CN106539821A - 一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用。本发明公开了一种干细胞外泌体制剂，包括：牙髓干细胞外泌体、牙髓干细胞、人血白蛋白和溶剂；所述牙髓干细胞外泌体为从牙髓干细胞提取的外泌体；每5mL所述制剂含有从1×106～1×107个所述牙髓干细胞提取的外泌体；所述牙髓干细胞的含量为5×106个/5mL；所述人血白蛋白的质量浓度为2～8％；所述溶剂为生理盐水。本发明还公开了所述外泌体制剂的制备方法和所述牙髓干细胞外泌体的制备方法。本发明还公开了所述的外泌体制剂或所述制备方法制得的外泌体制剂在制备治疗肾炎的生物制剂中的应用。本发明公开的干细胞外泌体制剂对肾炎具有良好的疗效。

Description

一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用。
背景技术
外泌体(exosomes)是一种由真核细胞的多泡内涵体(multivesicular bodies，MVBs)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的纳米量级的膜性小囊泡，可由多种类型细胞分泌，其内含有不同种类的蛋白质、脂质、mRNAs、microRNAs、信号分子等具有生物学活性的物质，较易与邻近细胞的细胞膜发生融合，将生物学活性物质选择性地递送至受体细胞，在不同细胞间进行信息传递，调节细胞间的信号传导，发挥多种生物学功能。
肾脏的生理功能主要是排泄代谢产物及调节水、电解质和酸碱平衡，分泌多种活性物质，维持机体内环境稳定，以保证机体的正常生理功能。肾炎是由免疫介导的、炎症介质(如补体、细胞因子、活性氧等)参与的，最后导致肾固有组织发生炎性改变，引起不同程度肾功能减退的一组肾脏疾病，可由多种病因引起。在慢性过程中也有非免疫、非炎症机制参与。治疗原则包括去除诱因，一般治疗，针对病因和发病机制的治疗，合并症及并发症的治疗和肾脏替代治疗。1.一般治疗：包括避免劳累，去除感染等诱因，避免接触肾毒性药物或毒物，采取健康的生活方式(如戒烟、适量运动和控制情绪等)以及合理的饮食。急性期应卧床休息，待临床症状好转后逐步增加活动量。急性期应给予低盐饮食(每日3g以下)。肾功能正常者不需要限制蛋白质入量，但氮质血症时应限制蛋白质摄入，并以优质动物蛋白为主。少尿者应限制液体入量。2.针对病因和发病机制的治疗：针对免疫发病机制的治疗，常包括糖皮质激素及免疫抑制剂治疗。血液净化治疗如血浆置换、免疫吸附等有效清除体内自身抗体和抗原-抗体复合物。针对非免疫发病机制的治疗，包括高血压、高血脂、高血糖、高尿酸血症、肥胖、蛋白尿及肾内高凝状态、肾素-血管紧张素系统激活、氧化应激等治疗。肾素-血管紧张素系统阻滞剂，如ACEI/ARB是延缓肾脏病进展最重要的治疗措施之一。3.合并症及并发症的治疗：肾脏病患者常存在多种合并症，如代谢异常、高血压、冠心病、心力衰竭和肝硬化等都可能加重肾脏病的进展，应积极治疗。
对肾炎常用药物或手术治疗，治疗效果一般，对病人产生的创伤较大。且目前的治疗方法，只能对肾炎起到缓解作用，并不能从根本上根治疾病。因此，研发一种可用于治疗肾炎的外泌体制剂是本领域技术人员需要解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明公开了一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用。
本发明公开了一种外泌体制剂，包括：牙髓干细胞外泌体、牙髓干细胞、人血白蛋白和溶剂；
所述牙髓干细胞外泌体为从牙髓干细胞提取的外泌体；
每5mL所述制剂含有从1×106～1×107个所述牙髓干细胞提取的外泌体；
所述牙髓干细胞的含量为5×106个/5mL；
所述人血白蛋白的质量浓度为2～8％；
所述溶剂为生理盐水。
本发明还公开了上述外泌体制剂的制备方法，包括以下步骤：
往溶剂中添加人血白蛋白，制成人血白蛋白质量浓度为2～8％的人血白蛋白溶液；然后往所述人血白蛋白溶液中添加所述牙髓干细胞外泌体，使每5mL所述制剂中含有从1×106～1×107个牙髓干细胞所提取的外泌体和5×106个牙髓干细胞，制得所述外泌体制剂。
作为优选，所述牙髓干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
a)牙髓干细胞的原代培养：取健康人的智齿，清洗后剪碎牙齿，取出牙髓；将牙髓剪碎后进行消化，离心，弃上清后用培养基重悬后进行接种培养；5天后弃上清，补充新的培养基继续培养，待细胞形成较大的克隆，即可传代；
b)牙髓干细胞的传代培养：取步骤a)得到的原代细胞，弃掉培养液，加入PBS缓冲液冲洗细胞生长面；弃去PBS缓冲液，用胰酶对细胞进行消化，并离心；弃上清，用培养基重悬细胞，对细胞进行传代培养；
c)外泌体的分离：收集步骤b)传代培养的第2～5代牙髓干细胞培养上清，离心去除细胞碎片；取上清以2:1的比例加入外泌体分离试剂，混匀后4℃孵育过夜后离心，弃上清，用4℃预冷的PBS缓冲液重悬制得所述牙髓干细胞外泌体，置-20℃保存。
作为优选，所述培养基为含10％FBS的DMEM培养基。
作为优选，步骤a)所述消化为用I型胶原酶和中性蛋白酶分别消化30min。
作为优选，步骤a)所述离心为1500rpm离心10min。
作为优选，步骤c)所述的分离试剂购于invitrogen公司。
本发明还公开了所述干细胞外泌体制剂或所述的制备方法制得的干细胞外泌体制剂在制备治疗肾炎的生物制剂中的应用。
人血白蛋白可维持为制剂中的细胞提供营养，维持细胞的活性，保证制剂在回注后细胞的存活率。
肾的被摸有三层，从内到外分为纤维囊、脂肪囊和肾筋膜。在治疗时，将所述外泌体制剂注射在脂肪囊处，避免直接注射进肾质内、对肾脏造成二次损伤。
脂肪囊是包裹在肾脏外面的组织，其具有封闭腔隙，所述外泌体制剂注射进脂肪囊内的外泌体既能直接作用于肾脏，又可以避免血液流动而造成外泌体的损失。若进行肾血管输注，肾脏内的血流量大，制剂随血流而流失后所起作用甚微。
外泌体可直接修复损失组织，增强未损伤组织的抵抗能力，大大地缩短组织修复的时间。
外泌体不具有免疫原性，可适用任何个体。
异基因细胞在输注后在体内的增殖、分化、寿命以及以此带来的免疫调节功能的变化的认识尚不很明确，临床应用所产生的问题陷入瓶颈期。外泌体的应用较异基因细胞的直接应用更为安全，可以开启非细胞治疗的方法。
外泌体在提取后可长期保存，在应用时制剂制备更为方便，避免了细胞治疗方案需要重新培养细胞等操作。
制剂中的牙髓干细胞可在制备所述牙髓干细胞外泌体的过程中同时制备，无需另外制备，制备过程方便。优选使用P2～P5代的牙髓干细胞作为外泌体制剂的组分。
试验结果显示，本发明公开的干细胞外泌体制剂具有明显的治疗肾炎的功效。
相比于现有技术，本发明具有以下优点：
1、本发明公开的干细胞外泌体制剂对肾炎有良好的疗效；
2、相比于异基因细胞的输注，外泌体制剂的使用更为安全；
3、外泌体在提取后可长期保存，制剂制备更为方便，利于推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为牙髓干细胞外泌体透射电镜图；
图2为牙髓干细胞原代细胞显微镜图；
图3为牙髓干细胞流式鉴定结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用，所述干细胞外泌体制剂对肾炎有良好的疗效。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明实施例中所使用到的组分或制剂均为市售或自制来源。
本实施例所用组分及试剂均为自制或市售来源。
外泌体分离试剂购自Invitrogen公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1制备牙髓干细胞外泌体
牙髓干细胞的原代培养：取健康人的智齿，于超净台中进行无菌清洗，清洗后用钳子剪碎牙齿，取出牙髓；用手术剪将牙髓进行剪碎，用I型胶原酶和中性蛋白酶分别消化30min，1500rpm离心10min，弃上清后用DMEM+10％FBS完全培养基重悬后接种至6孔板中，转移至5％CO2、37℃的环境中培养；培养5天后弃上清，补充新的完全培养基继续培养，待细胞形成较大的克隆，即可传代；
牙髓干细胞的传代培养：取可传代的P0代细胞，弃掉皿内原培养液，加入10mL PBS缓冲液轻轻冲洗细胞生长面；弃去PBS洗液，加入2mL 0.25％胰蛋白酶，左右摇晃平皿使胰酶均匀覆盖于皿底，显微镜下观察可见细胞间隙增大，胞质回缩；当长梭形细胞变圆变亮时，立即加入10倍体积的完全培养基终止消化；反复吹打，直至细胞全部脱落成单细胞悬液，将悬液转移至离心管中，室温离心1500rpm/5min；弃上清，加入DMEM+10％FBS完全培养基重悬细胞，按密度为1×105个细胞数进行传代培养，将培养瓶置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞生长至融合时，重复上述传代步骤对细胞进行扩增培养。
流式检测牙髓间充质干细胞8种抗原：CD73、CD90、CD105、HLA-DR、CD45、CD19、CD34和CD11b，流式检测结果见图3。
根据2006年ISCT颁布的《间充质干细胞鉴定的最低标准》，CD73、CD90、CD105三种表面抗原的表达不低于95.0％；CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR的表达不高于2.0％。
对照组是牙髓间充质干细胞8种抗原相应的同型对照，对照组的流式结果见图3(1)。样品组是8种抗原的表达情况。样品组的流式结果如图3(2)所示，样品组的CD73、CD90、CD105表达高于95.0％；样品组的HLA-DR、CD45、CD19、CD34、CD11b表达低于2.0％，符合干细胞的表面抗原特征，说明了牙髓干细胞并没有出现分化的现象，仍维持着干细胞的特点。
外泌体的分离：收集P2～P5代牙髓干细胞培养上清，将培养上清转至高速离心管中，4℃、2000g离心30min，去除细胞碎片；取上清转移至新的高速离心管中，以细胞上清液：试剂＝2:1的比例加入试剂，用涡旋器充分混匀后，置于冰箱中4℃过夜孵育。在4℃环境中1000g离心60min，弃去上清，用100μL 4℃的PBS溶液缓冲液重悬即为外泌体悬液，置于-20℃保存。
外泌体的鉴定：取分离纯化外泌体10uL，按体积比＝1:1加入4℃的PBS溶液稀释后滴加于2mm的载样铜网上，于室温静置1min后用滤纸将多余液体轻轻吸去，用3％(w/v)磷钨酸钠溶液(PH6.8)室温负染5分钟，用双蒸水轻轻洗一遍后室温晾干，于透射电镜观察并照相、测量其直径。透射电镜结果见图1。结果显示，在透射电镜下观察，外泌体大小在130nm之下，30nm至120nm不等，呈形态基本一致的圆形或者椭圆形膜性囊炮样。染色后可见囊泡有完整的包膜，内部含有低电子致密物。上述特征均符合外泌体的特征。
实施例2制备外泌体制剂
往生理盐水中添加人血白蛋白，制成人血白蛋白质量浓度为5％的人血白蛋白溶液；然后往人血白蛋白溶液中添加实施例1制备的牙髓干细胞外泌体及牙髓干细胞，使每5mL溶液中含5×106个牙髓干细胞和从5×106个牙髓干细胞提取的外泌体，制得所述外泌体制剂，置于4℃保存。
实施例3制备外泌体制剂
往生理盐水中添加人血白蛋白，制成人血白蛋白质量浓度为2％的人血白蛋白溶液；然后往所述人血白蛋白溶液中添加实施例1制备的牙髓干细胞外泌体及牙髓干细胞，使每5mL溶液中含5×106个牙髓干细胞和从1×106个牙髓干细胞提取的外泌体，制得所述外泌体制剂，置于4℃保存。
实施例4制备外泌体制剂
往生理盐水中添加人血白蛋白，制成人血白蛋白质量浓度为8％的人血白蛋白溶液；然后往所述人血白蛋白溶液中添加实施例1制备的牙髓干细胞外泌体及牙髓干细胞，使每5mL溶液中含5×106个牙髓干细胞和从1×107个牙髓干细胞提取的外泌体，制得所述外泌体制剂，置于4℃保存。
实施例5验证试验
一、构建大鼠肾炎模型
每只大鼠注射C-BSA，先腹腔注射1周，第1天至第7天的剂量依次为1.0、1.0、1.0、1.5、1.5、2.0、2.0mg。自第2周起，每日于无菌条件下尾静脉注射C-BSA2.5mg[溶于1mL pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中]，持续3周，总给药量为62.5mg。
C-BSA的制备方法：将67mL乙二胺(EDA)和500mL重蒸馏水混合，以6mol/LHCl350mL调整上述溶液的pH到4.75；待温度降至25℃，将5g BSA溶于25mL重蒸馏水中并加入到EDA混合溶液中；随后加入1.8g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)并均匀搅拌，反应120min(恒温25℃，pH 4.75)；然后加入4mol/L醋酸盐缓冲液(pH 4.75)30mL以终止反应。将上述溶液在4℃的重蒸馏水中透析48h，真空冷冻干燥即制成C-BSA，分装密封保存于-70℃的冰箱内，使用前用生理盐水配制成溶液。
二、干细胞制剂的疗效验证
1.筛选试验
试验分组如下：
组别 组成
对照组 5％人血白蛋白
实施例2 5×106牙髓干细胞+5×106牙髓干细胞分泌的外泌体+5％人血白蛋白
实施例3 5×106牙髓干细胞+1×106牙髓干细胞分泌的外泌体+5％人血白蛋白
实施例4 5×106牙髓干细胞+1×107牙髓干细胞分泌的外泌体+5％人血白蛋白
选取造模成功、体重相近、雌雄各半的大鼠80只，均分为4组，每组20只。空白对照组于肾脂肪囊内注射200uL的5％人血白蛋白；实施例2～4注射200uL的制剂。于2周后，采集各组大鼠的尿液进行尿蛋白定量检测；乙醚迷醉后眼眶内静脉采血，检测尿素氮、肌酐水平。
*表示与对照组相比，P<0.05，具有显著性差异。
从表中可知，实施例3的尿蛋白定量为90.22±18.57mg/24h，尿素氮为15.39±4.78mmol/L，肌酐为98.68±14.83μmol/L，三者与对照组相比，均没有显著性差异；
实施例2和实施例4的尿蛋白定量分别为69.46±13.47mg/24h、48.41±10.56mg/24h，尿素氮分别为10.34±3.65mmol/L、6.46±5.09mmol/L，肌酐70.81±11.09μmol/L、48.76±8.68μmol/L，两实施例的三组检测指标与对照组相比，均具有显著性差异。
故本发明的优选方案为
5×106牙髓干细胞+(5～10×106)牙髓干细胞分泌的外泌体+5％人血白蛋白
2.对比实验
试验分组如下：
组别 组成
空白组 5％人血白蛋白
对照组1 5×106牙髓干细胞+5％人血白蛋白
对照组2 5×106骨髓干细胞+5％人血白蛋白
实施例1 5×106牙髓干细胞+5×106牙髓干细胞分泌的外泌体+5％人血白蛋白
选取造模成功、体重相近、雌雄各半的大鼠80只，均分为4组，每组20只。空白对照组于肾包囊内注射200uL的5％人血白蛋白；实施例2～4注射200uL的制剂。于2周后，采集各组大鼠的尿液进行尿蛋白定量检测；乙醚迷醉后眼眶内静脉采血，检测尿素氮、肌酐水平。
组别 尿蛋白定量(mg/24h) 尿素氮(mmol/L) 肌酐(μmol/L)
空白组 120.58±30.43 19.40±7.68 119.73±19.22
对照组1 86.97±14.28 13.05±5.61 90.49±13.57
对照组2 92.64±16.29 14.87±6.08 98.68±14.83
实施例1 56.34±12.67* 7.82±8.76* 62.35±9.79*
*表示与对照组相比，P<0.05，具有显著性差异。
实施例1的尿蛋白定量分别为56.34±12.67mg/24h，尿素氮分别为7.82±8.76mmol/L，肌酐62.35±9.79μmol/L，与空白组和两对照组相比，均具有显著性差异。
结果说明，本发明配方优于单使用牙髓干细胞或骨髓干细胞。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种干细胞外泌体制剂，其特征在于，包括：牙髓干细胞外泌体、牙髓干细胞、人血白蛋白和溶剂；
所述牙髓干细胞外泌体为从牙髓干细胞提取的外泌体；
每5mL所述制剂含有从1×106～1×107个所述牙髓干细胞提取的外泌体；
所述牙髓干细胞的含量为1×106～1×107个/5mL；
所述人血白蛋白的质量浓度为2～8％；
所述溶剂为生理盐水。
2.权利要求1所述外泌体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
往溶剂中添加人血白蛋白，制成人血白蛋白质量浓度为2％-8％的人血白蛋白溶液；然后往所述人血白蛋白溶液中添加所述牙髓干细胞外泌体及所述牙髓干细胞，使每5mL所述制剂中含有从1×106～1×107个牙髓干细胞所提取的外泌体和5×106个牙髓干细胞，制得所述外泌体制剂。
3.权利要求1所述牙髓干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)牙髓干细胞的原代培养：取健康人的智齿，清洗后剪碎牙齿，取出牙髓；将牙髓剪碎后进行消化，离心，弃上清后用培养基重悬后进行接种培养；5天后弃上清，补充新的培养基继续培养，待细胞形成较大的克隆，即可传代；
b)牙髓干细胞的传代培养：取步骤a)得到的原代细胞，弃掉培养液，加入PBS缓冲液冲洗细胞生长面；弃去PBS缓冲液，用胰酶对细胞进行消化，并离心；弃上清，用培养基重悬细胞，对细胞进行传代培养；
c)外泌体的分离：收集步骤b)传代培养的第2～5代牙髓干细胞培养上清，离心去除细胞碎片；取上清以2:1的比例加入外泌体分离试剂，混匀后4℃孵育过夜后离心，弃上清，用4℃预冷的PBS缓冲液重悬制得所述牙髓干细胞外泌体，置-20℃保存。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养基为含10％FBS的DMEM培养基。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述消化为用I型胶原酶和中性蛋白酶分别消化30min。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述离心为1500rpm离心10min。
7.权利要求1所述的外泌体制剂或权利要求2所述的制备方法制得的外泌体制剂在制备治疗肾炎的生物制剂中的应用。
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