CN100496624C - 一种组织工程化骨复合体及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织工程化骨复合体，由呈多孔状且孔径间贯通的人工骨支架及植入孔中的转染有血管内皮细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞组成；本发明还公开了所述组织工程化骨复合体作为骨缺损修复材料的应用。本发明的组织工程化骨复合体可使种子细胞在发挥成骨作用的同时，表达分泌VEGF，从而促进血管的生成与长入，为新骨生成提供物质基础，有利于血管化组织工程骨组织的新生，提高组织工程骨组织修复骨缺损的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程中组织工程方法构建人工骨技术领域，尤其涉及一种组织工程化骨复合体及其构建方法与应用。
背景技术
在生命活动中由外伤、感染、肿瘤及先天性疾病等原因造成的骨缺损十分常见，尤其肢体创伤所造成的骨缺损发病率高达10％，骨缺损的治疗和修复是骨科临床常见的难症之一。已有研究表明长管状骨骨干的直径决定了骨缺损能否自行愈合的长度，当骨干骨缺损长度超过其直径的1.5～2.5倍时即难以自行愈合，需要植骨材料修复，但目前临床使用的骨修复材料因各有利弊，不能达到修复骨缺损理想材料的要求。
近年来随着组织工程技术的发展，构建有生命活性的组织工程化复合材料的研究有了一定的进展，这无疑将会对临床治疗骨缺损带来重大的科学意义和实用价值。但对如何构建理想的骨组织工程复合材料及其制备和应用，即如何制备得到良好的骨替代材料，并使其与种子细胞联合培养，同时以何方式添加信号因子等具体方法的研究还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种组织工程化骨复合体及其构建方法。
本发明旨在利用纳米技术和三维造孔技术，将纳米羟基磷灰石和羧甲基壳聚糖制备成一种与天然松质骨类似的三维孔洞网状结构，形成多孔状、孔隙率高、力学性能好的纳米人工骨基质材料，并以人工骨支架标准模具或设定的模具制备成人工骨支架，然后将血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)基因转染骨髓间充质干细胞(bone marrow strone cell，BMSCs)并植入此人工骨支架内，构建组织工程骨复合体，最终目的实现在所需的解剖部位或骨缺损部位激发成骨，并使新骨与周围健康骨在结构上整合在一起，同时可根据生理活动中所承受的负荷进行重塑，成为能终身发挥功能的自身骨的一部分。
本发明的组织工程化骨复合体，其特征是：所述骨复合体由呈多孔状且孔径间贯通的人工骨支架及植入孔中的转染有血管内皮细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞组成；其中，所述人工骨支架由质量比为6～7∶4～3的纳米羟基磷灰石与羧甲基壳聚糖制成，其孔隙率为65％～75％，孔径尺寸2微米～600微米，以圆形为主；所述骨髓间充质干细胞是人骨髓间充质干细胞ATCC NO.CRL-2496或兔骨髓间充质干细胞；所述血管内皮细胞生长因子基因是人基因VEGF165或兔基因VEGF165。
其中：所述人工骨支架优选由质量比为3∶2的纳米羟基磷灰石与羧甲基壳聚糖制成，其孔隙率为70％～75％，孔径尺寸200微米～450微米；所述骨髓间充质干细胞优选兔骨髓间充质干细胞；所述血管内皮细胞生长因子基因优选兔基因VEGF165。
上述兔骨髓间充质干细胞由下述方法分离与培养：
体重1.5±0.3kg新西兰大白兔，无菌条件下抽取其髂骨骨髓3±0.5ml，DME/F-12培养液冲洗，离心1000r×5min，弃上清液，DME/F-12培养液重悬制成单细胞悬液；血球计数板计数，以5×105个/ml密度接种于50ml玻璃细胞培养瓶中，37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，24h～48h后倒置显微镜下观察；0.25％胰酶消化原代细胞3min，以1×105个/ml按1∶2比例传代接种培养；取部分细胞以1×103个/ml接种于24孔培养板中，每天随机取3个孔细胞，血球计数板计数，以细胞数为纵标，天数为横标绘制细胞生长曲线。
本发明所述组织工程化骨复合体的构建方法，步骤是：
(1)将纳米羟基磷灰石与羧甲基壳聚糖按质量比为6～7∶4～3的比例分别配料，以机械球磨使其充分混合；再按纳米羟基磷灰石/羧甲基壳聚糖复合粉体与对二氯苯按质量比为1∶1～1.2的比例称料，研磨混合，然后超声振荡2h～3h，使其充分混匀；向混合料中加入质量百分比为16.7％的柠檬酸溶液并调和均匀，柠檬酸溶液用量以混合料能可塑成形为准；将成形混合料放入人工骨支架标准模具或依目的设定的模具中，加压成形，保压60s～100s；脱模，先将成形复合材料在空气中放置4h～5h，再置于无水乙醇中，超声振荡8h～10h，之后于80℃烘干3h～5h，得人工骨支架；
(2)取骨髓间充质干细胞人骨髓间充质干细胞ATCC NO.CRL-2496或兔骨髓间充质干细胞，以配方为地塞米松8-10mol/L、β-甘油磷酸钠0.01mol/L、维生素C0.05g/L、胎牛血清100ml/L的培养液37℃培养2～4天，诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，并以碱性磷酸酶的表达及钙结节形成能力为检测指标，待分化率达65％以上时，收集细胞，备用；
(3)按Trizol试剂说明书的要求提取上述骨髓间充质干细胞总RNA；以提取的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下反转录合成VEGF165 cDNA序列；
(4)依据GenBank中报告的人基因VEGF165[AB021221]或兔基因VEGF165[AY196796]序列，应用Premier 5.0设计引物：
其中：人基因VEGF165 PCR引物序列为：
上游5’-CCTTGCTGCTCTACCT-3’
下游5’-ATGCTTTCTCCGCTCT-3’；
兔基因VEGF165 PCR引物序列为：
上游5’-GTGGACATCTTCCA-3’
下游5’-CTTTGGTCTGCATTCACA-3’；
以VEGF165基因cDNA为模板，行PCR反应扩增人VEGF165基因或兔VEGF165基因；其反应条件为：扩增94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃(55℃、56℃、58℃)退火1min，72℃延伸2min，循环35次；72℃延伸10min；
扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察电泳条带并回收；
(5)限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切载体pcDNA3.1和人VEGF165基因或兔VEGF165基因；回收酶切产物并以T4DNA连接酶将载体pcDNA3.1和人VEGF165基因或兔VEGF165基因连接，构建pcDNA3.1-VEGF165重组质粒；
(6)重组质粒pcDNA3.1-VEGF165经鉴定后，以200±50ng/mm3的量植入含有104-105个/mm3骨髓间充质干细胞的人工骨支架孔中或人工骨支架孔中，形成组织工程化骨复合体；
(7)组织工程化骨复合体鉴定：采用光镜及电镜观察骨支架材料中细胞粘附力、成骨能力；或取一定量细胞采用RT-PCR检测VEGF的mRNA的表达，采用免疫组化的方法检测VEGF蛋白的表达。
本发明所述组织工程化骨复合体作为骨缺损修复材料的应用。
利用本发明所述组织工程化骨复合体对兔桡骨中段15mm长的骨缺损模型进行实验：
随机分为4组：空白对照组、单纯纳米羟基磷灰石—羧甲基壳聚糖材料组、BMSCs复合纳米羟基磷灰石—羧甲基壳聚糖材料组、转染VEGF基因BMSCs复合纳米羟基磷灰石—羧甲基壳聚糖材料组，采用X线、光镜、免疫组化、RT-PCR等方法对比四组的成骨能力。
观察指标：影像学观察----按照不同时间段拍摄X线照片观察成骨情况；组织学观察----大体标本及组织学改变，移植体新生骨面积的定量组织学分析。面积定量分析采用高清晰度彩色病理图象分析仪测定。免疫组织化学观察----将所得标本进行Brdu免疫组化染色，观察Brdu标记阳性细胞。
结果显示：外观自术后2w时实验组与对照组间即显示出明显区别，至6w时实验组骨质外观连续，质地硬韧，而对照组为缺损尚未填满，8w时两组外观相近，但缺损处质地不一，说明VEGF质粒对组织修复确实起到促进作用；X线照片观察术后第八周，对照组骨缺损未愈合，应用VEGF转染质粒治疗的试验组骨缺损已修复。组织学观察应用VEGF转染质粒治疗的试验组8w时新生骨逐渐成熟，部分髓腔再通，但较狭窄；对照组表面布满成骨细胞，已有新生骨形成；12w骨缺损完全愈合，皮质骨形成，皮质主要由编织骨组成，部分由新生的骨单位构成，髓腔再通；对照组新骨及髓腔改建过程尚未完成。应用显微镜观察免疫组化染色切片，细胞浆或ECM染为棕黄或棕褐色颗粒者为阳性标志；I型胶原及III型胶原阳性表达定位于ECM中，采集图像并分析：实验组III型胶原于术后4w即有大量阳性表达，持续至8w，至12w时相对减弱；对照组阳性表达与实验组趋势一致，时间也相应滞后；实验组I型胶原于术后第2w表达呈弱阳性，随时间延长而逐渐增强，至12w时呈强阳性表达；对照组表达趋势一致，但与实验组比较，时间较晚。VEGF在骨缺损的mRNA表达程度不一，实验组术后1w VEGF即有表达，随时间延长表达增强，2w达高峰，3w较2w时下降，后呈下降趋势，至第6w后达到稳定水平。
实验还证实：纳米羟基磷灰石与羧甲基壳聚糖均具有良好的生物相容性，经对纳米羟基磷灰石的研究包括动物组织相容性、抗凝血性能、分子生物学研究、骨传导性等证实均未发现明显异常反应。
采用基因工程将信号因子VEGF转染种子细胞，可使种子细胞在发挥成骨作用的同时，表达分泌VEGF，从而促进血管的生成与长入，为新骨生成提供物质基础，有利于血管化组织工程骨组织的新生，提高组织工程骨组织修复骨缺损的效果。
附图说明
图1兔双侧桡骨缺损15cm模型术后即刻X照片
其中：右侧为实验组：缺损处填充明胶海绵及VEGF质粒；左侧为对照组：缺损处填充明胶海绵及生理盐水。
图2兔双侧桡骨缺损15cm模型术后第八周X照片
其中：X线照片观察术后第八周，对照组骨缺损未愈合(左侧)，应用VEGF转染质粒治疗的实验组骨缺损已修复(右侧)。
图3桡骨中段骨缺损大体标本照片
术后2w桡骨中段骨缺损大体标本，实验组纤维组织已充填缺损(左上图上)，质韧；对照组肉芽组织形成不完善(左上图下)。术后4w，实验组缺损已基本修复(右上图上)，骨痂充填，外观平滑；对照组纤维骨痂形成，但未完全充填(右上图下)；术后6w实验组骨质外观连续，质地硬韧(左下图)，对照组为纤维骨痂，缺损仍未填满(右下图)。
图4术后2w实验组HE染色结果照片(HE×100)
术后2w实验组间充质细胞和纤维母细胞大量增生，血管丰富，骨痂开始形成。
图5术后4w实验组与对照组HE染色结果照片(HE×100)
左图术后4w实验组血管丰富，成骨细胞增殖，骨痂及少量新骨形成。
右图术后4w对照组以纤维骨痂为主，成骨细胞增殖。
图6术后6w实验组与对照组HE染色结果照片(HE×100)
左图术后6w实验组部分新骨矿化，血管丰富，
右图术后6w对照组缺损区内有大量的成骨细胞形成，基质丰富。
图7术后8w实验组与对照组HE染色结果照片(HE×100)
左图术后8w实验组骨小梁形成，髓腔狭窄，新骨改建，
右图术后8w对照组仍存部分纤维骨痂，成骨细胞活跃，部分新骨矿化。
图8术后12w实验组与对照组HE染色结果照片(HE×100)
左图术后12w实验组髓腔改建基本完成，
右图术后12w对照组新骨及髓腔改建中。
图9术后4w实验组免疫组化染色观察结果照片(S-P×200)
实验组术后4w III型胶原棕褐色阳性产物表达。
图10术后8w实验组免疫组化染色观察结果照片(S-P×50)
左图实验组术后8wIII型胶原褐色阳性产物表达。
右图对照组术后8w III型胶原阳性表达，较实验组相应时间表达较弱。
图11术后12w实验组免疫组化染色观察结果照片(S-P×50)
左图实验组术后12w I型胶原褐色阳性产物表达。
右图对照组术后12w I型胶原阳性产物表达。
图12纳米羟基磷灰石水化产物的SEM图
图13血小板在包覆的纳米羟基磷灰石表面粘附SEM图示无血小板聚集现象
图14实验组3周、6周组织切片HE染色照片(光镜×100)
左图实验组3周可以见到急慢性炎细胞浸润，无异物巨细胞反应，未见骨坏死。
右图实验组6周可见轻微炎症反应，骨组织未见坏死、基本正常。
具体实施方式
实施例1 人工骨支架制备
材料准备：
纳米羟基磷灰石(纳米HA粉体)的制备，以常规化学沉淀法制备；N，O-羧甲基壳聚糖，购自青岛海汇生物工程有限公司，羧甲基取代度90.5％，脱乙酰度88.6％；对二氯苯，无水乙醇，柠檬酸，均为分析纯。
(1)将纳米羟基磷灰石与羧甲基壳聚糖按质量比为6∶4的比例分别配料，以机械球磨使其充分混合；
(2)再按纳米羟基磷灰石/羧甲基壳聚糖复合粉体与造孔剂对二氯苯按质量比为1∶1的比例称料，研磨混合，然后超声振荡2h，使其充分混匀；
(3)向步骤(2)所述混合料中加入质量百分比为16.7％的柠檬酸溶液并调和均匀，柠檬酸溶液用量以混合料能可塑成形为准；
(4)将成形混合料放入人工骨支架标准模具中，加压成形，保压60s；
(5)脱模，先将成形复合材料在空气中放置4h，再置于无水乙醇中，超声振荡8h，之后于80℃烘干3h，得人工骨支架。
用新三思CMT700型万能材料试验机和排水法分别测定多孔材料的抗压强度和孔隙率，本发明制备的人工骨支架抗压强度达到21.72MPa，孔隙率74.79％，完全符合骨修复支架材料的要求。
实施例2 人工骨支架制备
(1)将纳米羟基磷灰石与羧甲基壳聚糖按质量比为7∶3的比例分别配料，以机械球磨使其充分混合；
(2)再按纳米羟基磷灰石/羧甲基壳聚糖复合粉体与造孔剂对二氯苯按质量比为1∶1.2的比例称料，研磨混合，然后超声振荡2.5h，使其充分混匀；
(3)向步骤(2)所述混合料中加入质量百分比为16.7％的柠檬酸溶液并调和均匀，柠檬酸溶液用量以混合料能可塑成形为准；
(4)将成形混合料放入人工骨支架标准模具中，加压成形，保压80s；
(5)脱模，先将成形复合材料在空气中放置4h，再置于无水乙醇中，超声振荡9h，之后于80℃烘干4h，得人工骨支架。
用新三思CMT700型万能材料试验机和排水法分别测定多孔材料的抗压强度和孔隙率，本发明制备的人工骨支架抗压强度达到21MPa，孔隙率74.9％，符合骨修复支架材料的要求。
实施例3 人工骨支架制备
(1)将纳米羟基磷灰石与羧甲基壳聚糖按质量比为6.5∶3.5的比例分别配料，以机械球磨使其充分混合；
(2)再按纳米羟基磷灰石/羧甲基壳聚糖复合粉体与造孔剂对二氯苯按质量比为1∶1.1的比例称料，研磨混合，然后超声振荡3h，使其充分混匀；
(3)向步骤(2)所述混合料中加入质量百分比为16.7％的柠檬酸溶液并调和均匀，柠檬酸溶液用量以混合料能可塑成形为准；
(4)将成形混合料放入人工骨支架标准模具中，加压成形，保压100s；
(5)脱模，先将成形复合材料在空气中放置5h，再置于无水乙醇中，超声振荡10h，之后于80℃烘干5h，得人工骨支架。
用新三思CMT700型万能材料试验机和排水法分别测定多孔材料的抗压强度和孔隙率，本发明制备的人工骨支架抗压强度达到20.7MPa，孔隙率74％，符合骨修复支架材料的要求。
实施例4 诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化培养
兔骨髓间充质干细胞的分离与培养：
体重1.5±0.3kg新西兰大白兔，无菌条件下抽取其髂骨骨髓3±0.5ml，DME/F-12培养液冲洗，离心1000r×5min，弃上清液，DME/F-12培养液重悬制成单细胞悬液；血球计数板计数，以5×105个/ml密度接种于50ml玻璃细胞培养瓶中，37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，24h～48h后倒置显微镜下观察；0.25％胰酶消化原代细胞3min，以1×105个/ml按1∶2比例传代接种培养；取部分细胞以1×103个/ml接种于24孔培养板中，每天随机取3个孔细胞，血球计数板计数，以细胞数为纵标，天数为横标绘制细胞生长曲线。
取上述生长对数期的兔骨髓间充质干细胞，以配方为地塞米松8-10mol/L、β-甘油磷酸钠0.01mol/L、维生素C0.05g/L、胎牛血清100ml/L的培养液37℃培养2～4天，诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，并以碱性磷酸酶的表达及钙结节形成能力为检测指标，待分化率达65％以上时，收集细胞，备用。
实施例5 pcDNA3.1-VEGF165重组质粒构建
(1)按Trizol试剂说明书的要求提取实施例4的兔骨髓间充质干细胞总RNA；以提取的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下反转录合成VEGF165 cDNA序列。
取所得兔骨髓间充质干细胞总RNA，70℃孵育10min，常规方法行反转录反应，体系体积为20μl，具体操作步骤均按试剂说明书进行。
以紫外分光光度计在260nm波长测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。以ddH2O为空白对照，所得OD260值按下式计算出样品稀释前的浓度：
RNA(mg/ml)＝40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000，各样品OD260/OD280数值均在1.8～2.0之间。
(2)依据GenBank中报告的兔基因VEGF165[AY196796]序列，应用Premier5.0设计引物：
其中：兔基因VEGF165PCR引物序列为：
上游5’-GTGGACATCTTCCA-3’
下游5’-CTTTGGTCTGCATTCACA-3’；；
以VEGF165基因cDNA为模板，行PCR反应扩增兔VEGF165基因；其反应条件为：扩增94℃预变性5min；94℃变性1min，54℃(55℃、56℃、58℃)退火1min，72℃延伸2min，循环35次；72℃延伸10min；
扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察电泳条带并回收；
(3)限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切载体pcDNA3.1和兔VEGF165基因；回收酶切产物并以T4DNA连接酶将载体pcDNA3.1和人VEGF165基因或兔VEGF165基因连接，构建pcDNA3.1-VEGF165重组质粒。
具体方法是：
限制性内切酶EcoRI和Hind III双酶切载体pcDNA3.1：
灭菌Eppendorf管中依次加入：灭菌去离子水14.8μl；10×酶切缓冲液2μl；乙酰化BSA0.2μl；噬菌粒DNA，220μg/ml2μl；轻轻混匀后加入EcoR I，10u/μl0.5μl、Hind III，10u/μl 0.5μl至终体积20μl。
轻轻混匀后，短暂离心，37℃孵育1-4h。
加入4μl 6×上样缓冲液，于0.8％琼脂糖凝胶中电泳，紫外线下观察电泳条带并照像分析。
限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切VEGF165基因：
(I)灭菌Eppendorf管中依次加入：灭菌去离子水9.8μl；10×酶切缓冲液2μl；乙酰化BSA 0.2μl；VEGF165基因6μl。混匀后加入：EcoR I，10u/μl1μl、HindIII，10u/μl1μl至终体积20μl。(II)轻轻混匀，短暂离心，37℃孵育1-4h。(III)加入4μl 6×上样缓冲液，于2％琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察电泳条带，用凝胶成像分析系统分析。
从凝胶中回收酶切产物：
用凝胶回收试剂盒，自凝胶中分别回收双酶切后的pcDNA3.1片段和VEGF165基因，按常规方法进行。
主要步骤：自凝胶中切下DNA片段，称重；加入Buffer QG；50℃孵育10min，直至凝胶完全溶解；检查混合物颜色是否为黄色；将QIAquick离心柱置于一2ml收集管中，将样品加至离心柱，离心1min；丢弃液体，将离心柱放回收集管，加0.5ml BufferQG至离心柱，离心1min；加0.75ml Buffer PE洗柱，静置、离心；丢弃液体，13000r/min，离心；将离心柱置于一干净的离心管，将30μl Buffer EB或灭菌双蒸水加于离心柱中央，静置1min，离心1min。
pcDNA3.1与VEGF165基因的连接：
每个连接体系依次加入：EcoR I和Hind III双酶切回收产物250ng；基因双酶切回收切产物50ng；10×T4 DNA连接酶缓冲液1μl；T4DNA连接酶1μl加灭菌双蒸水至终体积20μl，轻轻混匀后，短暂离心，置4℃冰箱过夜，次日于70℃灭活10min。
大肠杆菌DH5α感受态细菌的制备：
在LB固体培养板上挑取大肠杆菌DH5α单一菌落，接种至10ml LB液体培养基，37℃水浴摇床过夜；次日取5ml接种于100ml预热的上述细菌液体培养基中，37℃水浴摇床，每20min测一次OD600，至OD600为0.35-0.4；迅速将培养物置于冰浴15-30min，不时缓慢摇匀使内容物充分冷却；将细菌转移到冰冷的离心管中，低温离心15min，弃上清，加100ml冰冷的纯水来重悬细胞；4℃，2500r/min离心20min，弃上清，加50ml冰冷的10％甘油来重悬沉淀2次；4℃，2500r/min离心20min，弃上清，加200μl冰冷的GYT培养基来重悬沉淀；将上述悬液稀释100倍后测量其OD600值，用冰冷的GYT培养基调整细胞浓度为2×1010-3×1010个/ml(1.0OD＝2.5×1010个/ml)。分装于EP离心管中，于-80℃贮存备用。
重组载体的扩增及鉴定：
步骤如下：
(a)取200μl感受态细菌与电转杯一起置冰上冷却。
(b)将离心管中待转染DNA20μl(DH5α)，置冰上30-60s。
(c)将感受态细菌与待转染DNA混合加到冰冷的电转杯中，轻击液体以确保细菌与DNA悬液位于电击杯底部。擦干电击杯外的冷凝水和雾气，将其放进电极槽。
(d)调整电转仪至电脉25μF，电压2.5KV，电阻200欧姆，启动对细菌的电脉冲。
(e)脉冲结束后，尽可能快地取出电转杯，室温下加入1ml SOC液体培养基，将细胞转移至灭菌聚乙烯试管，37℃轻柔振荡培养1h。
(f)取不同体积的细菌，铺于含Amp的SB固体培养平板，室温下放置20min后，置于37℃培养12-16h，计数阳性菌落并初步估计库容。
(g)剩余的细菌转种至10ml SB液体培养基，37℃水浴摇床过夜培养，加入10％甘油冻存培养物，备用。
(h)随机挑取SB固体培养板(含适量Amp及Tet)上的阳性菌落，小量扩增后抽提重组载体，用EcoR I和Hind III双酶切进行鉴定(具体反应体系步骤如前所述)，酶切产物于1％琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察电泳条带，用凝胶成像分析系统分析。将克隆的质粒PcDNA3.1-VEGF165交公司测序，应用计算机测序分析。
可见酶切产物为两个条带，分别在5.4kb、230bp左右片段，测序证实其序列与GENEBANK中兔VEGF序列相同。PcDNA3.1-VEGF165基因测序图峰值清晰，无双峰干扰。
质粒的纯化：
质粒的纯化方法及步骤参照说明书执行，最后将EP管中的质粒DNA贮于4℃或-20℃冰箱。
以紫外分光光度计在260nm、280nm波长测定DNA浓度，OD值分别为0.065、0.37，OD260/280＝1.76，符合设计要求。
上述DNA分子量marker(内参照物)及载体和试剂盒均购自以下公司或由以下公司出品：
DL-2000，大连宝生物公司；pcDNA3.1载体，Invitrogen公司；限制性内切酶EcoRI和Hind III大连宝生物公司；T4—DNA连接酶Promega公司；Trizol试剂盒Invitrogen公司生产；反转录试剂盒，PCR核心系统I、II，Wizard PCR preps DNA纯化系统，Wizard Plus Minpreps DNA纯化系统，Promega公司；凝胶回收试剂盒，QIA-quick公司；DAB显色试剂盒，华美生物工程公司。
实施例6 pcDNA3.1-VEGF165重组质粒植入含有骨髓间充质干细胞的人工骨支架孔中或人工骨支架孔中，形成组织工程化骨复合体
重组质粒pcDNA3.1-VEGF165经鉴定后，以生理盐水稀释为1000ng/ml，置于—20℃冰箱备用。
应用时以200±50ng/mm3的量植入含有104-105个/mm3骨髓间充质干细胞的人工骨支架孔中或人工骨支架孔中，形成组织工程化骨复合体，以促进骨缺损快速修复及其局部VEGF165mRNA表达。
或者，以200±50ng/mm3的量植入骨缺损局部，促进骨缺损修复及其局部VEGF165mRNA表达。
实施例7 组织工程化骨复合体作为骨缺损修复材料的应用
pcDNA3.1-VEGF165质粒液，以生理盐水稀释为1000ng/ml，置于—20℃冰箱备用。兔抗人I型胶原单克隆抗体(Rabits anti-Type I Collagen)试剂盒；兔抗人III型胶原单克隆抗体(Rabits anti-Type IIICollagen)试剂盒；通用型S-P试剂盒、DAB试剂盒，均购自北京中山生物技术有限公司。
选用成年纯种健康新西兰大耳白兔28只，体重2.5-3.0kg(由山东省农业科学院提供)。
建立兔桡骨中段15mm长的骨缺损模型：
将实验兔双前肢以脱毛剂脱毛，以水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉，消毒铺巾，于其双前肢桡侧切开皮肤、分离，将桡骨中段15mm的骨质连同骨膜完全切除，缺损区填以同体积明胶海绵，备用。
随机选择一侧骨缺损作为实验组(右侧)，局部注射以生理盐水稀释的pcDNA3.1-VEGF165质粒液0.2ml(200ng)或者在骨缺损局部植入实施例1-3之一所述人工骨支架，再将pcDNA3.1-VEGF165质粒以200±50ng/mm3的量植入人工骨支架孔中，同时再向人工骨支架孔中植入104-105个/mm3的骨髓间充质干细胞，形成组织工程化骨复合体；对侧作为对照组(左侧)，同法注射相同量的生理盐水，止血，逐层缝合，封闭切口，即刻行X线照像(见图1)检查造模情况，肌肉注射应用抗生素，单笼喂养。
术后观察：
术后观察动物的一般情况、局部炎症反应、切口愈合时间；X检查：分别于术后1w、2w、3w、4w、6w、7w、8w、12w行X线照相检查，观察骨缺损处断端及新生血管密度、原缺损段新骨形成及修复情况。
取材：
分别于术后1w、2w、4w、6w、8w、12w各处死动物4只。沿原缝合切口切开达新生骨膜，仔细分离，观察骨缺损区愈合及修复情况，切取桡骨标本以数码相机在相同条件下照相，取中段缺损处修复的组织，将所取标本分为大、小2份，较大一份以10％中性甲醛固定；较小一份放入—80℃冰箱冷藏，备检测基因表达用。
标本处理及染色：
标本经固定、脱钙，梯度脱水，透明、浸蜡，常规方法制备厚度为5μm切片，备用，操作步骤(略)。
苏木素-伊红(H E)染色：常规方法染色、镜检、拍照，操作步骤(略)。
免疫组化染色：采用S-P法染色，按试剂盒要求步骤将原液按1：50稀释，分别行I型胶原、III型胶原免疫组化检测。严格按试剂盒说明书推荐的方法(常规免疫组化)操作。
VEGF在骨缺损局部mRNA表达的检测：
采用RT—PCR法检测VEGF mRNA在骨缺损局部的表达。
Trizol一步法自组织中提取总RNA，按照试剂盒要求的步骤操作，加入Trizol1ml。
分别在引物作用下行逆转录合成VEGF165 cDNA，行PCR反应，取产物行琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察、照相。取术后第2w、4w的两组标本行比较。(具体操作方法同前述相关内容)。
扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察电泳条带并照相，用凝胶成像分析系统定性分析各标本中mRNA表达强弱。
逆转录反应体系：MgCl24μl；5×M-MVL Buffer 4μl；dNTP 4μl；RNas Inhibtor0.5μl；M-MVL酶0.8μl；Random9 mers 1μl；RNas Free dH2O 3.7μl；RNA2μl；总体积20μl。
反应条件：30℃ 10min、42℃ 30min、99℃ 5min、5℃ 5min。
PCR反应体系：MgCl24μl；Buffer 5μl；dNTP 1μl；Taq0.5μl；DDW 33.5μl；上游引物1μl；下游引物1μl；cDNA4μl；总体积50μl。
反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸5min。
结果观察：
术后无明显炎症反应，创面无感染，切口愈合顺利。
X线照片观察术后第八周(见图2)，对照组骨缺损未愈合(左侧)，应用VEGF转染质粒治疗的实验组骨缺损已修复(右侧)。
按时段取材，两组标本外观，自术后2w时实验组与对照组间即显示出明显区别，至6w时实验组骨质外观连续，质地硬韧，而对照组为缺损尚未填满，8w时两组外观相近，但缺损处质地不一。说明VEGF质粒对组织修复确实起到促进作用(见图3)。
HE染色结果：
术后1w缺损区周围有炎细胞浸润、部分肉芽组织形成，间充质细胞大量增生，邻近组织肿胀，两组无明显差别。实验组较对照组新生血管丰富，密度稍大。
术后2w实验组缺损区间充质细胞和纤维母细胞大量增生，新生骨痂开始形成，软骨细胞增殖，其周围少量炎细胞浸润(图4)；对照组缺损区主要为炎细胞浸润、大量成纤维细胞增生及少量间充质细胞浸润，肉芽组织填充。
术后4w时可见缺损区内有大量新生骨痂形成，大量成骨细胞形成，仍有增殖活跃的间充质细胞，表面布满成骨细胞，断端已有新生骨形成(图5左)；对照组断端已有透明软骨细胞为主，成骨细胞少量形成(图5右)。
术后6w时缺损区大部被新生骨取代，部分矿化(图6左)；对照组缺损区内有大量的成骨细胞形成，基质丰富(图6右)。
术后8w时新生骨逐渐成熟，部分髓腔再通，但较狭窄(图7左)；对照组表面布满成骨细胞，已有新生骨形成(图7右)。
术后12w骨缺损完全愈合，皮质骨形成，皮质主要由编织骨组成，部分由新生的骨单位构成，髓腔再通(图8左)；对照组新骨及髓腔改建过程尚未完成(图8右)。
实验组与对照组新生血管数量：
术后1w缺损区周围有炎细胞浸润、部分肉芽组织形成，间充质细胞大量增生，邻近组织肿胀，两组无明显差别。实验组较对照组新生血管丰富，密度稍大。
术后2w实验组缺损区间充质细胞和纤维母细胞大量增生，新生骨痂开始形成，软骨细胞增殖，其周围少量炎细胞浸润(图4)；对照组缺损区主要为炎细胞浸润、大量成纤维细胞增生及少量间充质细胞浸润，肉芽组织填充。
2w时两组新生血管密度均较1w时增加，经t检验，两组间差别存在显著统计学意义(表1)，实验组新生血管数量、密度较对照组大，血管密度的增加与组织修复有直接的促进作用。
表1 基因转染后两组间微血管密度(MVD)比较
*t＝2.4519，P＝0.0179 **t＝8.0347，P＝0.0000
免疫组化染色观察结果：
应用Nikon双目显微镜观察所有染色切片，细胞浆或ECM染为棕黄或棕褐色颗粒者为阳性标志；I型胶原及III型胶原阳性表达定位于ECM中，采集图像并分析。
实验组III型胶原于术后4w即有大量阳性表达(图9)，持续至8w(图10)，至12w时相对减弱；对照组阳性表达与实验组趋势一致，时间也相应滞后(图10)。
实验组I型胶原于术后第2w表达呈弱阳性，随时间延长而逐渐增强，至12w时呈强阳性表达(图11)；对照组表达趋势一致，但与实验组比较，时间较晚(图11)。
VEGF在骨缺损的mRNA表达：
采用Trizol试剂盒抽提标本组织中总RNA，根据设计的引物合成VEGF165cDNA，经扩增后在2％琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察电泳条带并照相，用凝胶成像分析系统分析。发现产物在200bp左右有特异性条带，与所设计片段大小一致。其表达程度不一，实验组术后1w VEGF即有表达，随时间延长表达增强，2w达高峰，3w较2w时下降，之后呈下降趋势，至第6w后达到稳定水平。
术后第2w、4w，对照组VEGF mRNA表达量较实验组少，但其第2w表达量较第4w量大。
实施例8 参照GB/T16886.5-1997-ISO 10993-51992标准检测纳米羟基磷灰石—羧甲基壳聚糖体外细胞培养及活体应用的生物相容性及生物安全性。
试验研究证实，纳米羟基磷灰石水化物的结晶完整性提高，晶体之间的相互接触点增多，彼此之间的连接增强(图12)，力学强度明显提高。羧甲基壳聚糖是壳聚糖分子羧甲基化得到的一种适于医用的水溶性产物，且更有利于与其它物质的结合，在体内可以完全降解。纳米羟基磷灰石与羧甲基壳聚糖均具有良好的生物相容性。
对本发明所述人工骨支架包括动物组织相容性、抗凝血性能、分子生物学研究、骨传导性等试验证实均未发现明显异常反应(图13、图14)。
Claims (4)
1.一种组织工程化骨复合体，其特征是：所述骨复合体由呈多孔状且孔径间贯通的人工骨支架及植入孔中的转染有血管内皮细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞组成；其中，所述人工骨支架由质量比为6～7∶4～3的纳米羟基磷灰石与羧甲基壳聚糖制成，其孔隙率为65％～75％，孔径尺寸2微米～600微米，以圆形为主；所述骨髓间充质干细胞是人骨髓间充质干细胞ATCC NO.CRL-2496或兔骨髓间充质干细胞；所述血管内皮细胞生长因子基因是人基因VEGF165或兔基因VEGF165。
2.如权利要求1所述组织工程化骨复合体，其特征是：所述人工骨支架由质量比为3：2的纳米羟基磷灰石与羧甲基壳聚糖制成，其孔隙率为70％～75％，孔径尺寸200微米～450微米；所述骨髓间充质干细胞是兔骨髓间充质干细胞；所述血管内皮细胞生长因子基因是兔基因VEGF165。
3.如权利要求1或2所述组织工程化骨复合体，其特征是：所述兔骨髓间充质干细胞由下述方法分离与培养：
体重1.5±0.3kg新西兰大白兔，无菌条件下抽取其髂骨骨髓3±0.5ml，DME/F-12培养液冲洗，离心1000r×5min，弃上清液，DME/F-12培养液重悬制成单细胞悬液；血球计数板计数，以5×105个/ml密度接种于50ml玻璃细胞培养瓶中，37℃、5％ CO2恒温培养箱中培养，24h～48h后倒置显微镜下观察；0.25％胰酶消化原代细胞3min，以1×105个/ml按1:2比例传代接种培养；取部分细胞以1×103个/ml接种于24孔培养板中，每天随机取3个孔细胞，血球计数板计数，以细胞数为纵标，天数为横标绘制细胞生长曲线。
4.权利要求1或2所述组织工程化骨复合体作为骨缺损修复材料的应用。
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