JPWO2010024262A1 - トランスフェクション剤 - Google Patents
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Abstract
Description
X Zhao et al., PNAS, Vol.103, No. 47, 17707-17712 A Nagai et al., J. Nanosci. Nanotechnol. Vol. 7, No.7, 1-7
1.ペプチド界面活性剤を含むトランスフェクション剤、
2.ペプチド界面活性剤が、4〜10の親水性アミノ酸からなる頭部及び1又は2の疎水性アミノ酸からなる尾部からなる、上記1に記載のトランスフェクション剤、
3.ペプチド界面活性剤が、AAAAAAD又はAAAAAAKである、上記1に記載のトランスフェクション剤、
4.上記1〜3のいずれか1に記載のトランスフェクション剤及び核酸を含む、医薬品、
である。
ペプチド界面活性剤と現在広く使用されているカチオン性リポソーム遺伝子導入剤2種について、ヒト培養細胞を用いて細胞毒性評価を行った。
・添加物質
1.ペプチド界面活性剤(配列:Ac−AAAAAAK−NH2、Celtek社製)
2.リポフェクトアミン2000(インビトロジェン社製)
3.siFECTOR (B-Bridge International, Inc.社製)
・細胞
ヒト悪性グリオーマ培養細胞(U87MG、ATCCから購入)
・MTTアッセイ試薬(細胞増殖数定量)
CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assayキット(プロメガ社製)
ATCC推奨プロトコルに従って、細胞を96ウェルプレートに播種し(細胞密度:2×104/well)、一晩インキュベーションした。新鮮な培地に交換し、添加物質を添加した(最終濃度:0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500μg/ml)。細胞を24時間培養した。その後、CellTiter 96 Aqueous One Solutionを添加(20μl/well)し、4時間後、プレートリーダーで495nmの吸光光度を測定し、生存細胞数の定量を行った。
ペプチド界面活性剤によってsiRNAが細胞に導入されたことを、蛍光標識したsiRNAを顕微鏡観察することで確認した。
・ペプチド界面活性剤
配列:Ac−AAAAAAK−NH2、Celtek社製
・siRNA
siRNA/MMP−2、Santa Cruz社製
・siRNA蛍光標識試薬
Label IT Cy-3 Labelling Kit、Mirus社製
・細胞
ヒト悪性グリオーマ培養細胞3種(U87MG、T98G、U251MG、それぞれATCCから購入)
<方法>
Mirus社プロトコルに従い、siRNA/MMP−2にsiRNA蛍光標識試薬でCy3を標識した。ATCCのプロトコルに従い、培養チャンバー付きスライドグラス(Chambered slide glass)に5000個の細胞を播種し一晩置いた。培地を除去し、最終濃度がsiRNA 50nM、ペプチド界面活性剤20μg/mlとなるよう、培地1mlに加え、8時間培養を行った。対照群は、siRNAのみを最終濃度が50nMとなるよう、培地1mlで培養を行った。倒立蛍光顕微鏡で、Cy3用のフィルターでの蛍光観察と明視での観察を行った。
3種の細胞すべてにおいて、ペプチド界面活性剤とsiRNAの両方を加えた試験群でCy3標識したsiRNA の取り込みが確認された。siRNAのみを加えた対照群では、いずれの細胞においても標識されたsiRNAの取り込みは認められなかった。
ペプチド界面活性剤による細胞へのsiRNA導入量の経時的変化を、蛍光標識したsiRNAを顕微鏡観察することで検討した。
・ペプチド界面活性剤
配列:Ac−AAAAAAK−NH2、Celtek社製
・ペプチド界面活性剤濃度
0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、25.0μg/mL
・siRNA
siRNA/MMP−2、Santa Cruz社製
・siRNA蛍光標識試薬
Label IT Cy-3 Labelling Kit、Mirus社製
・細胞
ヒト悪性グリオーマ培養細胞3種(U87MG、T98G、U251MG、ATCCから購入)
Mirus社標準プロトコルに従い、siRNA/MMP−2にsiRNA蛍光標識試薬でCy3を標識した。ラベルしたsiRNAをペプチド界面活性剤と混合した。培地が1ml/well入った24wellプレートに播種した1×105個の細胞に対して、最終濃度がsiRNAは50nM、ペプチド界面活性剤は20μg/mlになるよう投与して、0.5、1、2、4、8、16及び24時間培養した。PBSでウェルを洗浄後、細胞を回収して96ウェルプレートに移して蛍光光度を測定した。
・培養1〜8時間では、相対蛍光単位(RFU)がほぼ比例的に増加し、時間に比例してsiRNAが細胞に取り込まれることがわかった。
・培養8時間以降は、ほとんどプラトーに達していた。
siRNAの細胞への導入効率がペプチド界面活性剤濃度にどのように依存するかを、蛍光標識したsiRNAを顕微鏡観察することで検討した。
・ペプチド界面活性剤
配列:Ac−AAAAAAK−NH2、Celtek社製
・ペプチド界面活性剤濃度
0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、25.0μg/mL
・siRNA
siRNA/MMP−2、Santa Cruz社製
・siRNA蛍光標識試薬
Label IT Cy-3 Labelling Kit、Mirus社製
・細胞
ヒト悪性グリオーマ培養細胞3種(U87MG、T98G、U251MG、ATCCから購入)
Mirus社標準プロトコルに従い、siRNA/MMP−2にsiRNA蛍光標識試薬でCy3を標識した。ラベルしたsiRNA をペプチド界面活性剤と混合した。培地が1ml/well入った24ウェルプレートに播種した1×105個の細胞に対して、最終濃度がsiRNAは50nM、ペプチド界面活性剤は0、0.5、1、5、10、20、25μg/mlになるよう投与して、8時間培養した。PBSでウェルを洗浄後、細胞を回収して96ウェルプレートに移して蛍光光度を測定した。
・Y98Gにおいて10μg/ml以上で濃度依存的なRFUの上昇が弱まったものの、3種すべての細胞で濃度の増加に比例したRFUの増加が認められ、細胞へのsiRNAの導入がペプチド界面活性剤の濃度に依存することが明らかとなった。
・実施例3の結果とあわせ、ペプチド界面活性剤を濃度が20μg/mlで8時間細胞にさらすことで、十分有意にsiRNAが細胞に導入されることが明らかになった。
ペプチド界面活性剤によって細胞に導入されたsiRNAがRNA干渉能力を持つことをRT−PCR法で確認を行った。
・ペプチド界面活性剤
配列:Ac−AAAAAAK−NH2、Celtek社製
・細胞
ヒト悪性グリオーマ培養細胞3種(U87MG、T98G、U251MG、ATCCから購入)
ATCC社の標準プロトコルに従って、24ウェルプレートに細胞を1×105個播種し一晩培養した。培地を除去後、前記と同じ培養条件のところへ、最終濃度が以下になるよう次の溶液を入れて8時間培養した。
(1)コントロール(培地)
(2)スクランブルオリゴsiRNA(Dharmacon社製)/ペプチド界面活性剤20μg/ml
(3)siRNA50nM
(4)ペプチド界面活性剤20μg/ml
(5)siRNA 50nM/ペプチド界面活性剤20μg/ml
Taqman Gene Expression Cell-to-Ct Kit (アプライドバイオシステムズ社製)を用いてsiRNAをcDNAに逆転写した。Gene Expression Assay(アプライドバイオシステムズ社製)でMMP−2を標的とし、ベータアクチンを内部標準としてApplied Biosystems 7500リアルタイムPCRシステムによって定量解析を行った。
・siRNA 50nM/ペプチド界面活性剤20μg/mlを投与したもののみで有意にMMP−2 mRNAの発現が抑制されていた。
・siRNAのみでは細胞への導入効果がないことから、ペプチド界面活性剤のsiRNA導入効果によってsiRNAが細胞内へ取り込まれ、その結果RNA干渉効果が生じたと考えられた。
・ヒトゲノム中で相同性が認められない配列で構成され遺伝子に対する特異性のないスクランブルオリゴRNAとペプチド界面活性剤を混合したものでは、MMP−2遺伝子の抑制がみらないことから、RNAの配列に依存しない非特異的反応ではないと考えられた。
Claims (4)
- ペプチド界面活性剤を含むトランスフェクション剤。
- ペプチド界面活性剤が、4〜10の親水性アミノ酸からなる頭部及び1又は2の疎水性アミノ酸からなる尾部からなる、請求項1に記載のトランスフェクション剤。
- ペプチド界面活性剤が、AAAAAAD又はAAAAAAKである、請求項1に記載のトランスフェクション剤。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のトランスフェクション剤及び核酸を含む、医薬品。
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