KR20110055693A

KR20110055693A - 트랜스펙션제

Info

Publication number: KR20110055693A
Application number: KR20117006882A
Authority: KR
Inventors: 다이조 요시다; 지로 타케이
Original assignee: 가부시끼가이샤 쓰리디 매트릭스; 각꼬호우징 닛뽄 이까다이가꾸
Priority date: 2008-08-27
Filing date: 2009-08-26
Publication date: 2011-05-25
Also published as: EP2322608A4; EP2322608B1; KR101647521B1; US20110152203A1; SG193822A1; CN102131926A; ES2491565T3; US9133484B2; JP5606318B2; JPWO2010024262A1; EP2322608A1; WO2010024262A1

Abstract

본 발명은 보다 독성이 낮은 임상 응용 가능한 트랜스펙션제를 제공한다. 또한 펩티드 계면활성제를 포함하는 트랜스펙션제이다.

Description

트랜스펙션제{TRANSFECTION AGENT}

본 발명은 펩티드 계면활성제를 포함하는 트랜스펙션제에 관한 것이다.

RNAi는 특정 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에, 질환 처치에 대한 응용이 기대되고 있다. 현재의 기술로는 siRNA를 세포에 트랜스펙션할 때에 이용되는 트랜스펙션제는 양이온성의 인지질이 주체인데, 그의 독성이 지적되고 있다.

그러나 siRNA를 비롯한 핵산 의약의 임상에서의 응용을 고려하면, 트랜스펙션제는 한없이 독성이 낮은 것이 요구되어, 보다 독성이 낮은 트랜스펙션제의 개발을 기대하고 있다.

펩티드 계면활성제는, G 단백질 결합 수용기, 소의 로돕신 등의 막단백질을 안정시키는 작용이나 자기조직화하는 성질을 갖는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1 및 2). 그러나 트랜스펙션제로서의 용도는 알려져 있지 않았다.

X Zhao et al., PNAS, Vol.103, No. 47, 17707-17712 A Nagai et al., J. Nanosci. Nanotechnol. Vol. 7, No.7, 1-7

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 보다 독성이 낮은 임상 응용 가능한 트랜스펙션제를 제공하는 것이다.

본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, 놀랍게도 펩티드 계면활성제가 트랜스펙션제로서 유용하다는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.

따라서, 본 발명은

1. 펩티드 계면활성제를 포함하는 트랜스펙션제,

2. 상기 1에 있어서, 펩티드 계면활성제가 4 내지 10의 친수성 아미노산으로 이루어지는 머리 부분 및 1 또는 2의 소수성 아미노산으로 이루어지는 꼬리 부분으로 이루어지는 트랜스펙션제,

3. 상기 1에 있어서, 펩티드 계면활성제가 AAAAAAD 또는 AAAAAAK인 트랜스펙션제,

4. 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 기재된 트랜스펙션제 및 핵산을 포함하는 의약품

이다.

[도 1] 펩티드 계면활성제와 양이온성 리포솜 유전자 도입제(리포펙트아민 2000, siFECTOR)의 세포 독성 비교이다.
[도 2] 펩티드 계면활성제에 의한 siRNA의 인간 악성 신경교종(glioma) 배양 세포 3종에 대한 도입량의 경시 변화 해석이다.
[도 3] 펩티드 계면활성제 농도와 siRNA 도입 효율 관계의 해석이다.
[도 4] 펩티드 계면활성제에 의해서 인간 악성 신경교종 배양 세포 3종에 도입된 siRNA에 의한 RNA 간섭 효과의 확인이다.
[도 5] 펩티드 계면활성제에 의해서 인간 악성 신경교종 배양 세포 3종에 도입된 siRNA에 의한 RNA 간섭 효과의 확인이다.
[도 6] 펩티드 계면활성제에 의해서 인간 악성 신경교종 배양 세포 3종에 도입된 siRNA에 의한 RNA 간섭 효과의 확인이다.

본 발명에서 펩티드 계면활성제란, 6 내지 10개의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로, 그 길이는 약 2 내지 3 nm이고, 종래의 계면활성제, 예를 들면 n-도데실-β-D-말토시드(DM)나 옥틸-D-글루코시드(OG)와 마찬가지의 특성을 나타낸다.

본 발명의 펩티드 계면활성제는, 바람직하게는 4 내지 10의 친수성 아미노산으로 이루어지는 머리 부분 및 1 또는 2의 소수성 아미노산으로 이루어지는 꼬리 부분으로 이루어진다.

보다 구체적으로는 GGGGDD(G4D2), GGGGGGDD(G6D2), GGGGGGGGDD(G8D2), GGGGGGGGGGDD(G10D2), AAAAAAD(A6D), AAAAAADD(A6D2), AAAAAAK(A6K), AAAAAAKK(A6K2), VVVVVVD(V6D), VVVVVVDD(V6D2), VVVVVVK(V6K), VVVVVVKK(V6K2), LLLLLLD(L6D), LLLLLLDD(L6D2), LLLLLLK(L6K) 또는 LLLLLLKK(L6K2)를 들 수 있지만, 그 중에서도 AAAAAAD(A6D) 또는 AAAAAAK(A6K)가 바람직하고, AAAAAAK(A6K)가 특히 바람직하다.

본 발명의 펩티드 계면활성제는 종래 공지된 고상 합성법을 이용하여 제조할 수 있다. 또 이러한 인공적으로 합성된 펩티드는 생체 유래의 물질을 포함하지 않으며, 감염성의 염려가 없기 때문에 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명에서 트랜스펙션제란, siRNA 등의 폴리뉴클레오티드나 유전자를 세포 내에 도입할 때에 이용하고, 그의 도입 효율을 높일 수 있는 조성물을 말한다.

본 발명의 트랜스펙션제는, 원하는 핵산과 동시에 의약품에 배합할 수 있다. 또한, 본 발명의 의약품은 경구 투여 또는 비경구 투여 중 어느 것도 사용할 수 있다.

본 발명의 의약품에 이용하는 핵산은, 치료 등의 표적이 되는 유전자의 염기 서열의 일부를 그대로 또는 수식하여 사용하는 것으로, DNA 또는 RNA의 핵산으로 구성되어 있고, 생체 내에서 원하는 유전자의 기능을 제어할 수 있는 것을 말한다. 이러한 핵산은, 일반적으로는 핵산 의약으로서 알려져 있다.

예를 들면, 전사 조절 인자가 결합하는 핵 내의 DNA의 일정 영역(시스 엘레멘트)과 동일한 배열의 올리고뉴클레오티드에 전사 조절 인자를 결합시킴으로써 유전자 발현을 저해하는 약을 미끼형 핵산 의약(데코이(decoy)), 특정한 분자와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 압타머(aptamer), RNA를 절단하는 촉매 활성이 있는 리보자임, 표적 유전자의 mRNA의 특정 영역에 상보적으로 결합하여 유전자 발현을 억제하는 안티센스 RNA나 표적 유전자의 mRNA의 특정 영역에 RNA 사일런싱 복합체와 함께 결합함으로써 mRNA를 분해하는 siRNA를 들 수 있다. 미끼형 핵산 의약, 핵산 압타머, 리보자임은 고도로 특이적인 3차원 구조를 취하는 핵산으로, 안티센스 RNA는 mRNA 배열의 일부 역쇄측의 배열을 갖는 단일 RNA 올리고머이고, siRNA는 표적유전자의 mRNA의 일부와 동일한 배열을 갖는 짧은 2중쇄 RNA이다. 이들 핵산은 핵산 합성기를 이용하여 화학적 반응에 의해 인공적으로 만들 수 있고, 또한 벡터를 이용하여 배양 세포로 만들 수도 있다.

지금까지의 의약품은 저분자 화합물이 주류였지만, 현재 생체가 갖는 화학 물질로 이루어지는 바이오 의약품이, 그의 표적 특이성과 생물학적 안전성 측면에서 주목받고 있다. 바이오 의약품 중 하나로는 핵산 의약이 포함되어, 현재 많은 연구 기관이나 제약 기업에서 개발이 진행되고 있다. 핵산 의약 중에서도 최근 특히 siRNA의 특이적인 유전자 억제 효과가 주목받고 있어, 다양한 질환에 대한 siRNA 의약품의 개발이 진행되고 있다. siRNA를 이용함으로써 치료 효과가 예상되는 예로서, 뇌종양의 일종인 교아종(膠芽腫)의 치료를 들 수 있다. 교아종에서, MMP-2를 표적으로 한 RNAi에 의해서 종양 세포의 아포토시스가 유도되어, 종양 성장이 억제되는 효과가 알려져 있다.

의약품의 형태로는 정제, 캡슐제, 과립제, 시럽제 등을 들 수 있다. 이들 의약품은, 통상의 의약 제조에서의 첨가제를 사용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 의약품의 투여량은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 비경구 투여의 경우에는 1일당 0.001 내지 10 mg/kg 체중이다. 상기 투여량은 1일 1회 또는 2 내지 3회로 나눠 투여할 수 있고, 연령, 병의 용태, 증상에 따라 적절하게 증감할 수도 있다.

첨가제의 구체예로는 락토오스, 덱스트린, 수크로오스, 만니톨, 옥수수 전분, 소르비톨, 결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 들 수 있고, 이들을 단독 또는 적절하게 조합하여 사용할 수 있다. 이들 의약품은 일본 약전의 기재에 따라, 각각의 의약품의 형태에 적합한 방법으로 제조할 수 있다. 또한, 향미료, 착색료, 감미료 등 적절하게 사용할 수도 있다. 이들 첨가제의 함유량은 당업자에게 적절히 선택될 수 있다.

의약 부외품의 형태로는 정제, 캡슐제, 과립제, 젤리제, 드링크제 등을 들 수 있다. 이들 의약 부외품은 통상의 의약 부외품 제조에서의 첨가제를 사용하여 제조할 수 있다. 또한, 이들 의약 부외품은, 예를 들면 비타민류 등의 다른 유효 성분을 함유할 수도 있다. 또한, 감미료, 향미료, 착색료, 산화 방지제 등의 첨가제를 단독으로 또는 적절하게 조합하여 사용할 수도 있다. 이들 의약 부외품은 당업자에게 주지된 방법으로 제조할 수 있다.

실시예 1

펩티드 계면활성제와 양이온성 리포솜 유전자 도입제의 세포 독성 비교

펩티드 계면활성제와 현재 널리 사용되고 있는 양이온성 리포솜 유전자 도입제 2종에 대해서, 인간 배양 세포를 이용하여 세포 독성 평가를 행하였다.

<재료>

·첨가 물질

1. 펩티드 계면활성제(배열: Ac-AAAAAAK-NH₂, 셀텍(Celtek)사 제조)

2. 리포펙트아민 2000(인비트로젠사 제조)

3. siFECTOR (비-브릿지 인터네셔날 인크(B-Bridge International, Inc.)사 제조)

·세포

인간 악성 신경교종 배양 세포(U87MG, ATCC에서 구입)

·MTT 어세이 시약(세포 증식수 정량)

셀타이터 96 에이퀴어스 원 솔루션 셀 프롤리퍼레이션 어세이 키트(CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit)(프로메가사 제조)

<방법>

ATCC 장려 프로토콜에 따라서, 세포를 96웰 플레이트에 파종하고(세포 밀도: 2×10⁴/웰), 밤새 인큐베이션하였다. 신선한 배지로 교환하고, 첨가 물질을 첨가하였다(최종 농도: 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ㎍/㎖). 세포를 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, 셀타이터 96 에이퀴어스 원 솔루션을 첨가(20 ㎕/웰)하고, 4 시간 후 플레이트 리더로 495 nm의 흡광 광도를 측정하고, 생존 세포수의 정량을 행하였다.

도 1로부터 명백한 바와 같이, 펩티드 계면활성제의 독성이 가장 낮았다. LD50은 펩티드 계면활성제가 285.9 ㎍/㎖, 리포펙트아민 2000이 42.49 ㎍/㎖, siFECTOR가 25.3 ㎍/㎖였다. 펩티드 계면활성제는 25 ㎍/㎖ 이하에서는 세포 독성을 나타내지 않았다.

실시예 2

펩티드 계면활성제에 의한 세포에의 siRNA 도입의 확인

펩티드 계면활성제에 의해서 siRNA가 세포에 도입된 것을 형광 표지한 siRNA를 현미경 관찰함으로써 확인하였다.

<재료>

·펩티드 계면활성제

배열: Ac-AAAAAAK-NH₂, 셀텍사 제조

·siRNA

siRNA/MMP-2, 산타 크루즈(Santa Cruz)사 제조

·siRNA 형광 표지 시약

라벨 IT Cy-3 라벨링 키트(Label IT Cy-3 Labelling Kit), 미러스(Mirus)사 제조

·세포

인간 악성 신경교종 배양 세포 3종(U87MG, T98G, U251MG, 각각 ATCC에서 구입)

<방법>

미러스사 프로토콜에 따라서, siRNA/MMP-2에 siRNA 형광 표지 시약으로 Cy3을 표지하였다. ATCC의 프로토콜에 따라서, 배양 챔버가 장착된 슬라이드 글라스(Chambered slide glass)에 5000개의 세포를 파종하고 밤새 놓았다. 배지를 제거하고, 최종 농도가 siRNA 50 nM, 펩티드 계면활성제 20 ㎍/㎖가 되도록 배지 1 ㎖에 가하고, 8 시간 동안 배양을 행하였다. 대조군은 siRNA만을 최종 농도가 50 nM이 되도록, 배지 1 ㎖에서 배양을 행하였다. 도립 형광 현미경으로, Cy3용 필터에서의 형광 관찰과 명시에서의 관찰을 행하였다.

<결과>

3종의 세포 모두에서, 펩티드 계면활성제와 siRNA를 모두 가한 시험군에서 Cy3 표지한 siRNA의 도입이 확인되었다. siRNA만을 가한 대조군에서는, 어느 세포에서도 표지된 siRNA의 도입은 인정되지 않았다.

실시예 3

펩티드 계면활성제에 의한 siRNA의 세포에의 도입량의 경시 변화 해석

펩티드 계면활성제에 의한 세포에의 siRNA 도입량의 경시적 변화를, 형광 표지한 siRNA를 현미경 관찰함으로써 검토하였다.

<재료>

·펩티드 계면활성제

배열: Ac-AAAAAAK-NH₂, 셀텍사 제조

·펩티드 계면활성제 농도

0, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 25.0 ㎍/㎖

·siRNA

siRNA/MMP-2, 산타 크루즈사 제조

·siRNA 형광 표지 시약

라벨 IT Cy-3 라벨링 키트, 미러스사 제조

·세포

인간 악성 신경교종 배양 세포 3종(U87MG, T98G, U251MG, ATCC에서 구입)

<방법>

미러스사 표준 프로토콜에 따라서, siRNA/MMP-2에 siRNA 형광 표지 시약으로 Cy3을 표지하였다. 라벨한 siRNA를 펩티드 계면활성제와 혼합하였다. 배지가 1 ㎖/웰 포함된 24웰 플레이트에 파종한 1×10⁵개의 세포에 대하여, 최종 농도가 siRNA는 50 nM, 펩티드 계면활성제는 20 ㎍/㎖가 되도록 투여하여 0.5, 1, 2, 4, 8, 16 및 24 시간 동안 배양하였다. PBS에서 웰을 세정한 후, 세포를 회수하여 96웰 플레이트에 옮겨 형광 광도를 측정하였다.

결과를 도 2에 나타내었다.

·배양 1 내지 8 시간 동안에는, 상대 형광 단위(RFU)가 거의 비례적으로 증가하고, 시간에 비례하여 siRNA가 세포에 도입되는 것을 알 수 있었다.

·배양 8 시간 이후에는, 거의 플래토(plateau)에 도달하고 있었다.

실시예 4

펩티드 계면활성제 농도와 siRNA 도입 효율의 관계의 해석

siRNA의 세포에의 도입 효율이 펩티드 계면활성제 농도에 어떻게 의존하는지를, 형광 표지한 siRNA를 현미경 관찰함으로써 검토하였다.

<재료>

·펩티드 계면활성제

배열: Ac-AAAAAAK-NH₂, 셀텍사 제조

·펩티드 계면활성제 농도

0, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 25.0 ㎍/㎖

·siRNA

siRNA/MMP-2, 산타 크루즈사 제조

·siRNA 형광 표지 시약

라벨 IT Cy-3 라벨링 키트, 미러스사 제조

·세포

<방법>

미러스사 표준 프로토콜에 따라서, siRNA/MMP-2에 siRNA 형광 표지 시약으로 Cy3을 표지하였다. 라벨한 siRNA 를 펩티드 계면활성제와 혼합하였다. 배지가 1 ㎖/웰 포함된 24웰 플레이트에 파종한 1×10⁵개의 세포에 대하여, 최종 농도가 siRNA는 50 nM, 펩티드 계면활성제는 0, 0.5, 1, 5, 10, 20, 25 ㎍/㎖가 되도록 투여하여 8 시간 동안 배양하였다. PBS에서 웰을 세정한 후, 세포를 회수하여 96웰 플레이트에 옮겨 형광 광도를 측정하였다.

결과를 도 3에 나타내었다.

·Y98G에 있어서 10 ㎍/㎖ 이상에서 농도 의존적인 RFU의 상승이 약해졌지만, 3종 모든 세포에서 농도의 증가에 비례한 RFU의 증가가 인정되고, 세포에의 siRNA의 도입이 펩티드 계면활성제의 농도에 의존하는 것이 명백해졌다.

·실시예 3의 결과와 합쳐, 펩티드 계면활성제를 농도가 20 ㎍/㎖일 때 8 시간 동안 세포에 노출함으로써, 충분히 유의하게 siRNA가 세포에 도입되는 것이 명백해졌다.

실시예 5

펩티드 계면활성제에 의해서 세포에 도입된 siRNA에 의한 RNA 간섭 효과의 확인

펩티드 계면활성제에 의해서 세포에 도입된 siRNA가 RNA 간섭 능력을 갖는 것을 RT-PCR법으로 확인하였다.

<재료>

·펩티드 계면활성제

배열: Ac-AAAAAAK-NH₂, 셀텍사 제조

·세포

<방법>

ATCC사의 표준 프로토콜에 따라서, 24웰 플레이트에 세포를 1×10⁵개 파종하고 밤새 배양하였다. 배지를 제거한 후, 상기와 동일한 배양 조건인 곳에 최종 농도가 이하가 되도록 다음 용액을 넣어 8 시간 동안 배양하였다.

(1) 대조군(배지)

(2) 스크램블 올리고 siRNA(다마콘(Dharmacon)사 제조)/펩티드 계면활성제 20 ㎍/㎖

(3) siRNA 50 nM

(4) 펩티드 계면활성제 20 ㎍/㎖

(5) siRNA 50 nM/펩티드 계면활성제 20 ㎍/㎖

태퀴먼 진 익스프레션 셀-투-Ct 키트(Taqman Gene Expression Cell-to-Ct kit)(어플라이드 바이오시스템스사 제조)를 이용하여 siRNA를 cDNA에 역전사하였다. 진 익스프레션 어세이(Gene Expression Assay)(어플라이드 바이오시스템스사 제조)에서 MMP-2를 표적으로 하고, 베타악틴을 내부 표준으로 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 7500 리얼 타임 PCR 시스템에 의해서 정량 해석을 행하였다.

결과를 도 4 내지 6에 나타내었다.

·siRNA 50 nM/펩티드 계면활성제 20 ㎍/㎖를 투여한 것만으로 유의하게 MMP-2 mRNA의 발현이 억제되어 있었다.

·siRNA만으로는 세포에의 도입 효과가 없기 때문에, 펩티드 계면활성제의 siRNA 도입 효과에 의해서 siRNA가 세포 내에 도입되고, 그 결과 RNA 간섭 효과가 발생하였다고 생각되었다.

·인간 게놈 중에서 상동성이 인정되지 않는 배열로 구성되어 유전자에 대한 특이성이 없는 스크램블 올리고 RNA와 펩티드 계면활성제를 혼합한 것으로는, MMP-2 유전자의 억제가 보이지 않기 때문에, RNA의 배열에 의존하지 않는 비특이적 반응은 아니라고 생각되었다.

SEQUENCE LISTING <110> 3-D Matrix, Ltd. <120> Transfection agent <130> FP3220PCT <160> 16 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized peptide <400> 1 Gly Gly Gly Gly Asp Asp 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized peptide <400> 2 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Asp 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized peptide <400> 3 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Asp 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized peptide <400> 4 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Asp 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized peptide <400> 5 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized peptide <400> 6 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Asp 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized peptide <400> 7 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized peptide <400> 8 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Lys 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized peptide <400> 9 Val Val Val Val Val Val Asp 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized peptide <400> 10 Val Val Val Val Val Val Asp Asp 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized peptide <400> 11 Val Val Val Val Val Val Lys 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized peptide <400> 12 Val Val Val Val Val Val Lys Lys 1 5 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized peptide <400> 13 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Asp 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized peptide <400> 14 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Asp Asp 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized peptide <400> 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Lys 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthesized peptide <400> 16 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Lys Lys 1 5

Claims

펩티드 계면활성제를 포함하는 트랜스펙션제.
제1항에 있어서, 펩티드 계면활성제가 4 내지 10의 친수성 아미노산으로 이루어지는 머리 부분 및 1 또는 2의 소수성 아미노산으로 이루어지는 꼬리 부분으로 이루어지는 트랜스펙션제.
제1항에 있어서, 펩티드 계면활성제가 AAAAAAD 또는 AAAAAAK인 트랜스펙션제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 트랜스펙션제 및 핵산을 포함하는 의약품.