CN109954001A - 用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂和其制备方法与给药方法 - Google Patents

用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂和其制备方法与给药方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂和其制备方法与给药方法，包括脐带间充质干细胞以及通过饥饿培养获得脐带间充质干细胞外泌体浓缩液。通过对脐带间充质干细胞饥饿培养的方法，促进其生物活性物质的分泌。以外泌体的形式回收脐带间充质干细胞分泌的生物活性物质，大大提高了回收效率、回收方式更为简便。通过不同孔径的生物膜梯度过滤的方法，收集并浓缩脐带间充质干细胞分泌的外泌体，简化了外泌体回收的流程，提高了外泌体的纯度。

Description

用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联 合制剂和其制备方法与给药方法
技术领域
本发明涉及脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂，尤其是一种用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂和其制备方法与给药方法。
背景技术
勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)是最常见的一种男性性功能障碍，指阴茎持续不能达到或维持足够的勃起以完成满意性生活，病程3个月以上。ED一般可分为器质性ED、手术或外伤性ED、精神性ED、阴茎自身病变等，常规的治疗方法可通过口服药物治疗，但药物治疗依赖性强，不能达到根治的目的。脐带间充质干细胞属于成体干细胞，具有多向分化、组织修复、免疫调节等多种功能，因其免疫原性极低，异体使用不会引起免疫排斥，故在临床应用中具有极大的优势。研究显示，脐带间充质干细胞能够一定程度上治疗和缓解ED症状。但是，直接静脉回输脐带间充质干细胞由于细胞难于到达阴茎部位，所以治疗效果有限。
研究发现，脐带间充质干细胞行使生物学功能的一个最重要途径是通过分泌大量生物活性因子，进而调节病变组织的机能、促进血管再生、加速组织再生修复。而大量的生物活性因子的分泌途径主要是通过外泌体，一种生物膜包裹的、直径在40-200nm不等的分泌小泡。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂和其制备方法与给药方法，通过饥饿培养脐带间充质干细胞的，并进行富集浓缩的方法，获得高浓度的具有生物活性的脐带间充质干细胞外泌体，以此为溶剂，制备脐带间充质干细胞悬液，通过微针局部导入的方法治疗ED。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)人脐带间充质干细胞的培养：选取生长状态良好的，微生物检测均为阴性的，P2-P8的人源脐带间充质干细胞，按照3-5*104/cm2的初始密度接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，培养基为基础培养基中含有体积比浓度5-15％的胎牛血清的培养体系；
(2)接种培养2-4天后，细胞融合率达到80-95％，细胞生长状态良好，吸弃全部培养上清，并以医用复方电解质注射液清洗细胞2-4次，然后加入复方电解质溶液，使溶液高度达到2-3mm，放入二氧化碳培养箱中饥饿培养；
(3)饥饿培养18-30h后，回收全部培养上清，以0.22um孔径滤膜过滤，过滤后的培养上清在3000-5000g的离心力条件下离心10-20min，再次回收离心上清；
(4)在200000-500000g的离心力条件下对回收的上清离心30-60min，离心后轻轻取出离心管，以移液管吸弃上部70％-90％体积的液体，将下部10％-30％体积的液体及沉淀混合均匀后作为制备ED治疗制剂的外泌体溶剂，在2-8℃条件下保存；
(5)人脐带间充质干细胞的培养：选取生长状态良好的，微生物检测均为阴性的，P2-P8的人源脐带间充质干细胞，按照3-5*104/cm2的初始密度接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，培养基为基础培养基中含有体积比浓度5-15％的胎牛血清的培养体系；
(6)接种培养2-4天后，细胞融合率达到80-95％，细胞生长状态良好，回收全部细胞，并以复方电解质溶液清洗细胞3-4次，将最终获得的细胞按照0.5-2*106/ml的浓度重悬于已经复温至18-24℃的步骤(4)得到的外泌体溶剂中，制备成联合制剂。
上述制备方法得到的用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂。
上述用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂，通过静脉输注或微针倒入的给药方法。
本发明的有益效果是：间充质干细胞在培养过程中会分泌多种大量的外泌体，人脐带间充质干细胞分泌的外泌体能够促进皮肤组织分化、血管新生以及肉芽组织的生长，可调节局部组织微环境，促进血管新生，改善局部供血，从而达到改善阴茎供血、治疗ED的效果。并且，脐带间充质干细胞本身具有治疗ED的效果，外泌体溶剂能够为脐带间充质干细胞提供最佳的生存环境，能够最大限度地维持细胞的活性和功能。本发明采用饥饿脐带间充质干细胞的方法,在较短时间内就能得到人脐带间充质外泌体提取物，通过超速离心的方法浓缩以获得高浓度的人脐带间充质干细胞外泌体。将脐带间充质干细胞重悬于浓缩的脐带间充质干细胞外泌体中，大大提高了治疗效果。
附图说明
图1实施例1治疗前后性生活时间对比图。
图2实施例2治疗前后性生活时间对比图。
图3实施例3治疗前后性生活时间对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明的用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)人脐带间充质干细胞的培养：选取生长状态良好的，微生物检测均为阴性的，P2-P8的人源脐带间充质干细胞，按照3-5*104/cm2的初始密度接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，培养基为基础培养基中含有体积比浓度5-15％的胎牛血清的培养体系；
(2)接种培养2-4天后，细胞融合率达到80-95％，细胞生长状态良好，吸弃全部培养上清，并以医用复方电解质注射液清洗细胞2-4次，然后加入复方电解质溶液，使溶液高度达到2-3mm，放入二氧化碳培养箱中饥饿培养；
(3)饥饿培养18-30h后，回收全部培养上清，以0.22um孔径滤膜过滤，过滤后的培养上清在3000-5000g的离心力条件下离心10-20min，再次回收离心上清；
(4)在200000-500000g的离心力条件下对回收的上清离心30-60min，离心后轻轻取出离心管，以移液管吸弃上部70％-90％体积的液体，将下部10％-30％体积的液体及沉淀混合均匀后作为制备ED治疗制剂的外泌体溶剂，在2-8℃条件下保存；
(5)人脐带间充质干细胞的培养：选取生长状态良好的，微生物检测均为阴性的，P2-P8的人源脐带间充质干细胞，按照3-5*104/cm2的初始密度接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，培养基为基础培养基中含有体积比浓度5-15％的胎牛血清的培养体系；
(6)接种培养2-4天后，细胞融合率达到80-95％，细胞生长状态良好，回收全部细胞，并以复方电解质溶液清洗细胞3-4次，将最终获得的细胞按照0.5-2*106/ml的浓度重悬于已经复温至18-24℃的步骤(4)得到的外泌体溶剂中，制备成联合制剂。
上述制备方法得到的用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂。
上述用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂，通过静脉输注或微针倒入的给药方法。
本发明制剂中包括脐带间充质干细胞以及通过饥饿培养获得脐带间充质干细胞外泌体浓缩液。通过对脐带间充质干细胞饥饿培养的方法，促进其生物活性物质的分泌。以外泌体的形式回收脐带间充质干细胞分泌的生物活性物质，大大提高了回收效率、回收方式更为简便。通过不同孔径的生物膜梯度过滤的方法，收集并浓缩脐带间充质干细胞分泌的外泌体，简化了外泌体回收的流程，提高了外泌体的纯度。
本发明中间充质干细胞在培养过程中会分泌多种大量的外泌体，人脐带间充质干细胞分泌的外泌体能够促进皮肤组织分化、血管新生以及肉芽组织的生长，可调节局部组织微环境，促进血管新生，改善局部供血，从而达到改善阴茎供血、治疗ED的效果。并且，脐带间充质干细胞本身具有治疗ED的效果，外泌体溶剂能够为脐带间充质干细胞提供最佳的生存环境，能够最大限度地维持细胞的活性和功能。本发明采用饥饿脐带间充质干细胞的方法,在较短时间内就能得到人脐带间充质外泌体提取物，通过超速离心的方法浓缩以获得高浓度的人脐带间充质干细胞外泌体。
实施案例1：
患者李某，40岁，因工作繁忙、压力大，在一年前出现性欲减退、性生活频率降低，并出现早期的勃起功能障碍症状，治疗前3个月内性生活频率平均为1次/周，其中2次因阴茎无法正常勃起未完成性生活；5次在性交过程中阴茎在射精前未能保持勃起状态，射精失败；另外7次完成了性交过程，平均时间不足3分钟。按照《国际勃起功能指数》自测评分为12分，属于轻度勃起功能障碍。
联合制剂的制备：
(1)人脐带间充质干细胞的培养：选取生长状态良好的，微生物检测均为阴性的，P4的人源脐带间充质干细胞，按照3*104/cm2的初始密度接种于10瓶T-175细胞培养瓶中，培养基为基础培养基中含有体积比浓度10％的胎牛血清的培养体系；
(2)接种培养4天后，细胞融合率达到90％，细胞生长状态良好，吸弃全部培养上清，并以医用复方电解质注射液清洗细胞3次，然后加入50ml复方电解质溶液，放入二氧化碳培养箱中饥饿培养；
(3)饥饿培养24h后，回收全部培养上清，以0.22um孔径滤膜过滤，过滤后的培养上清在5000g的离心力条件下离心15min，再次回收离心上清；
(4)在400000g的离心力条件下对回收的上清离心60min，离心后轻轻取出离心管，以移液管吸弃上部80％的液体，将下部20％的液体及沉淀混合均匀后全部回收作为制备ED治疗制剂的外泌体溶剂，在4℃条件下保存；
(5)人脐带间充质干细胞的培养：选取生长状态良好的，微生物检测均为阴性的，P6的人源脐带间充质干细胞，按照3*104/cm2的初始密度接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，培养基为基础培养基中含有体积比浓度10％的胎牛血清的培养体系；
(6)接种培养4天后，细胞融合率达到90％，细胞生长状态良好，回收全部细胞，并以复方电解质溶液清洗细胞3次，将最终获得的细胞按照1*106/ml的浓度重悬于已经复温至22℃的步骤(4)得到的外泌体溶剂中，制备成联合制剂。
患者接受了一次治疗，一次性静脉输注40ml联合制剂。治疗一周后开始统计治疗效果，一个月内患者共进行7次性生活，全部成功完成射精，平均性交时间达到7分钟，治疗效果明显(图1)。按照《国际勃起功能指数》自测评分为18分，属于轻度勃起功能障碍。治疗前后性生活时间明显提高，差异显著(p<0.01)。
实施案例2：
患者张某，52岁，性生活频率降低，并出现勃起功能障碍症状，治疗前6个月内性生活频率平均为1次/两周，其中2次因阴茎无法正常勃起未完成性生活；4次在性交过程中阴茎在射精前未能保持勃起状态，射精失败；另外6次完成了性交过程，平均时间不足3分钟。按照《国际勃起功能指数》自测评分为8分，属于中度勃起功能障碍。
联合制剂的制备：
(1)人脐带间充质干细胞的培养：选取生长状态良好的，微生物检测均为阴性的，P6的人源脐带间充质干细胞，按照3*104/cm2的初始密度接种于20瓶T-175细胞培养瓶中，培养基为基础培养基中含有体积比浓度5％的胎牛血清的培养体系；
(2)接种培养4天后，细胞融合率达到85％，细胞生长状态良好，吸弃全部培养上清，并以医用复方电解质注射液清洗细胞3次，然后加入40ml复方电解质溶液，放入二氧化碳培养箱中饥饿培养；
(3)饥饿培养24h后，回收全部培养上清，以0.22um孔径滤膜过滤，过滤后的培养上清在4000g的离心力条件下离心15min，再次回收离心上清；
(4)在300000g的离心力条件下对回收的上清离心60min，离心后轻轻取出离心管，以移液管吸弃上部90％的液体，将下部10％的液体及沉淀混合均匀后作为制备ED治疗制剂的外泌体溶剂，在4℃条件下保存；
(5)人脐带间充质干细胞的培养：选取生长状态良好的，微生物检测均为阴性的，P5的人源脐带间充质干细胞，按照4*104/cm2的初始密度接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，培养基为基础培养基中含有体积比浓度10％的胎牛血清的培养体系；
(6)接种培养3天后，细胞融合率达到85％，细胞生长状态良好，回收全部细胞，并以复方电解质溶液清洗细胞3次，将最终获得的细胞按照1.5*106/ml的浓度重悬于已经复温至24℃的步骤(4)得到的外泌体溶剂中，制备成联合制剂。
患者接受了两次次治疗，间隔一个月，每次静脉输注20ml联合制剂。两次治疗结束一周后开始统计治疗效果，一个月内患者共进行4次性生活，全部成功完成射精，平均性交时间达到5分钟，治疗效果明显(图2)。按照《国际勃起功能指数》自测评分为14分，属于轻度勃起功能障碍。治疗前后性生活时间明显提高，差异显著(p<0.01)。
实施案例3：
患者马某，42岁，患有糖尿病，出现性欲减退、性生活频率降低，并出现早期的勃起功能障碍症状，治疗前3个月内性生活频率平均为1次/周，其中1次因阴茎无法正常勃起未完成性生活；2次在性交过程中阴茎在射精前未能保持勃起状态，射精失败；另外10次完成了性交过程，平均时间不足4分钟。按照《国际勃起功能指数》自测评分为15分，属于轻度勃起功能障碍。
联合制剂的制备：
(1)人脐带间充质干细胞的培养：选取生长状态良好的，微生物检测均为阴性的，P3的人源脐带间充质干细胞，按照3.5*104/cm2的初始密度接种于10瓶T-175细胞培养瓶中，培养基为基础培养基中含有体积比浓度10％的胎牛血清的培养体系；
(2)接种培养3天后，细胞融合率达到90％，细胞生长状态良好，吸弃全部培养上清，并以医用复方电解质注射液清洗细胞4次，然后加入40ml复方电解质溶液，放入二氧化碳培养箱中饥饿培养；
(3)饥饿培养20h后，回收全部培养上清，以0.22um孔径滤膜过滤，过滤后的培养上清在4000g的离心力条件下离心13min，再次回收离心上清；
(4)在200000g的离心力条件下对回收的上清离心60min，离心后轻轻取出离心管，以移液管吸弃上部70％的液体，将下部30％的液体及沉淀混合均匀后全部回收作为制备ED治疗制剂的外泌体溶剂，在4℃条件下保存；
(5)人脐带间充质干细胞的培养：选取生长状态良好的，微生物检测均为阴性的，P4的人源脐带间充质干细胞，按照3*104/cm2的初始密度接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，培养基为基础培养基中含有体积比浓度10％的胎牛血清的培养体系；
(6)接种培养4天后，细胞融合率达到90％，细胞生长状态良好，回收全部细胞，并以复方电解质溶液清洗细胞3次，将最终获得的细胞按照1*106/ml的浓度重悬于已经复温至20℃的步骤(4)得到的外泌体溶剂中，制备成联合制剂。
患者接受了一次治疗，一次性静脉输注60ml联合制剂。治疗一周后开始统计治疗效果，一个月内患者共进行6次性生活，全部成功完成射精，平均性交时间达到8分钟，治疗效果明显(图3)。按照《国际勃起功能指数》自测评分为20分，属于轻度勃起功能障碍。治疗前后性生活时间明显提高，差异显著(p<0.01)。
综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (3)

1.一种用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)人脐带间充质干细胞的培养：选取生长状态良好的，微生物检测均为阴性的，P2-P8的人源脐带间充质干细胞，按照3-5*104/cm2的初始密度接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，培养基为基础培养基中含有体积比浓度5-15％的胎牛血清的培养体系；
(2)接种培养2-4天后，细胞融合率达到80-95％，细胞生长状态良好，吸弃全部培养上清，并以医用复方电解质注射液清洗细胞2-4次，然后加入复方电解质溶液，使溶液高度达到2-3mm，放入二氧化碳培养箱中饥饿培养；
(3)饥饿培养18-30h后，回收全部培养上清，以0.22um孔径滤膜过滤，过滤后的培养上清在3000-5000g的离心力条件下离心10-20min，再次回收离心上清；
(4)在200000-500000g的离心力条件下对回收的上清离心30-60min，离心后轻轻取出离心管，以移液管吸弃上部70％-90％体积的液体，将下部10％-30％体积的液体及沉淀混合均匀后作为制备ED治疗制剂的外泌体溶剂，在2-8℃条件下保存；
(5)人脐带间充质干细胞的培养：选取生长状态良好的，微生物检测均为阴性的，P2-P8的人源脐带间充质干细胞，按照3-5*104/cm2的初始密度接种于细胞培养瓶或细胞培养皿中，培养基为基础培养基中含有体积比浓度5-15％的胎牛血清的培养体系；
(6)接种培养2-4天后，细胞融合率达到80-95％，细胞生长状态良好，回收全部细胞，并以复方电解质溶液清洗细胞3-4次，将最终获得的细胞按照0.5-2*106/ml的浓度重悬于已经复温至18-24℃的步骤(4)得到的外泌体溶剂中，制备成联合制剂。
2.如权利要求1所述制备方法得到的用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂。
3.如权利要求2所述用于治疗勃起功能障碍的脐带间充质干细胞及其外泌体的联合制剂，通过静脉输注或微针倒入的给药方法。
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