CN113975467A - 一种牙髓牙本质复合体的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种牙髓牙本质复合体的制备方法及其应用。所述牙髓牙本质复合体的制备方法包括牙髓细胞的原代、传代培养；液相浓缩生长因子的制备；将所述培养后的牙髓细胞与液相浓缩生长因子混合，得到混合材料。从而制得牙髓牙本质复合体结构，有效促进牙髓组织的再生。本发明通过利用自体牙髓细胞和液相浓缩生长因子混合作为年轻恒牙牙髓组织工程支架，可促进牙根继续生长，减轻患者疼痛；取材无免疫型，牙髓干细胞移植可产生异位的牙髓样组织，可控制移植细胞的数量并筛选对牙髓牙本质复合体再生潜在效果最佳的细胞亚群，促进牙髓再生，恢复牙髓活力；液相生长因子能加速伤口愈合进程，并通过刺激细胞增殖分化和促进干细胞迁移从而利于组织再生。

Description

一种牙髓牙本质复合体的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及医疗器械技术领域，尤其涉及一种牙髓牙本质复合体的制备方法及其应用。
背景技术
目前，组织工程方法是未来实现牙髓组织再生的理想技术手段，为牙体牙髓疾病的治疗提供了新的方向。牙本质牙髓复合体具有分泌牙本质基质、保持牙齿活力、自身修复的潜能，向牙齿硬组织和形成牙本质提供营养，抵御外界伤害的作用。
因此，寻找一种再生牙本质牙髓复合体替代传统根管治疗的方式，恢复牙齿活力和功能，成为近年来科学研究及临床实践的发展方向。
牙髓牙本质复合体的构建研究是牙髓组织再生研究的关键，尽管人们已经在如何构建形成完整的牙髓牙本质复合体结构的方法上投入了大量的研究，却仍旧没有一种方法让人满意，没有能够完整地构建出牙髓牙本质复合体，也尚未有完整构建出牙髓牙本质复合体的材料。
浓缩生长因子(CGF)是第三代血小板浓缩物，其富含多种细胞生长因子，例如TGF-β、VEGF、PDGF、bFGF、BMP、IGF、EGF、OPG等和更为稳定的纤维蛋白三维立体网状结构，其拉伸强度和断裂应变的机械性能优良，但是内含的生长因子一至两周就会吸收降解，在临床应用中，生物材料的降解时间对于预后较为重要。目前对于液相浓缩生长因子(LPCGF)内生长因子释放及降解趋势尚需进一步研究。
发明内容
本申请为了解决上述技术问题提供一种牙髓牙本质复合体的制备方法及其应用。
本申请通过下述技术方案实现：
一种牙髓牙本质复合体的制备方法，其特征在于：包括：牙髓细胞的原代、传代培养；液相浓缩生长因子的制备；将所述培养后的牙髓细胞与液相浓缩生长因子混合，得到混合材料。
进一步的，牙髓细胞的原代、传代培养包括以下步骤：
S1分离培养：将完整的牙髓组织剪碎，然后采用组织块法联合胶原酶消化法分离牙髓细胞原代，加入完全培养基，吹打混匀后转移至细胞培养皿，放入培养箱培养，所述牙髓组织的获取包括以下步骤：将完整拔除后的因阻生或正畸拔除的健康、完整、无龋、无隐裂的智齿立即置入预冷含10％的青霉素链霉素双抗的PBS中，再用含1％PS的PBS冲洗离体牙三次，最后用锤子劈开后取出牙髓组织；
S2传代培养：取所述步骤S1后得到的牙髓细胞原代进行传代培养，待细胞达到80％融合时弃培养基，吸除培养皿内原细胞培养基，培养皿中加入PBS清洗一遍清除残留的血清，吸尽PBS后培养皿内加入胰蛋白酶液，放入培养箱进行培养，再消化，然后加入完全培养基终止消化；
S3扩增培养：反复吹打所述步骤S2后得到的牙髓细胞传代，制成细胞悬液后与所述步骤S1后得到的牙髓细胞原代一起离心，弃上清液后进行重悬，接种细胞到培养板，再加入培养基混匀，放入培养箱进行培养。
进一步的，所述步骤S1中采用组织块法联合胶原酶消化法分离牙髓细胞原代包括以下步骤：将剪碎的牙髓组织放入PBS内并离心，离心后弃上清液，加入I型胶原酶，再消化，然后加入DMEM培养基终止消化并离心，弃上清液后，得所述牙髓细胞原代。
进一步的，所述步骤S1的组织块法联合胶原酶消化法中PBS含1％PS；所述I型胶原酶体积为1mL，浓度为3mg/mL；所述DMEM培养基为3mL，DMEM培养基中含有10％FBS、1％PS；消化时间为45分钟。
进一步的，所述步骤S2中PBS为2mL；胰蛋白酶液为1mL；消化时间为2分钟。
进一步的，液相浓缩生长因子的制备包括以下步骤：用含肝素钠抗凝剂的采血管抽取9mL静脉血，置入离心机采用差速离心法进行离心，离心后中间层即为液相浓缩生长因子。差速离心法为先通过30秒加速离心后，再依次2700rpm(600g)2分钟、2400rpm(400g)4分钟、2700rpm(600g)4分钟、3000rpm3分钟，然后通过36秒减速离心。9mL静脉血可得到约200μL的液相浓缩生长因子提取物。
进一步的，所述消化为置于37℃水浴恒温箱中震荡消化；所述细胞培养皿为10cm；所述培养箱为5％CO2，每2天换一次培养基；
所述离心的时间为5分钟，转速为1100转每分钟。
优选地，使用普通培养基将所述培养后的牙髓细胞重悬到细胞悬液，密度为105个细胞/mL，然后通过三通管将相同体积的上述自体牙髓细胞与液相浓缩生长因子来回推动60秒混合，得到可植入牙髓腔中的混合材料。
本发明还提供一种构建牙髓牙本质复合体结构的生物支架材料，所述生物支架材料根据上述牙髓牙本质复合体的制备方法制备得到。
本发明还提供一种构建牙髓牙本质复合体结构的生物支架，所述生物支架由上述生物支架材料构成。
与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
本发明通过利用自体牙髓细胞和液相浓缩生长因子混合作为年轻恒牙牙髓组织工程支架，可促进牙根继续生长，减轻患者的疼痛；取材无免疫型，牙髓干细胞移植可产生异位的牙髓样组织，可控制移植细胞的数量并筛选对牙髓牙本质复合体再生潜在效果最佳的细胞亚群，促进牙髓再生，恢复牙髓活力；液相生长因子能加速伤口愈合进程，并通过刺激细胞增殖分化和促进干细胞迁移从而利于组织再生。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请实施方式的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施方式的限定。
图1中A是人牙髓细胞原代培养试验图，B是人牙髓细胞传代培养试验图；
图2中A是CGF和LPCGF中BMP-2生长因子含量变化示意图，B是CGF和LPCGF中PDGF-BB生长因子含量变化示意图，C是CGF和LPCGF中VEGF生长因子含量变化示意图，D是CGF和LPCGF中bFGF生长因子含量变化示意图；
图3中A是三通管均匀混合hDPCs和LPCGF示意图，B是新鲜hDPCs和LPCGF复合体示意图，C是脱水冻干hDPCs和LPCGF复合体示意图；
图4中A、B、C、D均是hDPCs在LPCGF纤维蛋白网上的黏附情况示意图，其中黄色箭头示意人牙髓细胞、红色箭头示意红细胞、白色箭头示意白细胞；
图5中A、B分别是不同浓度的LPCGF对hDPCs增殖影响柱状图、折线图；
图6中A是0h镜下观察彩图，B是无血清培养12h后LPCGF对hDPCs迁移影响示意图，C是2％血清培养12h后LPCGF对hDPCs迁移影响示意图，D是无血清25％LPCGF培养12h后LPCGF对hDPCs迁移影响示意图，E是无血清50％LPCGF培养12h后LPCGF对hDPCs迁移影响示意图，F是无血清100％LPCGF培养12h后LPCGF对hDPCs迁移影响示意图；
图7中A、B、C、D分别是0％LPCGF、25％LPCGF、50％LPCGF、100％LPCGF下对hDPCs矿化诱导7天后茜素红染色的结果示意图，E、F、G、H分别是0％LPCGF、25％LPCGF、50％LPCGF、100％LPCGF下对hDPCs矿化诱导14天后茜素红染色的结果示意图，I、J、K分别是25％LPCGF、50％LPCGF、100％LPCGF下对hDPCs矿化诱导14天后茜素红染色的结果局部放大示意图；
图8中A、B、C、D分别是0％LPCGF、25％LPCGF、50％LPCGF、100％LPCGF下对hDPCs矿化诱导7天后ALP色的结果示意图，E、F、G分别是25％LPCGF、50％LPCGF、100％LPCGF下对hDPCs矿化诱导7天后ALP色的结果局部放大示意图；
图9中A是hDPCs矿化诱导7天DSPP基因表达图，B是DPCs矿化诱导7天RunX2基因表达图；
图10是预备后的离体牙根段牙本质环示意图；
图11中A是裸鼠移植2月后解剖示意图，B是裸鼠移植2月后肉眼观察结果示意图；
图12中A、B、C是空白组1.25X、10X、40X下H&E染色结果示意图，D、E、F是hDPCs-LPCGF组1.25X、10X、40X下H&E染色结果示意图，G、H、I是hDPCs组1.25X、10X、40X下H&E染色结果示意图，J、K、L是hDPCs-BC组1.25X、10X、40X下H&E染色结果示意图；
图13中A、B、C是空白组1.25X、10X、40X下免疫组化DSPP染色结果示意图，D、E、F是hDPCs-LPCGF组1.25X、10X、40X下免疫组化DSPP染色结果示意图，G、H、I是hDPCs组1.25X、10X、40X下免疫组化DSPP染色结果示意图，J、K、L是hDPCs-BC组1.25X、10X、40X下免疫组化DSPP染色结果示意图。
图14中A、B、C是空白组1.25X、10X、40X下免疫组化VEGF染色结果示意图，D、E、F是hDPCs-LPCGF组1.25X、10X、40X下免疫组化VEGF染色结果示意图，G、H、I是hDPCs组1.25X、10X、40X下免疫组化VEGF染色结果示意图，J、K、L是hDPCs-BC组1.25X、10X、40X下免疫组化VEGF染色结果示意图；
图15中A、B、C是空白组1.25X、10X、40X下免疫组化NESTIN染色结果示意图，D、E、F是hDPCs-LPCGF组1.25X、10X、40X下免疫组化NESTIN染色结果示意图，G、H、I是hDPCs组1.25X、10X、40X下免疫组化DSPP染色结果示意图，J、K、L是hDPCs-BC组1.25X、10X、40X下免疫组化NESTIN染色结果示意图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将结合实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施方式的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
实施例一
1.牙髓细胞的原代、传代培养
S1分离培养：收集就诊于四川大学华西口腔医院口腔外科门诊18～22岁患者因阻生或正畸拔除的健康、完整、无龋、无隐裂的智齿，均征得患者及其家属知情同意。完整拔出后立即置入预冷含10％的青霉素链霉素双抗的PBS中，冰盒冷藏迅速带入实验室。用含1％PS的PBS冲洗离体牙三次，无菌条件下用锤子劈开。超净台内取出牙髓组织并将其剪碎，剪碎后放入含1％PS的PBS中，随后放入离心管并在1100转每分钟的转速下离心5分钟，离心后弃上清液，加入1mL的3mg/mL的I型胶原酶，再放置在37摄氏度的水浴恒温箱中震荡消化45分钟，然后加入3mL含10％FBS、1％PS的DMEM培养基终止消化。消化完后再次放入离心管，在1100转每分钟的转速下离心5分钟，弃上清液后，得所述牙髓细胞原代，加入完全培养基，轻轻吹打混匀后转移至10cm细胞培养皿，放入5％CO2培养箱培养，细胞培养期间每2天换一次培养基。培养4天后镜下观察培养皿，如图1A所示，可见有少量原代细胞贴壁，单核长梭形，部分细胞呈椭圆形或多角形，散在分布。
S2传代培养：取步骤S1后得到的牙髓细胞原代进行传代培养，待细胞达到80％融合时，常规1:3传代，吸除培养皿内原细胞培养基，培养皿中加入2mL无菌PBS清洗一遍清除残留血清，吸尽PBS后培养皿内加入1mL胰蛋白酶液，放入5％CO2培养箱进行培养，再放置在37摄氏度的水浴恒温箱中震荡消化2分钟，镜下观察细胞间隙增大后轻拍培养皿侧壁至大部分细胞脱离皿底，然后加入等体积的完全培养基终止消化。
S3扩增培养：反复吹打步骤S2后得到的牙髓细胞传代，制成细胞悬液移至离心管，与步骤S1后得到的牙髓细胞原代一起在1100转每分钟的转速下离心5分钟，弃上清液后进行重悬，接种细胞到培养板，再加入培养基，放入5％CO2培养箱培养，细胞培养期间每2天换一次培养基。传代培养后镜下观察牙髓细胞传代，如图1B所示，可见细胞多为形态较为一致的长梭形，细胞排列紧密，单层长满后可出现复层生长现象。
2.浓缩生长因子、液相浓缩生长因子的制备及生长因子的检测
本试验招募两男两女4名志愿者，志愿者的纳入标准为：年龄18-25岁，身体健康；排除标准为：患有肝炎等传染病及免疫系统疾病史的患者，患有血液性疾病的患者，近3个月有感染病史、服用抗菌药物者，近3个月服用阿司匹林等影响血小板功能的药物，妊娠期、哺乳期、月经期女性。
采用Medifuge离心加速剂特殊匹配的9mL红色管帽采血管(制备富自体浓缩生长因子凝胶)和9mL绿色管帽采血管(制备液相浓缩生长因子)，分别抽取每个志愿者静脉血，红色管帽和绿色管帽各两管，随后放入离心机选择相应程序差速离心，即先通过30秒加速离心后，再依次2700rpm(600g)2分钟、2400rpm(400g)4分钟、2700rpm(600g)4分钟、3000rpm3分钟，然后通过36秒减速离心，离心后中间层即为浓缩生长因子提取物(CGF)和液相浓缩生长因子提取物(LPCGF)。
本实施例通过酶联免疫吸附法(即ELISA)分别检测CGF和LPCGF在制备1天及7天后相应主要的生长因子VEGF、PDGF-BB、bFGF、BMP-2的浓度变化，根据实验要求分别对离心后的红色管帽采血管和绿色管帽采血管采取以下处理：
(1)红色管帽采血管中上层为淡黄色澄清液体，吸除中间层CGF凝胶无菌PBS冲洗后，放入研钵中即刻烟弹冷冻5分钟，再37摄氏度水浴融化5分钟，重复三次，转移至离心管，在3000转每分钟的转速下离心10分钟，收集上清液即为CGF。经0.22μm滤器过滤除菌后，留取上清液保存备用待测。
(2)绿色管帽采血管吸取中间约2mL的LPCGF配合使用APAG活性白蛋白凝胶制造仪，在75摄氏度温度下白加热5分钟后保存备用待测。
经上述处理完成的血制品，每两份血制品作为一组用于后续ELISA试验。
在制备后1天及7天，分别对每组血制品内含的VEGF、PDGF-BB、bFGF、BMP-2进行定性及定量检测，ELISA试验检测步骤包括：1)试剂盒及-80℃的待测样品在室温平衡15分钟。在酶标板上设标准品孔6孔，将其从标准曲线的最高浓度依次倍比稀释，标准品稀释液(0pg/mL)作为空白孔。用蒸馏水稀释浓缩洗涤液(30X)后备用；2)加样时设标准孔、待测样品孔、空白孔。各组待测样品均稀释5倍；3)封板37摄氏度温育30分钟；4)弃去液体，洗涤液洗涤5次，拍干；5)每孔加入工作液试剂50μL；6)温育和洗涤同前；7)每孔依次加入显色剂A和B各50μL，室温避光显色15分钟；8)每孔加终止液50μL；9)确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，用空白孔调零，立即用酶标仪在测量各孔在450nm的吸光度(OD值)。检测结果如表1所示，所得数据均用平均数±标准差表示，两组间各种生长因子浓度差异比较采用单因素方差分析，检验水准定为0.05，即P<0.05，差异具有统计学意义。
表1生长因子的含量检测结果，P<0.05
Figure BDA0003312246540000051
根据检测结果及图1可知，随着时间推移，CGF组bFGF、BMP-2、PDGF和VEGE浓度均高于LPCGF组(p＜0.05)，CGF组及LPCGF组BMP-2释放量均成上升趋势，VEGF均成下降趋势，CGF组bFGF和PDGF-BB成下降趋势，LPCGF组则缓慢上升，其余两种生长因子降解速度缓慢。综上，LPCGF经APAG加热处理后仍含有多种的生长因子，其生长因子含量虽然低于CGF凝胶，但其降解速度下降，有缓慢释放的作用，可以长期在治疗局部稳定表达生长因子浓度，更有利于应用于临床中组织再生微环境因子浓度的维持。
3.液相浓缩生长因子对牙髓细胞增殖的生物学影响
如图3所示，取生长状态良好的第3代hDPCs制备成细胞悬液并计数，12孔板每孔底放有细胞爬片，制备LPCGF冷却至室温后，利用三通管将LPCGF和细胞混合均匀接种至细胞爬片表面(图3A)，加入完全培养基，置于培养箱中培养，每2天换一次液(图3B)。接种培养7天后吸走培养基，用PBS冲洗细胞爬片，2.5％戊二醛固定，乙醇梯度脱水，临界点干燥，细胞爬片喷金镀膜，扫描电子显微镜观察(图3C)。
hDPCs和LPCGF共培养7天后扫描电镜观察结果如图4所示(黄色箭头示意人牙髓细胞，红色箭头示意红细胞，白色箭头示意白细胞)，可见LPCGF纤维蛋白网表面，牙髓细胞生长状态良好，较多而密集，细胞胞体丰满，伸出许多长而细的伪足相互连接成叠层网状生长，部分细胞的伪足伸入纤维间隙。LPCGF纤维蛋白网密集存在空隙间可见白细胞(胞体大，呈球状)及红细胞(圆盘双凹状)散落分布。
为探究LPCGF对hDPCs增殖、迁移、分化的影响，分别进行以下试验：
(1)LPCGF对hDPCs增殖的影响
1)取第3代细胞制备细胞悬液并计数，调整细胞浓度为2×103个/孔接种于96孔板内，每孔100μL，置于细胞培养箱内培养，分为空白组(无细胞)、对照组(无LPCGF的完全培养基培养)、25％LPCGF、50％LPCGF、100％LPCGF组，每组设置5个复孔。培养一天后，更换不同浓度的LPCGF培养基及完全培养基。
2)分别于培养1、3、5天后，每天固定时间取5孔弃去原培养液，每孔细胞重新加入细胞培养液100μL以及CCK-8液100μL，孵育1.5小时，酶标仪检测各孔在A450的吸光度OD值。
3)以时间(D)为横坐标，去掉最高值和最低值，剩余三孔的平均OD值为纵坐标，对比各组细胞增殖能力。增殖实验采用的CCK-8试剂盒是广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度的试剂盒，最终显色的橙黄色深浅与增殖成正比，450nm波长OD值可以间接反映细胞数量。
试验结果如图5所示，可见LPCGF对于hDPCs增殖有促进作用，且有浓度效应，100％LPCGF对于其增殖作用促进效果最为明显。第1天和第5天，其余四组与无细胞完全空白组hDPCs增殖存在差异(P＜0.05)，其余四组间无明显差异(P＞0.05)；第3天，其余四组与无细胞完全空白组hDPCs增殖存在差异(P＜0.05)，50％LPCGF组和100％LPCGF组与基础培养基组存在差异(P＜0.05)，25％LPCGF与基础培养基组无明显差异(P＞0.05)。
(2)细胞迁移试验
1)按5×105个/孔接种牙髓细胞至6孔板。实验分组为对照组(无FBS的培养基培养)，25％LPCGF、50％LPCGF、100％LPCGF组(无FBS的培养基)，2％FBS组。
2)第二天用200μL枪头比着直尺，以间距0.5cm划横线，每个孔划5条横线。
3)PBS洗去脱落细胞后，加入无FBS、2％FBS及不同浓度的无FBS的LPCGF培养基。
4)0h镜下观察采图后，放入培养箱培养12小时后再次观察拍照。
试验结果如图6所示，12小时内25％与50％LPCGF对于细胞迁移趋化影响较100％LPCGF组大，3组浓度LPCGF均比空白组迁移能力高，但不同浓度LPCGF组间无明显差异。
(3)CGF对hDPSCs矿化诱导茜素红染色
1)取第三代细胞制备细胞悬液并计数，按1×104/孔的密度将细胞接种于12孔板内并随机分为实验组和对照组，每组各设3个复孔。
2)待细胞长满约80％以后，实验组换为含矿化诱导液的25％LPCGF、50％LPCGF、100％LPCGF条件培养基，对照组使用含矿化诱导液的培养基，每孔细胞加液量均为1.5mL，置于培养箱中培养，每2天换液一次。
3)细胞诱导7天、14天后，弃去培养液，PBS清洗两遍，用4％多聚甲醛固定细胞30分钟，加入0.1％茜素红染液染色15分钟，双蒸水清洗两遍，倒置显微镜下观察细胞矿化结节形成情况。
试验结果如图7所示，不同浓度LPCGF配制的成骨诱导条件培养液可以成功诱导hDPCs成骨分化，形成钙化结节。第7天时，三种不同浓度的LPCGF组均已形成少量钙化结节；第14天时，可见LPCGF组中钙化结节数目更多，三组不同浓度LPCGF组的钙化结节均较矿化空白组明显增多，其中25％LPCGF组中钙化结节数目和面积明显高于其他两组。
(4)CGF对hDPSCs矿化诱导碱性磷酸酶染色
1)细胞铺板密度、分组同上述茜素红染色。
2)细胞矿化诱导7天后，细胞固定方法同上述茜素红染色。细胞固定后加入按比例配置的碱性磷酸酶染色工作液，室温孵育30分钟，吸去染色液，双蒸水漂洗两遍，倒置显微镜下观察细胞矿化结节形成情况。
实验结果如图8所示，hDPCs矿化诱导至第7天时进行碱性磷酸酶(ALP染色)，不同浓度的LPCGF组染色较深与矿化空白组，表明其对hDPCs成牙本质向分化有促进作用，但三组LPCGF之间无明显差异。
(5)qPCR检测基因表达水平
将细胞计数约1×105个/mL的细胞悬液接种至6孔板，分为矿化组、25％、50％、100％LPCGF组(含矿化诱导液)，培养7天后，提取总RNA。
1)样本总RNA提取
①PBS冲洗6孔板1遍，吸干孔板底部多余水分，将其放于置于冰上。
②每孔加入1mLTRIZOL试剂，反复吹打，充分裂解细胞。
③将细胞裂解液转移至1.5mL的Eppendorf管中，室温放置5分钟。
④加入200μL氯仿，猛烈晃动15秒，室温放置5分钟。
⑤于4摄氏度下12000转每分钟的转速下离心5分钟，轻轻吸取上层水相转至新EP管中。
⑥加入0.5mL异丙醇，颠倒混匀，冰上沉淀l0分钟。
⑦于4摄氏度12000转每分钟的转速下离心l0分钟，弃上清，管底可见白色RNA沉淀。
⑧加入1mL75％乙醇，4摄氏度12000转每分钟的转速下离心5分钟，弃上清。
⑨干燥5分钟，加入20μL无酶水溶解，-80摄氏度冻存。
2)总RNA浓度检测
RNA逆转录前，吸取1μLRNA，检测OD260与OD280的比值，以测定RNA纯度。
3)qPCR引物
基因 引物序列
GAPDH-HUMAN-F GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT
GAPDH-HUMAN-R GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
DSPP-F TTTGGGCAGTAGCATGGGC
DSPP-R CCATCTTGGGTATTCTCTTGCCT
RUNX-F CCTTTACTTACACCCCGCCA
RUNX-R GGATCCTGACGAAGTGCCAT
4)逆转录合成cDNA
①采用PrimeScriptTM RT-PCR Kit试剂盒(Takara)在合成仪上进行逆转录。
②用20μL逆转录反应体系：1μg总RNA、1μL oligo(dT)primer和4μL PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I。按照说明书进行逆转录。
③逆转录得到模板cDNA，置于-20摄氏度保存备用。
5)qPCR检测
①qPCR反应体系采用Takara公司SYBR Premix Ex TaqTM 12.5mL体系：Taq酶5μL，上游引物1μL,下游引物1μL，cDNA 1μL，其余RNA-free水补足。
②反应条件：95摄氏度(预变性)10秒，1个循环；95摄氏度(变性)5秒，60摄氏度(退火和延伸)30秒，40个循环，每个样本设置3个复孔。目的基因mRNA相对浓度经公式x＝2-ΔΔCt计算，其中x＝目的基因经内参基因校正后的相对倍数。
qPCR比较不同组的牙髓细胞矿化诱导7天后DSPP和RUNX2表达情况如图9所示，25％LPCGF组DSPP表达较空白对照组升高1.8倍(P＜0.05)，而不同浓度LPCGF组RUNX2表达与空白对照组无明显差异(P＞0.05)。
综上所述，hDPCs可定植黏附于LPCGF纤维蛋白网形成hDPCs-LPCGF聚合体，LPCGF促进hDPCs增殖具有浓度效应，不同浓度的提取液均能促进hDPCs迁移及成牙本质分化，25％LPCGF组促进DSPP基因表达量最高，各组间促进hDPCs成骨分化RUNX2基因表达变化不大(P＞0.05，无统计学差异)，表明hDPCs在LPCGF的刺激下更倾向于成牙向分化，而不是成骨向分化。
4.牙髓细胞及浓缩生长复合物的体内移植
(1)制备牙本质环
1)如图10所示，收集单根管离体牙，刮除牙根表面软组织，利用涡轮机沿釉牙本质界去除牙冠，根尖份截根，截取牙齿根方部分制备成8mm长(釉牙本质界断面至根尖孔开口处)的牙根段，根尖孔敞开直径2mm，共60个。
2)拔髓针去净根管内牙髓，随机分为4组，每组15个样本，使用S3镍钛器械预备，配合使用1.25％NaClO和17％EDTA溶液交替冲洗。预备后超声震荡流程如下：1.25％NaClO和17％EDTA溶液各震荡5分钟，中间和最后一步使用PBS震荡5分钟。
3)高压蒸汽灭菌后，将预备后的牙本质环放入1％双抗PBS，置于4摄氏度冰箱储存。术前用无菌生理盐水冲洗，纸尖干燥，调和MTA封闭冠方(约1mm厚)，再使用玻璃离子封闭冠方根管口。
(2)裸鼠皮下移植
1)实验分组为空白组，hDPCs-LPCGF复合体组，hDPCs组，hDPCs-BC组(血凝块来源于提取LPCGF时离心最下层血细胞凝固后)。制备LPCGF后APAG加热提取方式同上述相应部分试验。
2)配置4％水合氯醛，现配现用，手术器械高温高压消毒后置于超净台紫外线消毒照射30分钟。
3)称量10只6周龄雌性裸鼠体重，碘伏消毒腹部，以0.1mL/10g的剂量进行腹腔麻醉。
4)碘伏消毒背部，每只裸鼠背部左右前后肢位置剪开纵形长约1cm切口，钝性分离皮下组织，将含有hDPCs-LPCGF复合体、hDPCs，hDPCs-BC牙根段塞入钝性分离盲端，每个切口各为一组(含空白组)。
5)根尖孔用可吸收明胶海绵封住，缝合切口，用碘伏消毒缝线处。
6)密切关注裸鼠状态，一周后缝线均自动脱落。
(3)H&E染色
1)术后2个月，过量麻醉处死裸鼠，取出皮下移植的各组牙本质环，EDTA脱钙液脱钙约8周至样本柔软，石蜡包埋，4μm沿牙体长轴方向连续切片，置入65摄氏度烤箱烤片过夜。
2)石蜡切片脱蜡，水化：二甲苯脱蜡15～20分钟，分别按100％、95％、90％、80％酒精梯度水化，蒸馏水漂洗2次，每次5分钟。
3)苏木素染色5分钟，自来水漂洗。
4)盐酸酒精分化30秒。
5)1:400氨水返蓝1分钟。
6)常规脱水，透明：80％、90％梯度酒精脱水。
7)伊红染色2分钟。
8)100％酒精、二甲苯脱水，中性树脂封片。
9)选取牙本质环靠近髓腔中心的切片观察采图。
如图11所示，裸鼠移植复合体2月后处死，肉眼可见根管内部有新生软组织生成。H&E染色结果如图12所示，hDPCs-LPCGF组H&E染色，根管内可见新生的类牙髓组织，根管内壁可见有新生牙本质沉积，根尖1/3可见血管网状结构，管腔内可见纤维样组织；hDPCs-血凝块组管腔内MTA下方可见微血管结构内含大量红细胞；hDPCs组的根尖份可见充满纤维组织，接近根尖区域可见大量红细胞，冠方空虚；空白组根尖份有部分红细胞。
(4)免疫组化染色
1)切片脱蜡后，组化笔标记染色组织，胰蛋白酶修复液抗原修复，37℃孵育20～40分钟，PBS冲洗2次，每次5分钟。
2)氧化还原酶封闭，37摄氏度，3分钟，PBS冲洗2次，每次5分钟。
3)血清封闭，37摄氏度，30分钟，去血清后加入DSPP、NESTIN、VEGF一抗。4摄氏度过夜。
4)PBS清洗5分钟3次后加入二抗37摄氏度孵箱内孵育30分钟，混合A液：B液：PBS按10μL:10μL:1mL比例配制待用。
5)PBS清洗5分钟3次，加入配置好的混合液37摄氏度孵育30分钟。
6)孵育结束PBS清洗5分钟3次，加入显色液，镜下观察组织显色情况，苏木素染核，冲洗干燥、封片、采图。
免疫组化DSPP、VEGF、NESTIN染色结果分别如图13～图15所示，显示DSPP阳性信号多分布于髓腔内侧成牙本质细胞层附近，表明有新生成牙本质；VEGF阳性信号分布于血管管壁周围，提示有新生血管样组织；NESTIN阳性信号散在分布于髓腔内部组织间，提示有类神经样组织生成。
综上所述，hDPCs-LPCGF复合体可以成功的实现类牙髓样组织异位再生，具有牙本质、血管和神经样组织结构。
以上的具体实施方式，对本申请的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种牙髓牙本质复合体的制备方法，其特征在于：包括：
牙髓细胞的原代、传代培养；
液相浓缩生长因子的制备；
将所述培养后的牙髓细胞与液相浓缩生长因子混合，得到混合材料。
2.根据权利要求1所述的牙髓牙本质复合体的制备方法，其特征在于：牙髓细胞的原代、传代培养包括以下步骤：
S1分离培养：将完整的牙髓组织剪碎，然后采用组织块法联合胶原酶消化法分离牙髓细胞原代，加入完全培养基，吹打混匀后转移至细胞培养皿，放入培养箱培养；
S2传代培养：取所述步骤S1后得到的牙髓细胞原代进行传代培养，待细胞达到80%融合时弃培养基，吸除培养皿内原细胞培养基，培养皿中加入PBS清洗一遍清除残留的血清，吸尽PBS后培养皿内加入胰蛋白酶液，放入培养箱进行培养，再消化，然后加入完全培养基终止消化；
S3扩增培养：反复吹打所述步骤S2后得到的牙髓细胞传代，制成细胞悬液后与所述步骤S1后得到的牙髓细胞原代一起离心，弃上清液后进行重悬，接种细胞到培养板，再加入培养基混匀，放入培养箱进行培养。
3.根据权利要求1或2所述的牙髓牙本质复合体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中采用组织块法联合胶原酶消化法分离牙髓细胞原代包括以下步骤：将剪碎的牙髓组织放入PBS内并离心，离心后弃上清液，加入I型胶原酶，再消化，然后加入DMEM培养基终止消化并离心，弃上清液后，得所述牙髓细胞原代。
4.根据权利要求3所述的牙髓牙本质复合体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1的组织块法联合胶原酶消化法中PBS含1%PS；
所述I型胶原酶体积为1mL，浓度为3mg/mL；
所述DMEM培养基为3mL，DMEM培养基中含有10%FBS、1%PS；
消化时间为45分钟。
5.根据权利要求3或4所述的牙髓牙本质复合体的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中PBS为2mL；
胰蛋白酶液为1mL；
消化时间为2分钟。
6.根据权利要求2所述的牙髓牙本质复合体的制备方法，其特征在于：液相浓缩生长因子的制备包括以下步骤：采用差速离心法离心血液，离心后中间层即为液相浓缩生长因子提取物。
7.根据权利要求2、5或6所述的牙髓牙本质复合体的制备方法，其特征在于：所述消化为置于37℃水浴恒温箱中震荡消化；
所述细胞培养皿为10cm；
所述培养箱为5%CO2，每2天换一次培养基；
所述离心的时间为5分钟，转速为1100转每分钟。
8.根据权利要求1所述的牙髓牙本质复合体的制备方法，其特征在于：将所述培养后的牙髓细胞重悬到细胞悬液中，然后与液相浓缩生长因子等体积混合均匀，得到混合材料。
9.一种用于构建牙髓牙本质复合体结构的生物支架材料，其特征在于：所述生物支架材料根据权利要求1~8中任一项所述的牙髓牙本质复合体的制备方法制备得到。
10.一种用于构建牙髓牙本质复合体结构的生物支架，其特征在于：所述生物支架采用权利要求9所述的生物支架材料制作。
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