以上で濃度依存的なＲＦＵの上昇が弱まったものの、３種すべての細胞で濃度の増加に比例したＲＦＵの増加が認められ、細胞へのｓｉＲＮＡの導入がペプチド界面活性剤の濃度に依存することが明らかとなった。
・実施例３の結果とあわせ、ペプチド界面活性剤を濃度が２０μg/mlで８時間細胞にさらすことで、十分有意にｓｉＲＮＡが細胞に導入されることが明らかになった。
ペプチド界面活性剤によって細胞に導入されたｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉効果の確認
　ペプチド界面活性剤によって細胞に導入されたｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉能力を持つことをＲＴ－ＰＣＲ法で確認を行った。
＜材料＞
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ－ＡＡＡＡＡＡＫ－ＮＨ２、Celtek社製
・細胞
ヒト悪性グリオーマ培養細胞3種（U87MG、T98G、U251MG、ＡＴＣＣから購入）
＜方法＞
　ＡＴＣＣ社の標準プロトコルに従って、２４ウェルプレートに細胞を１×１０５個播種し一晩培養した。培地を除去後、前記と同じ培養条件のところへ、最終濃度が以下になるよう次の溶液を入れて８時間培養した。
（１）コントロール（培地）
（２）スクランブルオリゴｓｉＲＮＡ(Dharmacon社製）／ペプチド界面活性剤２０μg/ml
（３）ｓｉＲＮＡ５０nM
（４）ペプチド界面活性剤２０μg/ml
（５）ｓｉＲＮＡ　５０ｎＭ／ペプチド界面活性剤２０μg/ml
　Taqman Gene Expression Cell-to-Ct Kit （アプライドバイオシステムズ社製）を用いてｓｉＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。Gene Expression Assay（アプライドバイオシステムズ社製）でＭＭＰ－２を標的とし、ベータアクチンを内部標準としてApplied Biosystems 7500リアルタイムＰＣＲシステムによって定量解析を行った。
　結果を図４－６に示した。
・ｓｉＲＮＡ　５０nM／ペプチド界面活性剤２０μg/mlを投与したもののみで有意にＭＭＰ－２　ｍＲＮＡの発現が抑制されていた。
・ｓｉＲＮＡのみでは細胞への導入効果がないことから、ペプチド界面活性剤のｓｉＲＮＡ導入効果によってｓｉＲＮＡが細胞内へ取り込まれ、その結果ＲＮＡ干渉効果が生じたと考えられた。
・ヒトゲノム中で相同性が認められない配列で構成され遺伝子に対する特異性のないスクランブルオリゴＲＮＡとペプチド界面活性剤を混合したものでは、ＭＭＰ－２遺伝子の抑制がみらないことから、ＲＮＡの配列に依存しない非特異的反応ではないと考えられた。

Claims (4)

  1. 　ペプチド界面活性剤を含むトランスフェクション剤。
  2. 　ペプチド界面活性剤が、４～１０の親水性アミノ酸からなる頭部及び１又は２の疎水性アミノ酸からなる尾部からなる、請求項１に記載のトランスフェクション剤。
  3. 　ペプチド界面活性剤が、ＡＡＡＡＡＡＤ又はＡＡＡＡＡＡＫである、請求項１に記載のトランスフェクション剤。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のトランスフェクション剤及び核酸を含む、医薬品。
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