CN113041259B - 牙髓干细胞外泌体制剂及制备方法和应用 - Google Patents

牙髓干细胞外泌体制剂及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于治疗勃起功能障碍的牙髓干细胞外泌体制剂及制备方法和应用。该制剂包括牙髓干细胞来源的外泌体以及药学上可接受的载体。该牙髓干细胞外泌体制剂能够升高海绵体内压力并增加微血管比例，从而大大改善ED的功能。

Description

牙髓干细胞外泌体制剂及制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于治疗勃起功能障碍的牙髓干细胞外泌体制剂及制备方法和应用。
背景技术
勃起功能障碍(Erectile Dysfunction，ED)是指持续不能达到或保持足够的勃起以满足性行为。严重影响男人的生活质量，同时也影响配偶或同伴和睦的幸福关系。同时ED也是心血管疾病的重要标志。流行病学调查显示ED的发病率在40-70岁人群中高达52％，70岁以上的人群高度70.2％。且高发于糖尿病等心血管疾病患者，I型糖尿病患者中ED发病率达32％，II型糖尿病患者中ED发病率高达46％。高血压、肥胖及前列腺手术等也会导致ED。严重影响患者的身心健康和生活质量。Viagra(伟哥)的批准给ED的治疗带来了革命性的进展。但是仍然有相当部分人无效。再生医学及干细胞应用的兴起给难治性ED的治疗提供了新的方向。
近年来，临床研究显示脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞(BMMSC)和脐带干细胞等对ED治疗效果评价，显示IIEF-15，EHS,勃起功能EF，性欲望SD，性交满意度IS和总满意度OS都有改善。此外，来源于乳牙牙髓的干细胞(SHED)与骨髓间充质干细胞(BMMSC)相比具有更高的克隆形成能力和增殖活性，表明这些细胞具有更高的干细胞特性(stemness)。
外泌体是多种细胞在正常及病理状态下均可分泌到细胞外，包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
人体内多种细胞及体液均可分泌外泌体，包括内皮细胞、免疫细胞、血小板、平滑肌细胞等。当其由宿主细胞被分泌到受体细胞中时，外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。
当外泌体在1980年首次被发现后，其被认为是细胞排泄废物的一种方式，如今随着大量研究发现外泌体具有多种多样的功能。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。目前关于乳牙牙髓干细胞的外泌体在治疗ED方面还未有研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于治疗勃起功能障碍的牙髓干细胞外泌体制剂，该牙髓干细胞外泌体制剂能够升高海绵体内压力并增加微血管比例，从而大大改善ED的功能。
本发明的再一个目的在于提供上述治疗勃起功能障碍的牙髓干细胞外泌体制剂的制备方法。
本发明的另一个目的在于提供上述治疗勃起功能障碍的牙髓干细胞外泌体制剂的应用。
为达到上述目的，本发明提供了一种用于治疗勃起功能障碍的牙髓干细胞外泌体制剂，其中，该制剂包括牙髓干细胞来源的外泌体以及药学上可接受的载体。
根据本发明的具体实施方案，所述牙髓干细胞来自乳牙或11-20岁青少年牙齿的牙髓干细胞。
根据本发明的具体实施方案，所述外泌体的直径为30-200nm；优选地，所述外泌体在制剂中的浓度为1000-2000μg/mL。
根据本发明的具体实施方案，所述药学上可接受的载体选自生理盐水(即浓度为0.9％的NaCl溶液)、PBS中的一种或两种，优选为生理盐水。
根据本发明的具体实施方案，所述制剂选自注射剂、软膏剂或喷雾剂中的一种，优选为注射剂。
本发明还提供了上述牙髓干细胞外泌体制剂的制备方法，其中，该制备方法具体包括以下步骤：(1)从离体的牙齿中获取牙髓组织；(2)消化：于培养瓶中培养步骤(1)所获取的牙髓组织并进一步通过消化液进行消化；(3)牙髓干细胞培养：将终止消化的牙髓组织离心，丢弃上清，进一步将弃掉上清的牙髓组织用第一培养液重悬并进行培养和传代，获得包含牙髓干细胞的第二培养液；(4)培养液收集：收集所述第二培养液；(5)外泌体分离：对所述第二培养液进行离心操作以得到牙髓干细胞外泌体制剂。
根据本发明的具体实施方案，步骤(1)中，所述牙髓组织来自经患者及家属知情同意的志愿者；优选地，该牙的松动度达到II-III级；进一步优选地，获取牙髓组织的具体操作包括：使用牙科综合治疗机裂钻沿源齿牙釉本质界磨至3-4mm，并严禁磨透露出牙髓，进一步分离牙冠和牙根，使用拔髓针提取牙髓组织，并将分离下来的牙髓组织用无菌手术刀柄及刀片进行剪切和研磨；进一步优选地，若源齿为智齿，则需要磨至6-7mm。
根据本发明的具体实施方案，步骤(2)中，所述消化液包括质量浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液；优选地，该消化步骤在恒温混匀仪(温度为37度，转速为100-150rpm)中进行。
根据本发明的具体实施方案，所述步骤(3)中，所述牙髓组织终止消化的指标为：待所述牙髓组织的细胞脱离培养瓶的瓶壁，细胞由梭形变为圆形时加入第三培养液终止消化；所述离心的条件为：在800xg的离心力下于室温离心8-10min；优选地，在CO2培养箱中培养所述弃掉上清的牙髓组织，所述CO2培养箱的培养条件为：温度为37℃、CO2浓度为5％-7％；进一步优选地，待所述牙髓组织在CO2培养箱培养三天后需要在显微镜下观察是否有细胞长出，根据细胞情况进行补充培养液或更换培养液操作并填写相应的记录，以此类推直到第十天为止；进一步优选地，传代条件为：待细胞汇合至80-90％后进行传代，收集牙髓干细胞的培养液以用于后续的外泌体分离；进一步优选地，所述第一培养液和所述第三培养液均选自添加有体积浓度为10％胎牛血清的基本培养液(该基本培养液即MEM培养液)，其中，所述胎牛血清需要提前去掉血清中的外泌体；进一步优选地，去掉血清中外泌体的具体操作包括：于120000g离心力条件下超速离心2小时。
根据本发明的具体实施方案，步骤(5)中离心操作的具体步骤包括：第一步，使用超速离心机将收集的第二培养液以2000-3000g的离心力离心10-30min去掉细胞碎片得到I级溶液；第二步，将所述I级溶液以20000-30000g的离心力离心30-60min去掉200-500nm的混合微囊泡得到II级溶液；第三步，将所述II级溶液以120000-140000g的离心力离心70-150min，弃上清获得外泌体；第四步，使用生理盐水溶解所述外泌体得到牙髓干细胞外泌体制剂，用于后续的鉴定和治疗。
本发明还提供了上述牙髓干细胞外泌体制剂在制备用于治疗勃起功能障碍的试剂中的应用。
本发明的用于治疗勃起功能障碍的牙髓干细胞外泌体制剂的制备方法简单，制备出的牙髓干细胞外泌体制剂在施用后具有升高海绵体内压力以及海绵体内压力/主动脉压的比值、升高内皮细胞标记分子CD31的表达水平、升高一氧化氮合酶的表达水平、增加微血管比例，从而大大改善ED的功能。
附图说明
图1示出了本发明乳牙牙髓干细胞内部的微囊泡；
图2A示出了本发明乳牙牙髓干细胞来源的外泌体(Exo)的直径；
图2B示出了本发明乳牙牙髓干细胞来源的外泌体的形态图；
图3A示出了本发明ED动物模型注射Exo后与正常对照组、ED组在海绵体内压力(ICP)变化对比图；
图3B示出了本发明ED动物模型注射Exo后与正常对照组、ED组在海绵体内压力(ICP)/主动脉压(MAP)比值变化对比图；
图4A示出了本发明ED动物模型注射Exo后与正常对照组、ED组在一氧化氮合酶(NOS)的表达水平对比图；
图4B示出了本发明ED动物模型注射Exo后与正常对照组、ED组在内皮细胞标记分子CD31的表达水平对比图；
图5A示出了本发明正常对照组的血管含量和胶原沉积图；
图5B示出了本发明ED动物模型血管含量和胶原沉积图；
图5C示出了本发明ED动物模型注射Exo后的血管含量和胶原沉积图；
图6示出了本发明于6-8周小鼠海绵体局部注射Exo的流程图；
图7示出了本发明超速离心法分离外泌体的流程图。
具体实施方式
为了更加清楚地理解本发明的技术特征、目的和有益效果，现对本发明的技术方案进行进一步的详细说明。应理解，以下具体实施方式仅是示例性的，本发明的技术方案不限于以下所列举的具体实施方式。
本发明目的是提供一种用于治疗勃起功能障碍的牙髓干细胞外泌体制剂，施用该制剂后能能够升高海绵体内压力并增加微血管比例，从而大大改善ED的功能。
为此，本发明提供了一种用于治疗勃起功能障碍的牙髓干细胞外泌体制剂，其中，该制剂包括牙髓干细胞来源的外泌体以及药学上可接受的载体。
上述牙髓干细胞来自乳牙或11-20岁青少年牙齿的牙髓干细胞。
上述外泌体的直径为30-200nm，优选直径为30-150nm。
所述外泌体在制剂中的浓度为1000-2000μg/mL，优选浓度为1500μg/mL。
上述药学上可接受的载体选自生理盐水、PBS中的一种或两种，优选为生理盐水。
上述制剂选自注射剂、软膏剂或喷雾剂中的一种，优选为注射剂。
本发明还提供了上述牙髓干细胞外泌体制剂的制备方法，该制备方法具体包括以下步骤：
(1)从离体的牙齿中获取牙髓组织。
上述步骤(1)中，所述牙髓组织来自经患者及家属知情同意的志愿者。进一步优选地，获取牙髓组织的具体操作包括：使用牙科综合治疗机裂钻沿离体的源齿牙釉本质界磨至3-4mm，并严禁磨透露出牙髓，进一步分离牙冠和牙根，使用拔髓针提取牙髓组织，并将分离下来的牙髓组织用无菌手术刀柄及刀片进行剪切和研磨。进一步优选地，若源齿为智齿，则需要磨至6-7mm。
(2)消化：于培养瓶中培养将步骤(1)所获取的牙髓组织并进一步通过消化液进行消化。
上述步骤(2)中，所述消化液包括质量浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液。优选地，该消化步骤是在恒温混匀仪(温度为37度，转速为100-150rpm)中进行的。
(3)牙髓干细胞培养：将终止消化的牙髓组织离心，丢弃上清，进一步将弃掉上清的牙髓组织用培养液用第一培养液重悬并进行培养和传代，获得包含牙髓干细胞的第二培养液。
上述步骤(3)中，所述牙髓组织终止消化的指标为：待所述牙髓组织的细胞脱离培养瓶的瓶壁，细胞由梭形变为圆形时加入第三培养液终止消化。所述离心的条件为：在800xg的离心力下于室温离心8-10min。优选地，在CO2培养箱中培养所述弃掉上清的牙髓组织，所述CO2培养箱的培养条件为：温度为37℃、CO2浓度为5％-7％。进一步优选地，待所述牙髓组织在CO2培养箱培养三天后需要在显微镜下观察是否有细胞长出，根据细胞情况进行补充培养液或更换培养液操作并填写相应的记录，以此类推直到第十天为止。进一步优选地，传代条件为：待细胞汇合至80-90％后进行传代，收集牙髓干细胞的培养液以用于后续的外泌体分离。进一步优选地，所述第一培养液和第三培养液均选自添加有体积浓度为10％胎牛血清的基本培养液(该基本培养液即MEM培养液)，其中，所述胎牛血清需要提前去掉血清中的外泌体。进一步优选地，去掉血清中外泌体的具体操作包括：于120000g离心力条件下超速离心2小时。
(4)培养液收集：对收集所述第二培养液。
(5)外泌体分离：对所述第二培养液进行离心操作以得到牙髓干细胞外泌体制剂。
上述步骤(5)中离心操作的具体步骤包括：第一步，将收集的第二培养液使用超速离心机以2000-3000g的离心力离心10-30min去掉细胞碎片得到I级溶液；第二步，将所述I级溶液以20000-30000g的离心力离心30-60min去掉200-500nm的混合微囊泡得到II级溶液；第三步，将所述II级溶液以120000-140000g的离心力离心70-150min，弃上清获得外泌体；第四步，使用生理盐水溶解所述外泌体得到牙髓干细胞外泌体制剂，用于后续的鉴定和治疗。
本发明还提供了上述牙髓干细胞外泌体制剂在制备用于治疗勃起功能障碍的试剂中的应用。
综上所述，本发明制备出的牙髓干细胞外泌体制剂在施用后具有升高海绵体内压力以及海绵体内压力/主动脉压的比值、升高内皮细胞标记分子CD31的表达水平、升高一氧化氮合酶的表达水平、增加微血管比例，从而大大改善ED的功能。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的详细说明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。
实施例
实施例1
本实施例提供了一种乳牙牙髓干细胞外泌体制剂的制备方法，具体操作如下：
1.获取乳牙牙髓组织
收取志愿者松动度达II-III度的乳牙(经患者及家属知情同意)，放置在0.9％生理盐水中4度保存，在4-6小时运送到符合GMP标准的实验室，以进行后续的乳牙牙髓干细胞提取。
磨牙：操作者戴好防护眼镜，用75％酒精喷手消毒。用牙科综合治疗机裂钻沿源齿牙釉本质界磨至3-4mm，源齿若为智齿，磨至6-7mm，严禁磨透露出牙髓.分离牙冠和牙根，用拔髓针提取牙髓组织。
将分离下来的组织用无菌手术刀柄及刀片进行剪切、研磨。
2.消化
将切好的组织放入恒温混匀仪，用消化液的工作液进行消化，消化时组织应呈分散状态无黏连。
3.乳牙牙髓干细胞培养
消化完成后终止消化，转移到离心管，进行离心，离心条件控制在800xg、8-10min，室温。离心后去上清，将组织用培养基重悬后放入合适的培养皿内，放入培养箱内培养(37℃、5％-7％二氧化碳)。
培养三天后在显微镜下观察是否有细胞长出，根据细胞情况进行补充培养液或更换培养液操作并填写相应的记录，以此类推直到第十天为止。该培养液中所用的血清需要提前通过2小时120000g超速离心去掉血清中的外泌体。
传代：细胞长至80-90％后传代。
4.培养液收集
收集SHED的培养液以用于后续的外泌体分离。
5.外泌体分离
使用超速离心机进行3000g离心10min去掉细胞碎片，进一步以20000g离心30min去掉200-500nm的混合微囊泡，进一步以120000g的转速离心120min(具体的离心流程详见图7)，生理盐水溶解后得到外泌体制剂，用于后续的鉴定和治疗。
实施例2
本实施例提供了一种动物模型构建及检测指标，具体如下：
选20-21g体重，6-8周小鼠C57/B6，腹腔注射链脲佐菌素(STZ，50mg/kg)体重，观察6周后，100mg/kg体重皮下注射阿扑吗啡，筛选其阴茎勃起功能受损的小鼠，说明ED模型诱导成功，纳入实验组，开始将实施例1制备出的外泌体制剂以4-5mg/kg体重注射小鼠的海绵体进行外泌体治疗，于10周时收集标本进行检测。具体的流程图详见图6。实验分组：正常对照组，ED组，ED+Exo治疗组。
治疗后检测指标：
从图1可以看出透射电镜检测显示SHED细胞内含有大量的微囊泡。从图2A可以看出纳米粒度仪检测离心分离得到的外泌体大小介于30-150nm区间；从图2B可以看出外泌体纯度较好。图3A和图3B示出了用动脉血压检测仪(DSI)检测刺激海绵体神经时海绵体内压力(ICP)变化以及ICP/主动脉压(MAP)比值变化，显示阴茎勃起功能。图3A和图3B结果显示ED组其ICP和ICP/MAP均显著下降，而Exo局部注射可以升高ICP和ICP/MAP。
一氧化氮(NO)是重要的气体信使，在功能上是内皮产生血管扩张的信使，并维持血管舒张和血管稳态，而NOS是合成NO的催化酶，在产生NO中发挥关键作用。从图4A的研究结果显示，在ED组，NOS表达显著降低，而Exo局部注射可以升高NOS的表达水平。
内皮细胞功能障碍是ED最重要的病理生理学之一，因此血管内皮细胞的多少和功能是评价ED的重要指标，而CD31是内皮细胞的标记分子。从图4B的研究结果显示，在ED组，CD31表达显著降低，而SHED局部或系统注射可以升高CD31的表达水平。
内皮细胞功能障碍是ED最重要的病理生理学之一，因此血管内皮细胞的多少和功能是评价ED的重要指标。因此通过HE染色检测血管的分布和比例。从图5A-5C的研究结果显示在ED组，微血管比例表达显著降低，而Exo局部注射可以增加微血管比例，而大大改善ED的功能。
以上所述仅仅是本发明的优选实施方式。应当指出的是，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，本领域技术人员可对本发明的细节和特征进行各种修改、组合、变更或替换。这些修改、组合、变更或替换也应理解为包括在本发明要求保护的范围之内。

Claims (11)

1.牙髓干细胞外泌体制剂在制备用于治疗勃起功能障碍的试剂中的应用，其中，所述制剂由牙髓干细胞来源的外泌体以及药学上可接受的载体构成，所述制剂的制备方法具体包括以下步骤：
（1）从离体的牙齿中获取牙髓组织；
（2）消化：于培养瓶中培养步骤（1）所获取的牙髓组织并进一步通过消化液进行消化，所述消化液包括质量浓度为0.25%的胰蛋白酶溶液；
（3）牙髓干细胞培养：待所述牙髓组织的细胞脱离培养瓶的瓶壁，细胞由梭形变为圆形时加入第三培养液终止消化，将终止消化的所述牙髓组织离心，丢弃上清，进一步将弃掉上清的牙髓组织用第一培养液重悬并进行培养和传代，待细胞汇合至80-90%后进行所述传代，获得包含牙髓干细胞的第二培养液；
（4）培养液收集：收集所述第二培养液；
（5）外泌体分离：对所述第二培养液进行离心操作以得到牙髓干细胞外泌体制剂，
所述第一和第三培养液均选自添加有体积浓度为10%胎牛血清的MEM培养液，其中，所述胎牛血清需要提前去掉血清中的外泌体。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，步骤（3）中，
所述离心的条件为：在800xg的离心力下于室温离心8-10min。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，步骤（3）中，在CO2培养箱中培养所述弃掉上清的牙髓组织，所述CO2培养箱的培养条件为：温度为37℃、CO2浓度为5%-7%。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，步骤（5）中离心操作的具体步骤包括：
第一步，将收集的第二培养液以2000-3000g的离心力离心10-30min去掉细胞碎片得到I级溶液；
第二步，将所述I级溶液以20000-30000g的离心力离心30-60min去掉200-500nm的混合微囊泡得到II级溶液；
第三步，将所述II级溶液以120000-140000g的离心力离心70-150min，弃上清获得外泌体；
第四步，使用生理盐水溶解所述外泌体得到牙髓干细胞外泌体制剂。
5.根据权利要求1所述的应用，其中，所述牙髓干细胞来自乳牙或11-20岁青少年牙齿。
6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述外泌体的直径为30-200nm。
7.根据权利要求6所述的应用，所述外泌体在制剂中的浓度为1000-2000μg/mL。
8.根据权利要求1所述的应用，其中，所述药学上可接受的载体选自生理盐水、PBS中的一种或两种。
9.根据权利要求8所述的应用，所述药学上可接受的载体为生理盐水。
10.根据权利要求1所述的应用，其中，所述制剂选自注射剂、软膏剂或喷雾剂中的一种。
11.根据权利要求10所述的应用，所述制剂为注射剂。
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